Dissecting lineage priming in mouse embryonic stem cells

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Embryonic stem (ES) cells derived from the epiblast of mouse blastocysts are characterized by the ability to self-renew and to give rise to all embryonic lineages (a feature known as pluripotency). Therefore, mouse ES cells represent a unique tool to understand how transcription factor networks are modified during embryogenesis. Several knowledge has been accumulated concerning the gene regulatory networks and their transcriptional dynamics during pluripotency and lineage commitment. However, the understanding, at the single cell level, of how pluripotent transcriptional networks are dismantled, while lineage-affiliated genes networks emerge during lineage commitment of ES cells is still scarce. The general aim of this study was to investigate single cell gene expression during neural commitment of pluripotent (Oct4, Sox2, Nanog), stochastic (Car2, Cldn6) and lineage-affiliated genes (Cdh2, Sox3, Crabp2, Fgf5, Dnmt3b, T). For that, I cultured mouse ES cells in conditions that allowed neural differentiation and performed single molecule RNA FISH analysis from cells collected at different time points of the differentiation protocol. Here, I confirm that the highest expression of pluripotency genes occurs when mouse ES cells are cultured in pluripotent conditions. I also show that the pluripotency network is dismantled when cells enter neural lineage differentiation, due to decreased expression of Oct4 and Nanog. In the first days of neural differentiation, neural genes start to be upregulated but their transcription is mainly bursty, similar to genes that are stochastically expressed in the first days of differentiation. Moreover, postimplantation epiblast markers (Fgf5 and Dnmt3b) were found upregulated at day 3, when Nanog is also transiently upregulated, suggesting that a first transition from pluripotent mouse ES cells to a primed state similar to mouse epiblast stem cells occurs during early neural commitment. Later in neural differentiation, neural genes start to be expressed in a constitutive pattern and no expression of stochastic genes is observed, suggesting a second transition to irreversible neural commitment with formation of neural progenitors. Overall, this work reveals molecular transitions and formation of intermediate subpopulations with specific gene signatures when mES cells are driven to neural fate.As células estaminais embrionárias de ratinho representam hoje em dia uma ferramenta extremamente últil para o estudo do desenvolvimento embrionário, uma vez que são capazes de se multiplicarem indefinidamente e são pluripotentes, isto é, são capazes de dar origem a todas as células das linhagens embrionárias. Estas células foram descritas como sendo semelhantes às células do epiblasto que compõem o blastocisto, antes da implantação uterina, por volta do dia embrionário (E) 4.5. Durante a implantação ocorrem várias mudanças morfológicas e de expressão genética no blastocisto e, por volta do dia E6.5, ocorre a gastrulação, processo onde as células do epiblasto pós-implantatório originam percursores das três linhagens embrionárias: mesoderme, endoderme e neuroectoderme. A manutenção da capacidade de auto-renovação e pluripotência das células estaminais embrionárias é regulada principalmente por três fatores de transcrição: NANOG, OCT4 e SOX2. Estes fatores compõem o centro de uma vasta rede interativa de factores reguladores da pluripotência. Inicialmente, as células estaminais embrionárias eram vistas como uma população clonal de células com uma expressão genética homogénea destes fatores. No entanto, vários estudos vieram contrariar esta ideia demonstrando a sua expressão heterogénea nas células estaminais embrionária, bem como o impacto funcional desta heterogeneidade. Por exemplo, no caso de Nanog, as células estaminais que apresentam baixos níveis de NANOG têm tendência para expressar genes associados a linhagens embrionárias e, assim, estão mais propensas à diferenciação. Este processo, denominado de “lineage priming”, carateriza-se pela expressão esporádica e reversível de genes envolvidos na diferenciação em células pluripotentes e é considerado indispensável para a capacidade pluripotente das células estaminais, uma vez que confere plasticidade e competência para se diferenciarem. Ultimamente, vários laboratórios têm-se dedicado a desvendar os possíveis mecanismos que desencadeiam esta heterogeneidade na expressão génica, sendo que flutuações estocásticas a nível da transcrição tem sido apontada como a principal causa. Um gene pode ser constitutivamente expresso, estando o seu promotor continuamente ativo ou o promotor pode alternar entre um estado ativo e inativo que desencadeia variações no número de trancritos desse gene ao longo do tempo. Esta alternância está presente nas células estaminais embrionárias, desencadeando variabilidade individual entre células que permite a distinção de subpopulações com diferentes níveis de susceptibiliadde para se diferenciarem. Aquando da gastrulação, ocorre a formação do nó primitivo na parte posterior do embrião. A partir do nó primitivo, surge a linha primitiva de onde surgem os percursores da mesoderme e endoderme. Na parte anterior do embrião forma-se a placa neural anterior que dará origem à maior parte das células que compõem o sistema nervoso central. Quanto à formação da placa neural posterior, que originará parte do sistema nervoso central, existem dois modelos que tentam responder a essa questão: o primeiro proposto por Niewkoop, em 1952, defende que a placa neural posterior deriva da regionalização de uma parte da placa neural anterior por sinalizadores de “posteriorização”. Recentemente, outro modelo propõe a existência de uma população de progenitores neuromesodermais (PNMs) bipotentes na parte posterior do embrião, independente da placa neural anterior, que contribui para a formação da espinal medula, bem como da mesoderme paraxial, e, por isso, é caraterizada pela coexpressão de: T, marcador mesoendodermal e Sox2, marcador de células neuroprogenitoras. Devido à difícil acessibilidade para estudar a gastrulação em embriões de ratinho, o desenvolvimento de protocolos de diferenciação in vitro têm sido cruciais para o estudo do surgimento das várias linhagens durante o desenvolvimento embrionário. Um desses protocolos consiste na diferenciação neural de células estaminais embrionárias aderentes em monocamada originando progenitores neuroepiteliais que se organizam em forma de rosetas, semelhante ao que acontece aquando da formação do tubo neural in vivo. A análise global da expressão genética ao longo deste protocolo já foi efetuada, permintindo a identificação de diferentes estadios que ocorrem quando as células estaminais embrionárias são direcionadas para a diferenciação neural. No entanto, é necessário um conhecimento mais detalhado da expressão genética a nível de células individuais. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi a análise da dinâmica transcricional de um conjunto de genes em células estaminais embrionárias individuais sujeitas a diferenciação neural. Os genes analisados pertencem a três classes distintas: genes pluripotentes (Oct4, Nanog e Sox2); genes associados a linhagens embrionárias, nomeadamente, genes neurais (Cdh2, Sox3 e Crabp2), genes expressos no epiblasto pós-implantatório (Fgf5 e Dnmt3b) e gene associado ao desenvolvimento mesoendodermal e marcador de PNM’s (T) e genes estocásticos (Car2 e Cldn6), isto é, genes sem uma função direta no desenvolvimento embrionário, mas com maior expressão em células com baixos níveis de NANOG comparando com os níveis em células com altos níveis de NANOG, em condições de pluripotência. Para tal, 3 linhas de células estaminais embrionárias foram, inicialmente, mantidas em condições de pluripotência (BMP4 LIF) e, posteriormente, transferidas para um meio que promove a diferenciação neural, RHB-A. Em diferentes dias do protocolo de diferenciação, algumas células foram recolhidas e fixadas para single molecule RNA FISH (smFISH), um método que permite a quantificação de transcritos de um dado gene em células individuais. Assim, foi possível observar, no estado de pluripotência, a existência de duas subpopulações: uma com elevada expressão de transcritos dos 3 fatores de transcrição de pluripotência, e outra com níveis intermédios de transcritos de Oct4 e baixos níveis de transcritos de Nanog e Sox2 . Quando as células são direcionadas para a linhagem neural, ocorre a desestruturação da rede de fatores de transcrição reguladores da pluripotência devido à diminuição da transcrição de Oct4 e Nanog. No entanto, ao dia 3 do protocolo de diferenciação neural, 10% das células ainda expressam níveis elevados de transcritos de Nanog e Oct4, representando uma população de células ainda pluripotentes. O número de transcritos de Sox2 por célula sofre apenas um ligeiro decréscimo, mantendo-se significativamente expresso durante a diferenciação neural, o que confirma a importância deste gene quer na manutenção da pluripotência, quer no desenvolvimento neural. Quanto à expressão de genes estocáticos (Car2 e Cldn6) ao longo do protocolo de diferenciação neural, esta é estocástica, havendo uma maior frequência de células que expressam altos níveis de transcritos destes genes ao dia 1; no entanto, ao dia 6 do protocolo de diferenciação, a frequência de células que expressam altos níveis destes genes é praticamente nula, sugerindo que a transcrição destes genes é restrita aos primeiros dias de diferenciação. No estado de pluripotência, as células com maior expressão de Car2 e Cldn6 apresentam simultaneamente níveis baixos de transcritos de Nanog, sugerindo um estado de “priming” nestas células pluripotentes. Foi ainda possível verificar que, ao dia 1 da diferenciação neural, ao contrário dos dias 0 e 3, a elevada expressão destes genes era independente, o que sugere uma janela temporal onde as células são mais permissivas a explorar o genoma, resultado da configuração “aberta” da cromatina e do decréscimo da expressão dos factores de transcrição que regulam a pluripotência. A análise da expressão dos genes neurais em células individuais revelou que, nos primeiros dias de diferenciação, Cdh2 e Sox3 apresentam uma transcrição estocástica. No entanto, em dias mais avançados do protocolo é possível extrapolar que a transcrição destes genes é feita de uma forma constitutiva. Esta mudança no padrão de expressão de Cdh2 e Sox3 sugere que a expressão estocástica destes genes nos primeiros dias de diferenciação é um potencial mecanismo de “priming”, que ocorre antes das células se compromoterem para a linhagem neural. Estas observações confimam a hipótese que o compromisso irreversível para uma dada linhagem é dependente de dois eventos consecutivos: a) ativação da transcrição de genes associados a uma dada linhagem e b) expressão desses genes acima de um dado nível. Quanto ao estudo da expressão em células individuais de marcadores de epiblasto pós-implantatório, Fgf5 e Dnmt3b, é possível constatar um aumento na frequência de células que expressam altos níveis de transcritos destes genes, do dia 1 para o dia 3 do protocolo de diferenciação neural. Este aumento está associado à reexpressão transiente de Nanog ao dia 3, sugerindo o aparecimento de uma população de células com expressão genética semelhante a células do epiblasto pós-implantatório. Em conjunto, estes resultados sugerem que os primeiros dias de diferenciação neural são caracterizados pela desintegração da rede de fatores reguladores da pluripotência, bem como por um contínuo aumento da expressão de genes neurais e transiente expressão de genes estocásticos e característicos do epiblasto pós-implantatório. Este estadio precede o estadio em que as células estão irreversivelmente comprometidas para a diferenciação neural. Por fim, quando avaliando a existência de PNM’s, pela co-expressão de Sox2 e T, o número de células com altos níveis de transcritos destes dois genes foi muito baixo, devido à transcrição residual de T. Esta observação pode dever-se ao facto de o meio neural RHB-A ser bastante selectivo, inibindo a sobrevivência de células que expressam genes de linhagens não-neurais. Além disso, este meio, leva à diferenciação de células com características de tecidos neurais anteriores, o que dificulta o surgimento de células com expressão semelhante aos PNM’s

Eddy current angular position sensor for automotive

Programa doutoral em Líderes para Indústrias TecnológicasOs sensores angulares usados em aplicações automóveis, requerem uma boa resolução, fiabilidade, baixa manutenção, baixo custo de produção e capacidade de trabalhar sob condições adversas. Devido a estes requisitos, os sensores mais utilizados são os magnéticos, indutivos e magneto-indutivos. Outro fator crítico é a dimensão do sensor, quanto mais reduzido e compacto, maior é o número de aplicações em que pode ser aplicado. No caso dos sensores magneto-indutivos e indutivos, uma forma de reduzir o seu tamanho é através do uso de a bobines planares impressas em placas de circuito impresso (PCB). Estas, para além de mais compactas, conseguem também reduzir os custos de produção, otimizar a repetibilidade e assemblagem, e permitir que o seu desenho seja facilmente adaptado às suas aplicações. No desenvolvimento de sensores indutivos, obter a indutância das bobinas, que funcionam como elemento transdutor, é essencial e desafiador no caso de bobinas planas. Atualmente, há duas abordagens no estado da arte: fórmulas de aproximação (para geometrias regulares), e simulações de modelos de elementos finitos (FEM). As simulações são demoradas e recorrem a ferramentas de software dispendiosas e que exigem muitos recursos computacionais. Esta tese tem como objetivo desenvolver uma ferramenta de cálculo analítico para obter a indutância de bobinas planas genéricas, reduzindo o tempo de desenvolvimento. A ferramenta possibilita ainda o cálculo da interferência que um alvo planar condutivo tem na indutância da bobine, tornando assim possível obter a resposta de um sensor indutivo baseado em eddy currents durante a sua fase de desenvolvimento. Esta tese, além de detalhar o desenvolvimento da ferramenta mencionada, também descreve todos os processos de validação implementados, através de simulações FEM e testes experimentais. A metodologia proposta foi aplicada com sucesso no desenvolvimento de um sensor de posição angular automotivo baseado em eddy currrents. Foi possível comprovar que a precisão da ferramenta desenvolvida está de acordo com as metodologias usualmente utilizadas, com a vantagem de ser mais rápida e económica.Angular sensors used in automotive applications require good precision, reliability, low maintenance, low production costs and the ability to work in harsh conditions. Due to these requirements, magnetic, inductive and magneto-inductive sensors are preferred and are used in current generations of automotive angular position sensors. The size of the sensors is another relevant factor in the development of new solutions. The smaller and more compact, the larger the number of applications in which they can be applied. In the case of magneto-inductive and inductive sensors, one way to reduce their size is to use planar coils printed on printed circuit boards (PCBs). These, in addition to occupy a smaller volume when compared to solenoids, also reduce production costs and optimize repeatability and simplify assembly. When developing inductive sensors, knowing the required inductance value of its coils is essential and this task can be challenging in the case of planar coils. Currently, two approaches are used to calculate the inductances of planar coils. When the coils have regular geometry approximation formulas are used, configuring some parameters. When they have irregular geometry or a more accurate result is desired, simulations using finite element methods (FEM) are chosen. These simulations have the disadvantage of being time-consuming, requiring expensive software applications and a huge computing resources. In view of the budget and the reduction of development time, this thesis provides an analytical calculation tool for the inductance of generic multi-layer planar coils. In this way, it is possible to develop dedicated applications in reduced time. The tool also allows to calculate the interference that a planar conductive target, of arbitrary geometry, can have on the coil inductance. Thus, it is possible to obtain the response of an inductive sensor based on eddy currents during its development phase. This thesis, in addition to detailing the development of the aforementioned tool, also describes all the validation processes implemented using FEM simulations and experimental tests. The proposed methodology was successfully applied in the development of an automotive angular position sensor based on eddy currents. It was possible to prove that the precision of the developed analytical tool is in concordance with the methodologies usually used, with the advantage of being faster and open source.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - bolsa de doutoramento PD/BD/128142/201

Orchestrating mitochondria in neurons: Cytoskeleton as the conductor

© 2019 The Authors. Cytoskeleton published by Wiley Periodicals, Inc. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.Mitochondria are crucial to support synaptic activity, particularly through ATP production and Ca2+ homeostasis. This implies that mitochondria need to be well distributed throughout the different neuronal sub-compartments. To achieve this, a tight and precise regulation of several neuronal cytoskeleton players is necessary to transport and dock mitochondria. As post-mitotic cells, neurons are highly dependent on mitochondrial quality control mechanisms and several cytoskeleton proteins have been implicated in mitophagy. Therefore, all of these processes are orchestrated by the crosstalk between mitochondria and the neuronal cytoskeleton to form a coordinated and tuned symphony.The authors are supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia, Grant references for CCRPD/BD/135521/2018, AFP PD/BD/114113/2015, VAM IF/01693/2014, Funding reference: UID/BIM/50005/2019, project funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) through Fundos do Orçamento de Estado; by European Research Council, grant ERC-StG-679168; and European Molecular Biology Organization, grant EMBO-IG/3309.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

O abandono do princípio do custo histórico a favor do conceito de justo valor

Mestrado em Contabilidade - AuditoriaCom as recentes evoluções no mundo contabilístico e a aplicação de um novo sistema de normalização contabilística em Portugal, têm surgido várias mudanças. A globalização da economia tem influenciado os sistemas contabilísticos nacionais, em virtude da necessidade de adaptação destes às normas internacionais de contabilidade, como forma de garantir uma maior coerência e comparabilidade da informação a nível internacional. Com a introdução destas normas o justo valor ganha importância na valorização de certos activos específicos, em detrimento da valorização pelo custo histórico. ABSTRACT: Due to the last developments in the accounting’s world and the implementation of a new accounting system in Portugal, there are been several changes. The economy’s globalization has influenced the national accounting systems, due to their need to adapt to the international accounting standards, as a way to ensure greater consistency and comparability of information at international level. With the introduction of these standards, the fair value accounting gains relevance in the register of certain specific assets, rather than the valuation by historical cost. Currently there is a significant controversy over the use of the fair value due to the divergent opinions on its concept and measurement

Solução para sensores de posição angular imunes a campos magnéticos externos

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Eletrónica Industrial e ComputadoresCom o aumento da utilização automóvel e da preocupação do impacto ambiental que estes causam, surgiu a necessidade de criar veículos mais ecológicos, encontrando-se neste momento a produção de carros híbridos e elétricos em expansão. Durante o desenvolvimento de carros elétricos, novos problemas surgem, assim como a necessidade de os resolver. Devido ao aumento da quantidade de cabos elétricos neste tipo de automóveis, novos campos magnéticos são gerados, causando novas interferências nos SPA (Sensor Posição Angular) magnéticos. Esta dissertação tem como objetivo estudar e implementar uma solução para um sensor de posição angular magnético, que seja imune a campos magnéticos externos de 3.2mT. Atualmente, este tipo de sensores não pode ser aplicado diretamente em carros elétricos, devido às dimensões dos campos magnéticos gerados pelos diferentes cabos, que excedem a perturbação mínima suportada por estes. A resolução deste problema tem bastante importância para a indústria automóvel, não só para a aplicação direta destes sensores em carros elétricos, mas também pelo facto de serem magnéticos e de não apresentarem, por isso, desgastes como os mecânicos, sendo uma vantagem notória a sua aplicação em mais partes do veículo. Nesta dissertação, de forma a resolver este problema, simulam-se e verificam- se várias possíveis soluções, com o recurso a ferramentas como o ANSYS e o Rhinoceros. Foram considerados parâmetros como a permeabilidade magnética e novas arquiteturas, usando princípios diferenciais e campos magnéticos gerados por bobines de Helmholtz. De momento já existem duas implementações que tornam os SPA magnéticos imunes a campos magnéticos externos. Uma delas incide na blindagem da região de interesse com um material de maior permeabilidade, sendo este responsável por atenuar os campos parasitas; a outra tem como base o princípio diferencial, onde o próprio sensor magnético anula os campos magnéticos externos homogéneos. Ambas as soluções são estudadas, sendo a primeira testada ao nível da simulação magnética, de forma a verificar a viabilidade da aplicação no caso em estudo.Nowadays, the main focus on the population’s mind is the environment, and how reduce the impact on it. Because of this and the electronic evolution, the number of sales of electric vehicles is increasing daily. Every day new ideas arise and new problems need to be solved. One of the topics targeted on research is the angular position sensors, based on magnetic effects. These kind of sensors present advantages, being the more profitable, the non mechanical wear, result of non contact between sensor’s parts. This characteristic makes them favourites when compared with other types of sensors. They can be applied in different parts of the vehicles, like pedals, to measure the pressure angle, and steering wheels, to measure the direction angle. On fuel vehicles magnetic angular sensors work seamless, but on electric vehicles this doesn’t happen, because the number and amplitude of magnetic fields increase substantially, induced by the higher number of electric cables. The electromagnetic interference is, in this case, superior than these type of sensor can handle, so they can’t be applied directly, on electric cars. The resolution of this problem has a huge importance to the automotive industry, since it can increase the range of applications. This sensor would be able to be applied in a larger range of measures, so the costs of the production’s vehicle would decrease, because they would have just one sensor doing the job of many. This dissertation has as main goal the study and development of a solution to the problem described. In order to do that, several simulations must be performed and different possible solution checked, using tools like ANSYS and Rhinoceros, managing parameters like magnetic permeability and methods like Helmholtz coil and differential principle

Inventário do património arquitectónico da cidade do Funchal: as torres "avista-navios"

Esta dissertação tem como objecto de investigação as Torres de Habitação existentes na cidade do Funchal. O objectivo é proceder à inventariação destes elementos do património arquitectónico da Madeira - as Torres “Avista-navios”. Pretende-se com este inventário contribuir para documentar uma parte do património arquitectónico madeirense e desta forma promover a salvaguarda da sua identidade. Uma vez que esta iniciativa ainda não foi realizada para as Torres Habitacionais da madeira, a dissertação pretende constituir uma mais-valia na preservação e análise do património edificado madeirense. Uma vez identificado, analisado e documentado o património arquitectónico das Torres de Habitação, pretende-se dar a conhecer ao público em geral estes elementos arquitectónicos regionais que caracterizam a cidade do Funchal

Atividades de Segurança Alimentar desenvolvidas numa Empresa de distribuição alimentar: Verificação de fichas técnicas e identificação de perigos

Para o controlo eficaz dos alimentos é necessário conhecer os perigos a que estes estão sujeitos. Assim, quando detetados previamente podem ser evitadas doenças de origem alimentar. A rotulagem de géneros alimentícios é a principal ferramenta de comunicação entre a indústria e os consumidores, permitindo não só fornecer informações acerca dos produtos como também ajudar na garantia da sua segurança. Neste sentido, foi publicado o Regulamento (UE) n.º 1169/2011 relativo à informação aos consumidores sobre géneros alimentícios. Foi neste contexto que se desenvolveu o presente trabalho, com dois objetivos principais: levantamento das não conformidades associadas à rotulagem de determinados géneros alimentícios face às novas exigências do Regulamento (UE) N.º 1169/2011 e a identificação de perigos alimentares considerando todos os potenciais elos da cadeia até ao consumidor final que podem introduzir perigos para a segurança alimentar, de forma a definir medidas para controlar esses mesmos perigos. Para o levantamento das não conformidades foram analisados rótulos de 482 produtos, todos eles pré-embalados, distribuídos pelos setores da padaria e pastelaria, produtos de pesca, legumes e verduras, pré-cozinhados, frutas e polpas de frutas e bacalhau. Os parâmetros avaliados foram: tamanho da letra, modo de indicação dos alergénios, origem específica vegetal dos óleos e gorduras, condições especiais de conservação, condições de conservação e prazo de consumo após abertura e declaração nutricional. Estes produtos analisados são distribuídos pela Empresa onde foi realizado o estudo. Os resultados obtidos permitem indicar, quantitativa e qualitativamente, as alterações que ainda são necessárias, e demonstraram que 59,54% dos rótulos necessitam de modificação. O prazo de consumo após abertura, a data de congelação e a declaração nutricional foram os critérios com maior prevalência de não conformidades. Verificou-se que existem rótulos em todos os grupos de alimentos que não cumprem todas as disposições exigidas, à exceção dos produtos do setor de bacalhau. A identificação de perigos foi realizada para três produtos cárneos: presunto fatiado, fiambre e chouriço. Foi possível identificar de uma forma geral os perigos associados às matérias-primas, etapas de processamento e ao produto final, demostrando assim que todos os intervenientes na cadeia alimentar têm de assegurar a segurança no produto na etapa onde intervêm. Concluiu-se ainda, que o consumidor tem a possibilidade de controlar determinados perigos desde a compra dos produtos até ao seu consumo, sendo necessário, no entanto, melhorar a rotulagem para evitar a utilização imprópria

Impact of harvest by humans on mussel populations around Easter

The current macroeconomic scenario has subjected Portuguese coastal areas to greater human pressure caused by the ever-increasing shellfish harvest. Every year on Holy Friday, hundreds of people make their way to coastal areas and frantically capture hundreds of bags worth of mussels in a short amount of time. It causes not just inevitable and profound changes to the intertidal zone, but also slows down its recovery. In 2010 Cascais Municipality (CM) was made aware of this problem and in 2011 and 2012 released a general awareness campaign entitled “In Easter who pays is the mussel”. More than just providing a legal perspective, the goal was to test the impact of said campaign in Meixilhoeiro’s mussel beds. Biological data sampling in “Mexilhoeiro” was conducted over a three-year period, from 2010 to 2012. In 2010 there was no awareness campaign but sampling was done after Holy Friday. In 2011 and 2012 it was done both after and before Holy Friday. The average length and coverage percentage of individuals in rocks were recorded. The subsequent graphical analysis indicated that the average coverage percentage of mussels had been decreasing over the years. However a positive sign was recorded in after the 2012 awareness campaign, when the average length of individuals showed an increase. This could mean a reduction in harvesting during Holy Friday. Results suggest that awareness campaigns are effective measures in the immediate protection of marine resources, when supported by reinforcement in surveillance from fisheries protection authorities. For such improvements to persist, so must those efforts. Beachgoers in the summertime can have a detrimental impact on mussel bed size. Prohibiting recreational fishing will not suffice