Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Embryonic stem (ES) cells derived from the epiblast of mouse blastocysts are characterized by the ability to self-renew and to give rise to all embryonic lineages (a feature known as pluripotency). Therefore, mouse ES cells represent a unique tool to understand how transcription factor networks are modified during embryogenesis. Several knowledge has been accumulated concerning the gene regulatory networks and their transcriptional dynamics during pluripotency and lineage commitment. However, the understanding, at the single cell level, of how pluripotent transcriptional networks are dismantled, while lineage-affiliated genes networks emerge during lineage commitment of ES cells is still scarce. The general aim of this study was to investigate single cell gene expression during neural commitment of pluripotent (Oct4, Sox2, Nanog), stochastic (Car2, Cldn6) and lineage-affiliated genes (Cdh2, Sox3, Crabp2, Fgf5, Dnmt3b, T). For that, I cultured mouse ES cells in conditions that allowed neural differentiation and performed single molecule RNA FISH analysis from cells collected at different time points of the differentiation protocol. Here, I confirm that the highest expression of pluripotency genes occurs when mouse ES cells are cultured in pluripotent conditions. I also show that the pluripotency network is dismantled when cells enter neural lineage differentiation, due to decreased expression of Oct4 and Nanog. In the first days of neural differentiation, neural genes start to be upregulated but their transcription is mainly bursty, similar to genes that are stochastically expressed in the first days of differentiation. Moreover, postimplantation epiblast markers (Fgf5 and Dnmt3b) were found upregulated at day 3, when Nanog is also transiently upregulated, suggesting that a first transition from pluripotent mouse ES cells to a primed state similar to mouse epiblast stem cells occurs during early neural commitment. Later in neural differentiation, neural genes start to be expressed in a constitutive pattern and no expression of stochastic genes is observed, suggesting a second transition to irreversible neural commitment with formation of neural progenitors. Overall, this work reveals molecular transitions and formation of intermediate subpopulations with specific gene signatures when mES cells are driven to neural fate.As células estaminais embrionárias de ratinho representam hoje em dia uma ferramenta extremamente últil para o estudo do desenvolvimento embrionário, uma vez que são capazes de se multiplicarem indefinidamente e são pluripotentes, isto é, são capazes de dar origem a todas as células das linhagens embrionárias. Estas células foram descritas como sendo semelhantes às células do epiblasto que compõem o blastocisto, antes da implantação uterina, por volta do dia embrionário (E) 4.5. Durante a implantação ocorrem várias mudanças morfológicas e de expressão genética no blastocisto e, por volta do dia E6.5, ocorre a gastrulação, processo onde as células do epiblasto pós-implantatório originam percursores das três linhagens embrionárias: mesoderme, endoderme e neuroectoderme. A manutenção da capacidade de auto-renovação e pluripotência das células estaminais embrionárias é regulada principalmente por três fatores de transcrição: NANOG, OCT4 e SOX2. Estes fatores compõem o centro de uma vasta rede interativa de factores reguladores da pluripotência. Inicialmente, as células estaminais embrionárias eram vistas como uma população clonal de células com uma expressão genética homogénea destes fatores. No entanto, vários estudos vieram contrariar esta ideia demonstrando a sua expressão heterogénea nas células estaminais embrionária, bem como o impacto funcional desta heterogeneidade. Por exemplo, no caso de Nanog, as células estaminais que apresentam baixos níveis de NANOG têm tendência para expressar genes associados a linhagens embrionárias e, assim, estão mais propensas à diferenciação. Este processo, denominado de “lineage priming”, carateriza-se pela expressão esporádica e reversível de genes envolvidos na diferenciação em células pluripotentes e é considerado indispensável para a capacidade pluripotente das células estaminais, uma vez que confere plasticidade e competência para se diferenciarem. Ultimamente, vários laboratórios têm-se dedicado a desvendar os possíveis mecanismos que desencadeiam esta heterogeneidade na expressão génica, sendo que flutuações estocásticas a nível da transcrição tem sido apontada como a principal causa. Um gene pode ser constitutivamente expresso, estando o seu promotor continuamente ativo ou o promotor pode alternar entre um estado ativo e inativo que desencadeia variações no número de trancritos desse gene ao longo do tempo. Esta alternância está presente nas células estaminais embrionárias, desencadeando variabilidade individual entre células que permite a distinção de subpopulações com diferentes níveis de susceptibiliadde para se diferenciarem. Aquando da gastrulação, ocorre a formação do nó primitivo na parte posterior do embrião. A partir do nó primitivo, surge a linha primitiva de onde surgem os percursores da mesoderme e endoderme. Na parte anterior do embrião forma-se a placa neural anterior que dará origem à maior parte das células que compõem o sistema nervoso central. Quanto à formação da placa neural posterior, que originará parte do sistema nervoso central, existem dois modelos que tentam responder a essa questão: o primeiro proposto por Niewkoop, em 1952, defende que a placa neural posterior deriva da regionalização de uma parte da placa neural anterior por sinalizadores de “posteriorização”. Recentemente, outro modelo propõe a existência de uma população de progenitores neuromesodermais (PNMs) bipotentes na parte posterior do embrião, independente da placa neural anterior, que contribui para a formação da espinal medula, bem como da mesoderme paraxial, e, por isso, é caraterizada pela coexpressão de: T, marcador mesoendodermal e Sox2, marcador de células neuroprogenitoras. Devido à difícil acessibilidade para estudar a gastrulação em embriões de ratinho, o desenvolvimento de protocolos de diferenciação in vitro têm sido cruciais para o estudo do surgimento das várias linhagens durante o desenvolvimento embrionário. Um desses protocolos consiste na diferenciação neural de células estaminais embrionárias aderentes em monocamada originando progenitores neuroepiteliais que se organizam em forma de rosetas, semelhante ao que acontece aquando da formação do tubo neural in vivo. A análise global da expressão genética ao longo deste protocolo já foi efetuada, permintindo a identificação de diferentes estadios que ocorrem quando as células estaminais embrionárias são direcionadas para a diferenciação neural. No entanto, é necessário um conhecimento mais detalhado da expressão genética a nível de células individuais. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi a análise da dinâmica transcricional de um conjunto de genes em células estaminais embrionárias individuais sujeitas a diferenciação neural. Os genes analisados pertencem a três classes distintas: genes pluripotentes (Oct4, Nanog e Sox2); genes associados a linhagens embrionárias, nomeadamente, genes neurais (Cdh2, Sox3 e Crabp2), genes expressos no epiblasto pós-implantatório (Fgf5 e Dnmt3b) e gene associado ao desenvolvimento mesoendodermal e marcador de PNM’s (T) e genes estocásticos (Car2 e Cldn6), isto é, genes sem uma função direta no desenvolvimento embrionário, mas com maior expressão em células com baixos níveis de NANOG comparando com os níveis em células com altos níveis de NANOG, em condições de pluripotência. Para tal, 3 linhas de células estaminais embrionárias foram, inicialmente, mantidas em condições de pluripotência (BMP4 LIF) e, posteriormente, transferidas para um meio que promove a diferenciação neural, RHB-A. Em diferentes dias do protocolo de diferenciação, algumas células foram recolhidas e fixadas para single molecule RNA FISH (smFISH), um método que permite a quantificação de transcritos de um dado gene em células individuais. Assim, foi possível observar, no estado de pluripotência, a existência de duas subpopulações: uma com elevada expressão de transcritos dos 3 fatores de transcrição de pluripotência, e outra com níveis intermédios de transcritos de Oct4 e baixos níveis de transcritos de Nanog e Sox2 . Quando as células são direcionadas para a linhagem neural, ocorre a desestruturação da rede de fatores de transcrição reguladores da pluripotência devido à diminuição da transcrição de Oct4 e Nanog. No entanto, ao dia 3 do protocolo de diferenciação neural, 10% das células ainda expressam níveis elevados de transcritos de Nanog e Oct4, representando uma população de células ainda pluripotentes. O número de transcritos de Sox2 por célula sofre apenas um ligeiro decréscimo, mantendo-se significativamente expresso durante a diferenciação neural, o que confirma a importância deste gene quer na manutenção da pluripotência, quer no desenvolvimento neural. Quanto à expressão de genes estocáticos (Car2 e Cldn6) ao longo do protocolo de diferenciação neural, esta é estocástica, havendo uma maior frequência de células que expressam altos níveis de transcritos destes genes ao dia 1; no entanto, ao dia 6 do protocolo de diferenciação, a frequência de células que expressam altos níveis destes genes é praticamente nula, sugerindo que a transcrição destes genes é restrita aos primeiros dias de diferenciação. No estado de pluripotência, as células com maior expressão de Car2 e Cldn6 apresentam simultaneamente níveis baixos de transcritos de Nanog, sugerindo um estado de “priming” nestas células pluripotentes. Foi ainda possível verificar que, ao dia 1 da diferenciação neural, ao contrário dos dias 0 e 3, a elevada expressão destes genes era independente, o que sugere uma janela temporal onde as células são mais permissivas a explorar o genoma, resultado da configuração “aberta” da cromatina e do decréscimo da expressão dos factores de transcrição que regulam a pluripotência. A análise da expressão dos genes neurais em células individuais revelou que, nos primeiros dias de diferenciação, Cdh2 e Sox3 apresentam uma transcrição estocástica. No entanto, em dias mais avançados do protocolo é possível extrapolar que a transcrição destes genes é feita de uma forma constitutiva. Esta mudança no padrão de expressão de Cdh2 e Sox3 sugere que a expressão estocástica destes genes nos primeiros dias de diferenciação é um potencial mecanismo de “priming”, que ocorre antes das células se compromoterem para a linhagem neural. Estas observações confimam a hipótese que o compromisso irreversível para uma dada linhagem é dependente de dois eventos consecutivos: a) ativação da transcrição de genes associados a uma dada linhagem e b) expressão desses genes acima de um dado nível. Quanto ao estudo da expressão em células individuais de marcadores de epiblasto pós-implantatório, Fgf5 e Dnmt3b, é possível constatar um aumento na frequência de células que expressam altos níveis de transcritos destes genes, do dia 1 para o dia 3 do protocolo de diferenciação neural. Este aumento está associado à reexpressão transiente de Nanog ao dia 3, sugerindo o aparecimento de uma população de células com expressão genética semelhante a células do epiblasto pós-implantatório. Em conjunto, estes resultados sugerem que os primeiros dias de diferenciação neural são caracterizados pela desintegração da rede de fatores reguladores da pluripotência, bem como por um contínuo aumento da expressão de genes neurais e transiente expressão de genes estocásticos e característicos do epiblasto pós-implantatório. Este estadio precede o estadio em que as células estão irreversivelmente comprometidas para a diferenciação neural. Por fim, quando avaliando a existência de PNM’s, pela co-expressão de Sox2 e T, o número de células com altos níveis de transcritos destes dois genes foi muito baixo, devido à transcrição residual de T. Esta observação pode dever-se ao facto de o meio neural RHB-A ser bastante selectivo, inibindo a sobrevivência de células que expressam genes de linhagens não-neurais. Além disso, este meio, leva à diferenciação de células com características de tecidos neurais anteriores, o que dificulta o surgimento de células com expressão semelhante aos PNM’s
