Studies on the isolation of a specific ribonucleic acid (I) : Gradient elution chromatography of silkworm silkgland RNA on a methylated fibroin column

A linear gradient elution chromatography of RNA of the posterior silkgland of mature silkworm larvae was conducted on a methylated fibroin-celite column, in attempts at reviving the specific interaction in vivo between fibroin and a template RNA and also utilizing it to a unique method of isolating the protein-specific RNA. RNA was shown thereby to be well fractionated into 3 or 4 components at a low ionic strength and in a mild pH range of ca. 4.8 to 8.6, with a 100 % recovery. However, contrary to authors\u27 reasoning, no substantial difference could have been detected in respect of the elution pattern between RNAs obtained from the normal worm and from the mutant worm incapable of synthesizing fibroin. Consequently, use of intact fibroin itself besides the methylated one was suggested as a more specific chromatographic interaction reagent. It is now under study with a partial success.高分子リボ核酸(RNA)のクロマトグラブ分別剤としては現在セルローズの塩基性誘導体及びDowex樹脂等が広く用いられているが,それ等は温和な条件下においては回収率がかなり低い欠点がある.ピストンやメチル化アルブミンを用いる方法は,その点では一段とすぐれた方法ではあるが,これ等も亦任意の蛋白質分子中の塩基性基を利用するだけの非特異的な方法であつて,ヌクレオチド配列の多様性によるRNA分子の高度のheterogeneityから考えると,その分別能にはおのずから限界がある.著者等は,家蚕後部絹糸腺内における絹フィブロインの生合成機作,特に特徴的なアミノ酸組成及び配列を有するフィブロインに対応する特異的なRNA―広い意味で鋳型とも云える―を追求しつつあるが,如上の考察の結果から,フィブロイン生合成の場である後部絹糸腺RNAのクロマトグラフ的分劃,特にフィブロインに対応する特異的RNAの分離の目的には,これを鋳型として合成されると一応仮定されるフィブロインそれ自体を交換或は吸着剤として用いる事が,生物学的見地からも原理的に最も妥当ではないかと思惟した.しかもフィブロインは従来のヒストンやアルブミンとは異つて,かなり単純なアミノ酸組成及び配列を有する線状蛋白質であると云う点においても興味深く,又純粋に多量に得やすいと言う利点に恵まれている.一方,著者等は当学農学部蚕学教室の御厚意に依り,そこで系統を保存されている\u22セリシソ繭家蚕\u22をフィブロイン合成能に対するコントロールとして使用する機会を得た.この遺伝子突然変異種(通称Nd-II)は,後部糸腺に於ける変異のために正常のフィプロンの合成分泌能を喪失し,その代りに非繊維性の正体不明の蛋白を合成する.斯くて著者等は,RNAへのイオン的親和性をます為にメチル化したフィブロインカラムを用いて,正常蚕及びNd蚕の後部絹糸腺RNAのクロマトグラフを行なつた

Studies on the isolation of a specific ribonucleic acid (II) : Chromatographic interaction between silkgland RNA and a fibroin powder column

While studying a mechanism of fibroin biosynthesis in the posterior silkgland of the silkworm larvae, an odd chromatographic interaction was observed between the silkgland RNA and a fibroin powder column. 1) A clear difference was found in respect of the elution pattern between RNAs prepared by a phenol method from the posterior gland of t h e normal larvae and of the genetic mutant incapable of synthesizing fibroin . 2) The difference disappeared when RNAs were chromatographed on a column of the methylated derivative instead of fibroin. 3) No marked difference could have been detected between the two RNAs with respect to the phosphorus-atomic absorption coefficient, ultracentrifugal behaviour and nucleotide composition. 4) RNA molecule of a higher mole cular weight and/or of a higher guanylic acid content is retained more firmly to fibroin. 5) K^+ ion is preferable to Na^+ ion in sharpening the chromatogram, and 10^-3 M Mg^++ ion dissociates the fibroin - RNA complex completely. In view of these results, it was suspected that a specific biological interaction in vivo between fibroin and a template RNA(s) in the field of the protein biosynthesis is revived at least in part in this mild gradient elution chromatography of the silkgland RNA on a fibroin powder column. It may thus provide in principle a unique method of isolating a proteinspecific RNA molecule (s), based on a molecular-biological specificity of its own.蛋白質の生合成とリボ核酸(RNA)との関係については多数の人々により種々様々の実験成績が蓄積され,その結果現在では特定のRNA分子におけるヌクレオチド単位の配列順序がそれを鋳型として合成される蛋白質のアミノ酸配列を規定するものと推論されている.しかしそれを直接的に示す実験結果は未だに得られていない.このような特異性を持つRNA.分子を全RNA分子の中から分劃精製しようとする場合,ヌクレオチド単位配列の高度のvariabilityによる全分子の理化学的polydispersityを考えると,むしろ対応する蚕自質分子との間のin vivoにおける特異的相互作用一鋳型RNAの上に素材アミノ酸が配列重合し,または次段階においてそれが解離放出される際の一をin vitroにおいて可及的に復元させ,利用することが原理的にもつとも忠実な,かつ選択的な方法と考えられないであろうか.それはその蛋白質の化学構造に関して遺伝的にmodificationを受けている突然変異種があり,さらにその蛋白質が生物にとつて量,質的に高度に特徴的な表現型である場合には,とくに有力な手段となるであろう.かかる観点に立つて,特徴的なアミノ酸組成および配列(100g蛋白質中のアミノ酸組成はグリシン42.8g,アラニン32.4g,セリン14.7g,チロシン11.8g… で,就中グリシンが1個おきに配列する)を持つ家蚕絹フィブロインに対応する一広義の鋳型一特異的RNAの分劃検索を行なつている著者らは,その特殊化された合成分泌器官である後部絹糸腺よりとり出されたRNAがフィブロイン粉末カラムに対して興味あるクロマトグラフ挙動をとることを観察した.結果の一部は予報済みである

A ribonuclease from UV-induced mutant of Rhizopus niveus

Rhizopus RNase was purified 1000-fold from Glutase with a yield of 2.3 %. It was most active between pH 5 and 5.5. The enzyme appeared not homogeneous in the analytical gel filtration through Sephadex G-100. The enzyme was free from DNase and PDase. Nucleotidases were found, which were inhibited by arsenate. The hydrolytic specificity of the enzyme action was examined by characterization of the digest of yeast RNA. The enzyme produces four kinds of 2’, 3’-cyclic nucleotides, which are slowly hydrolyzed to the corresponding mononucleotides. The cyclic PDase activities showed a preference for cyclic purine nucleotides, and the action for cyclic pyrimidine nucleotides seemed to be slower than that of RNase I. The Rhizopus RNase is useful for preparation of cyclic nucleotides. Further purification is needed for the additional characterization of the enzyme