NanoSOSG: A Nanostructured Fluorescent Probe for the Detection of Intracellular Singlet Oxygen

A biocompatible fluorescent nanoprobe for singlet oxygen (1O2) detection in biological systems was designed, synthesized, and characterized, that circumvents many of the limitations of the molecular probe Singlet Oxygen Sensor Green® (SOSG). This widely used commercial singlet oxygen probe was covalently linked to a polyacrylamide nanoparticle core using different architectures to optimize the response to 1O2. In contrast to its molecular counterpart, the optimum SOSG-based nanoprobe, which we call NanoSOSG, is readily internalized by E. coli cells and does not interact with bovine serum albumin. Furthermore, the spectral characteristics do not change inside cells, and the probe responds to intracellularly generated 1O2 with an increase in fluorescence

Effective Photodynamic Inactivation of 26 Escherichia coli Strains with Different Antibiotic Susceptibility Profiles: A Planktonic and Biofilm Study

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a growing problem and alternative therapies are being sought to effectively address this issue. The aim of this study is to assess a range of Escherichia coli strains’ susceptibility to Methylene Blue-mediated antimicrobial photodynamic therapy and determine if this is affected by their antibiotic-resistance profile. Two reference and twenty-four uropathogenic clinical E. coli strains were used in this study. All were tested in vitro for antimicrobial susceptibility against sixteen antibiotics. Strains underwent photodynamic treatments using the photosensitizer Methylene Blue with red light and tested in both planktonic and biofilm state. It was found that reference strain ATCC 25922 was susceptible to all tested antibiotics whereas reference strain ATCC 35218 showed resistance only to Ampicillin. With the exception of strains number 16 and 22, all of the isolated strains were multidrug-resistant according to the criteria established by the European Centre for Disease Prevention and Control and the Centre for Disease Control and Prevention, where acquired non-susceptibility to at least one agent in three or more antimicrobial categories is outlined. Photodynamic therapy induced more than 3 log10 colony-forming units’ reduction to all strains in planktonic state. Whereas when tested in biofilm state, two and a half times the original dose of methylene blue was necessary to cause a 3 log10 antimicrobial effect. There were statistically significant differences in susceptibility among the strains tested in both the planktonic and biofilm experiments. Nevertheless, antimicrobial photodynamic therapy could inactivate all multidrug-resistant strains in the planktonic and biofilm state

Tratamientos fotodinámicos aplicados a Listeria monocytogenes, Salmonella enterica y a cepas de Escherichia coli multirresistentes a los antibióticos

En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la teràpia fotodinàmica antimicrobiana com a mètode alternatiu d'eliminació de bacteris, amb un possible ús final sobre superfícies i materials, així com per a un potencial ús terapèutic. L'ús de la teràpia fotodinàmica antimicrobiana presenta nombrosos avantatges, com ara el de no generar resistències, gracies al seu dany massiu i multifocalitzat i a la capacitat de dirigir el seu efecte a l'àrea desitjada, tot just il·luminant l’àrea amb una llum no perjudicial, d’intensitat i longitud d’ona adequada. En aquesta tesi, s’ha investigat l'ús de la teràpia fotodinàmica antimicrobiana per tal d’eliminar espècies bacterianes potencialment patògenes: Salmonella enterica, Listeria monocytogenes i Escherichia coli; en aquest últim cas, s'ha estudiat també la seva eficàcia envers diferents soques, amb diferents patrons de resistència als antibiòtics, creixent en suspensió o formant biopel·lícules. Així mateix, s’han buscat sinergies entre la teràpia fotodinàmica i el tractament amb un antibiòtic: l’àcid nalidixic. Els resultats van ser els següents: S’ha aconseguit calcular les dosis mínimes inhibidores del fotosensibilitzador (blau de metilè) que eliminava més de 108 UFC/mL, en cultius tant de gram positiu (Listeria monocytogenes), com en gram negatiu (Escherichia coli), però va caldre un canvi de fotosensibilitzador cap a un derivatitzat del anterior (nou blau de metilè), més eficient per tal d'aconseguir dosis bactericides sobre Salmonella enterica. En els estudis amb Escherichia coli, s'ha comprovat l'eficàcia de la teràpia fotodinàmica per tal d’eliminar soques multiresistents als antibiòtics, creixent tant en suspensió com en biopel·lícula. Com era d'esperar per la seva naturalesa, les soques creixent en biofilm necessiten una major concentració de fotosensibilitzador per assolir les dosis bactericides i es pot observar una variabilitat en la resposta al tractament més gran que en els cultius planctònics. Finalment, per a algunes de les soques d'E. coli, combinacions amb diferents concentracions d'àcid nalidíxic i blau metilè van ser estudiats per trobar una possible sinergia entre ells, però només es va detectar aquest efecte en una de les soques multiresistents d'Escherichia coli, mentre que a la resta de soques estudiades, es va mantenir un efecte additiu. Com a conclusió, podem dir que en els estudis es descriuen en aquesta tesi, resta demostrat que la teràpia fotodinàmica antimicrobiana és una metodologia eficaç per a l'eliminació d'un ampli espectre de microorganismes, d’una manera ràpida i segura, fins i tot amb soques molt resistents als tractaments antibacterians convencionals, o creixent en estructures de resistència que causen greus problemes en créixer en superfícies, com les biopel·lícules. Com a dades afegides, s’ha demostrat l'existència de diferències en la resposta al tractament entre els diferents tipus de bacteris, sent el gram positiu més sensibles al tractament. S’han detectat diferències en la resposta al tractament entre espècies diferents i fins i tot entre diferents soques de la mateixa espècie, possiblement a causa de les diferències a l'estructura cel·lular o degudes a la presència de mecanismes com bombes de eflux, que limitarien l'eficàcia de la teràpia. Finalment, sembla que la composició i estructura del biofilm també exerceix un paper modulador a la resposta a la teràpia fotodinàmica.  En la presente tesis doctoral se ha estudiado la terapia fotodinámica antimicrobiana como método de eliminación alternativo de bacterias, orientado a un posible uso sobre superficies o materiales, así como para un uso terapéutico. El uso de la terapia fotodinámica antimicrobiana presenta diversas ventajas, como son la no generación de resistencias por su daño masivo multifocalizado y la capacidad de dirigir su efecto a la zona deseada mediante la iluminación con una luz inocua de la longitud e intensidad adecuada. En esta tesis se ha buscado utilizar terapia fotodinámica antimicrobiana para intentar eliminar especies bacterianas potencialmente patógenas: Salmonella enterica, Listeria monocytogenes y Escherichia coli; en este último caso, se ha estudiado también su efectividad en diferentes cepas con diferentes patrones de resistencia a antibióticos, creciendo en suspensión o formando biopelículas. Así mismo, se han buscado sinergias entre el tratamiento fotodinámico y el tratamiento con un antibiótico, el ácido nalidíxico. Los resultados han sido los siguientes: Se consiguieron calcular las dosis mínimas inhibitorias de fotosensibilizador (azul de metileno) que eliminaba por completo cultivos bacterianos de más de 108 UFC/mL tanto en un gram positivo (Listeria monocytogenes) como en un gram negativo (Escherichia coli), pero hizo falta cambiar el fotosensibilizador a un derivado (nuevo azul de metileno) más eficiente para alcanzar dosis bactericidas sobre Salmonella enterica. En estudios con Escherichia coli, se comprobó la eficiencia de la terapia fotodinámica para la eliminación de las cepas multiresistentes a antibióticos, tanto en crecimiento planctónico como en biopelícula. Como era de esperar por su naturaleza de estructura de resiliencia, las cepas creciendo en biopelícula precisaron de una mayor concentración de fotosensibilizador para alcanzar la dosis bactericida y con más variabilidad que sobre cultivos planctónicos. Finalmente, para algunas de las cepas de E. coli, se estudiaron combinaciones con diferentes concentraciones de azul de metileno y ácido nalidíxico para buscar un posible efecto sinérgico entre ellos, pero sólo se detectó tal efecto en una de las cepas multiresistentes de Escherichia coli, manteniéndose el efecto aditivo en las demás cepas estudiadas. Como conclusión, podemos afirmar que en los estudios que se describen en esta tesis, queda demostrado que la terapia fotodinámica antimicrobiana es una metodología efectiva para la eliminación de un amplio espectro de microorganismos, de forma rápida y segura, incluso con cepas muy resistentes a tratamientos antibacterianos convencionales o formando estructuras de resistencia que causan grandes problemas al crecer en superficies, como las biopelículas. Como información añadida, se ha comprobado la existencia de diferencias en la respuesta al tratamiento entre los diferentes tipos bacterianos, siendo las gram positivas más sensibles al tratamiento. Se han evidenciado diferencias en la respuesta al tratamiento entre diferentes especies, e incluso entre diferentes cepas de la misma especie, posiblemente debido a diferencias en la estructura celular o presencia de mecanismos como bombas de eflujo, que limita la efectividad del tratamiento. Por último, parece ser que la composición/estructuración de la biopelícula también ejerce un papel modulador en la respuesta al tratamiento fotodinámico.In this doctoral thesis, antimicrobial photodynamic therapy as a method of disposal alternative of bacteria has been studied, looking for its use on surfaces and materials, as well as for therapeutic use in patients. The use of antimicrobial photodynamic therapy, presents several advantages, such as not generating resistance, thanks to its multifolocalizated massive damage and the ability to direct its effect to just the area illuminated with a light with a safe wavelength and intensity. This thesis has used antimicrobial photodynamic therapy in order to eliminate pathogenic bacterial species: Salmonella enterica, Listeria monocytogenes and Escherichia coli; in the latter case, has been also studied the treatment effectiveness in different strains with different patterns of antibiotic resistance, with cells in suspension as well as forming biofilms. Likewise, synergies between photodynamic therapy and a treatment with nalidixic acid, an antibiotic, have been researched. The results were as follows: Managed to calculate the minimum inhibitory doses of photosensitizer (methylene blue) which completely eliminated more than 108 cfu/mL bacterial cultures both in a gram positive (Listeria monocytogenes) as in a negative gram (Escherichia coli); but it was needed a change of photosensitizer to a derivated one (new methylene blue), more efficient to achieve bactericidal doses of Salmonella enterica. In studies with Escherichia coli, it was proved the efficiency of photodynamic therapy for the elimination of antibiotic multiresistant strains, both in biofilm and planktonic growth. As it was expected by its nature of structure of resilience, strains growing in biofilm needed a higher concentration of photosensitizer to achieve bactericidal doses and the efficiency rates had more variability than on planktonic cultures. Finally, for some of the strains of E. coli, combinations with different concentrations of blue methylene and nalidixic acid were studied in order to find a possible synergy between them, but only in one of the tested multiresistant strains of Escherichia coli was synergy found, remaining an additive effect in the other strains studied. As a conclusion, we can say that in the studies described in this thesis, it is shown that antimicrobial photodynamic therapy is an effective methodology for the elimination of a wide spectrum of microorganisms quickly and safely, even if they are very resistant to conventional antibacterial treatments or are forming resistance structures that usually cause big problems when growing on surfaces, as can be in biofilms. As additional information, it has been proven the existence of differences in the response to treatment between different bacterial types, being the gram positive more sensitive to treatment. Likewise, differences in response to treatment between different species, and even between different strains of the same species, have shown in the experiments; those can be due to differences in cell structure or presence of mechanisms like efflux pumps, so limiting the effectiveness of the therapy. And as a final point, it would seem that the composition/structure of the biofilm also exerts a modulatory role in the response to photodynamic therapy

Cationic phthalocyanine dendrimers as potential antimicrobial photosensitisers

International audienc