Genetic baculovirus determinants for pathogenicity, virulence and transmission

Esta tesis se centra en la caracterización biológica del baculovirus de Spodoptera exigua para mejorar nuestro conocimiento sobre el papel de la diversidad genotípica y sobre la implicación de genes individuales en patogenicidad, virulencia y transmisión. Avances en la tecnología de secuenciación de ADN y los más bajos costes de la misma han facilitado la identificación de genes virales que pueden jugar un papel importante en el proceso de infectividad del SeMNPV. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis profundizan nuestro conocimiento en la diversidad genética y genotípica de SeMNPV, y de los baculovirus en general, y puede ayudar en el futuro a la mejora de las estrategias de control biológico basadas en baculovirus.This thesis focuses on the biological characterization of the baculovirus Spodoptera exigua MNPV to gain insight specifically in the role of genotypic diversity and of individual viral genes in pathogenicity, virulence and transmission. Rapid improvements in DNA sequencing technologies and reduced costs have facilitated the identification of virus genes that may play an important role in the SeMNPV infectivity process. In conclusion, the results presented in this thesis furthered our knowledge of genetic and genotypic diversity of SeMNPV, and baculoviruses more general, and may aid the improvement of baculovirus-based biological control strategies in the future.The research described in this thesis has been financially supported by the Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España, (AGL2008-05456-C03-01).Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología (RD 1393/2007)Bioteknologiako Doktoretza Programa Ofiziala (ED 1393/2007

Genomic support for speciation and specificity of baculoviruses

Keywords: baculovirus, insects, speciation, genomics, phylogeny, host specificity The Baculoviridae comprise a large family of double-stranded DNA viruses infecting arthropods. In this thesis two baculoviruses, Leucoma salicis nucleopolyhedrovirus (LesaNPV) and Agrotis segetum (Agse) NPV, were characterized in detail. Both viruses are potential biocontrol agents of the insects from which they were isolated. A close genetic relationship between LesaNPV and Orgyia pseudotsugata multiple NPV (OpMNPV) was found. O. pseudotsugata is known from North America and contains two baculoviruses, OpSNPV and OpMNPV. L. salicis is a European insect species that was accidentally introduced in the beginning of the 20th century into North America. Results from the current study suggest that LesaNPV was imported along with L. salicis into North America, where it infected O. pseudotsugata and adapted to this new host in coexistence with OpSNPV. As such, this case provides a snapshot of baculovirus evolution through speciation. The genome sequence of AgseNPV showed a striking co-linearity with Spodoptera exigua (Se) MNPV, although these viruses vary in biological properties such as host specificity. AgseNPV can infect S. exigua orally, but SeMNPV is not infectious for A. segetum larvae. SeMNPV causes a systemic infection in A.segetum only when the midgut barrier is bypassed through injection of the virus into the hemocoel. SeMNPV was able to enter A. segetum midgut epithelial cells and to transcribe its early genes, but was unable to replicate and produce progeny virus in these cells. The AgseNPV / SeMNPV case provides an excellent model to study baculovirus specificity by analyzing the changes in the genome sequence that lead to the differences in host range. The collected data support the view that molecular characterization is essential for proper virus classification and for assessing the phylogenetic relationships with other viruses. <br/

Proteases as Insecticidal Agents

Proteases from a variety of sources (viruses, bacteria, fungi, plants, and insects) have toxicity towards insects. Some of these insecticidal proteases evolved as venom components, herbivore resistance factors, or microbial pathogenicity factors, while other proteases play roles in insect development or digestion, but exert an insecticidal effect when over-expressed from genetically engineered plants or microbial pathogens. Many of these proteases are cysteine proteases, although insect-toxic metalloproteases and serine proteases have also been examined. The sites of protease toxic activity range from the insect midgut to the hemocoel (body cavity) to the cuticle. This review discusses these insecticidal proteases along with their evaluation and use as potential pesticides

Genome sequence of Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus: insights into the evolution of a nucleotide metabolism enzyme in the family Baculoviridae

Citation: Ardisson-Araujo, D. M. P., Lima, R. N., Melo, F. L., Clem, R. J., Huang, N., Bao, S. N., . . . Ribeiro, B. M. (2016). Genome sequence of Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus: insights into the evolution of a nucleotide metabolism enzyme in the family Baculoviridae. Scientific Reports, 6, 14. doi:10.1038/srep24612The genome of a novel group II alphabaculovirus, Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus (PeluSNPV), was sequenced and shown to contain 132,831 bp with 145 putative ORFs (open reading frames) of at least 50 amino acids. An interesting feature of this novel genome was the presence of a putative nucleotide metabolism enzyme-encoding gene (pelu112). The pelu112 gene was predicted to encode a fusion of thymidylate kinase (tmk) and dUTP diphosphatase (dut). Phylogenetic analysis indicated that baculoviruses have independently acquired tmk and dut several times during their evolution. Two homologs of the tmk-dut fusion gene were separately introduced into the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) genome, which lacks tmk and dut. The recombinant baculoviruses produced viral DNA, virus progeny, and some viral proteins earlier during in vitro infection and the yields of viral occlusion bodies were increased 2.5-fold when compared to the parental virus. Interestingly, both enzymes appear to retain their active sites, based on separate modeling using previously solved crystal structures. We suggest that the retention of these tmk-dut fusion genes by certain baculoviruses could be related to accelerating virus replication and to protecting the virus genome from deleterious mutation

Getting on host’s nerves: Baculovirus-associated changes in the neuronal system of Spodoptera exigua

La família Baculoviridae constitueix un grup divers de virus entomopatogens amb un genoma d’ADN de doble cadena circular. Generalment, els baculovirus infecten en estadis larvaris dels ordres Lepidoptera, Hymenoptera i Diptera. Dins dels baculovirus, els nucleopoliedrovirus són els més comuns, tenint els seus virions oclosos dins d’una estructura proteica anomenada cos d’inclusió (OB) amb forma de poliedre. Els baculovirus tenen dues classes de virions, els virions oclosos dins dels OBs, que s’anomenen occlusion-derived viruses (ODVs); i els virions no oclosos que es coneixen com budded viruses (BVs). El cicle d’infecció pel baculovirus comença quan les larves ingerixen els OBs després d’alimentar-se de superfícies contaminades pel virus. Quan les larves ingerixen els OBs, l’alta alcalinitat dels sucs intestinals de l’insecte, produïx la hidròlisi de l’estructura proteica dels OBs, alliberant els ODVs al lumen del intestí. Els ODVs són els causants de la infecció primària, infectant les cèl·lules columnars de l’intestí larvari. Llavors, els BVs comencen a ser produïts i s’estenen a través del cos de l’insecte, infectant i replicant en molts teixits diferents, en el que es coneix com la infecció secundària. Com a conseqüència d’esta infecció sistèmica, el baculovirus produïx canvis de comportament en el seu hoste que promouen la dispersió vírica en el camp, en un clar exemple d’avantatge evolutiu. Un d’estos fenotips de comportament ben coneguts és l’augment de l’activitat de locomoció (enhanced locomotor activity, ELA) que fa que les larves esdevinguen més actives, augmentant els seus desplaçaments horitzontals, que alhora amplien la dispersió vírica al camp. En algunes espècies de lepidòpters, com ara Bombyx mori, este augment de la locomoció ha estat relacionada amb l’acció del gen ptp, present al genoma del baculovirus i que codifica per a la proteïna tirosina fosfatasa. Tot i que els mecanismes moleculars a través dels quals este gen produïx este fenotip encara no estan clars. El tree-top disease és un altre dels fenotips de comportament induïts pels baculovirus que empeny les larves a escalar a posicions apicals en les plantes quan estan prop de morir a causa de la infecció. Allí liqüen i moren. Com a conseqüència, el virus augmenta les seues possibilitats de dispersió amb ajuda dels elements naturals com ara l’aigua o l’aire. Inicialment, este fenotip ha estat vinculat a l’acció del gen egt present al genoma del baculovirus, com s’ha vist al baculovirus de Lymantria dispar. El gen egt codifica per a una UDP-glucosiltransferasa que catalitza la conjugació de l’hormona ecdisteroide amb sucres, esdevenint inactiva i evitant o retardant la inducció de la muda o la pupació de les larves. Per tant, les larves de lepidòpters amb estes hormones inactivades, continuen alimentant-se i creixent, augmentant la seua vida mitja i esdevenint més grans al moment de la seua mort. Com a conseqüència, la progènie vírica lliurada al medi ambient és molt major. No obstant això, l’acció d’egt i el tree-top disease necessiten de més investigació per tal de revelar el mecanisme molecular que els connectaria entre sí. Estos dos gens que han estat relacionats amb estos fenotips específics van ser adquirits ancestralment en el genoma del baculovirus procedent dels seus hostes. A més, l’existència d’estos fenotips induïts pel paràsit també pot implicar canvis d’expressió en els gens de l’hoste que jugarien un paper clau en el control de patrons fisiològics o de comportament. Tenint en compte això, plantegem la hipòtesi que estos ja descrits fenotips conductuals i d’altres que podrien ser descoberts, podrien estar relacionats amb canvis en els sistemes neurals dels hostes. Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) (Hübner, 1808) també és conegut com el cuc soldat i constituïx una plaga polífaga distribuïda a tot el món, especialment en zones càlides i temperades. Les etapes larvàries de S. exigua s’alimenten de més de 200 espècies de cultius i plantes ornamentals, amb enormes conseqüències econòmiques i agronòmiques. S’han utilitzat diferents estratègies per al control de S. exigua al camp sobre tot emprant pesticides químics, així com diferents agents de control biològic, com ara bactèries, fongs, nematodes o virus, com els baculovirus. La majoria dels baculovirus tenen un rang d’hostes estret, i això representa un avantatge per al seu ús com insecticides en el camp. Això, juntament amb la seva gran virulència i el seu baix impacte mediambiental, els convertix en excel·lents alternatives al control químic. Els baculovirus són el producte víric més utilitzat en el control de plagues de lepidòpters. Tenint en compte tot açò, el propòsit principal d’esta tesi doctoral és estudiar la influència del Spodoptera exigua nucleopoliedrovirus múltiple (SeMNPV) en els sistemes neuronals de S. exigua. El sistema nerviós de l’insecte està compost pel sistema nerviós central i el sistema nerviós perifèric. Tots dos participen en el control de la fisiologia i el comportament de l’insecte, encara que també en la comunicació de l’insecte amb el seu entorn circumdant. La nostra hipòtesi està recolzada pel fet que la presència i la replicació dels baculovirus en els òrgans neuronals, com el cervell o les antenes, ja s’ha observat. Dins del sistema nerviós central, hem centrat els nostres esforços en l’estudi del sistema neuropeptidèrgic, format per neuropèptids que regulen la fisiologia interna de l’insecte i formen part del sistema de comunicació química entre les diferents cèl·lules de l’organisme. Els neuropèptids són xicotetes proteïnes lliurades per les neurones i cèl·lules neurosecretores que actuen com neuromoduladors, neurotransmissors i neurohormones. Els neuropèptids insecticides són sintetitzats principalment en les cèl·lules neurosecretores del protocerebrum de l’insecte. Desprès s’emmagatzemen en òrgans neurohemals i s’alliberen a través d’axons que s’estenen i penetren la barrera de sang a l’hemolimfa. Els neuropèptids deriven de precursors proteics anomenats prepropèptids que s’escindixen i després es modifiquen post-transcripcionalment. El resultat és el pèptid actiu que serà alliberat i enllaçat a receptors específics. Els neuropèptids també poden ser alliberats per glàndules endocrines situades en el tracte intestinal i en altres llocs perifèrics. Generalment es classifiquen segons la seua funció principal i el receptors que activen normalment són receptors acoblats a proteïnes G (GPCRs). Els neuropèptids regulen aspectes fisiològics molt diferents com ara: la alimentació i el desenvolupament, la reproducció, el moviment muscular, l’homeòstasi, la memòria i els ritmes circadians. Encara que la majoria d’ells són considerats pleiotròpics, es a dir, intervenen en més d’una funció biològica. Dins del sistema nerviós perifèric, ens hem centrat en els gens relacionats amb la quimiorecepció. La quimiorecepció és el procés de detecció d’estímuls químics externs. És molt important en la biologia dels insectes, ja que la informació proporcionada pels senyals químics influïx en comportaments fonamentals com ara l’aparellament, la cerca d’aliments, la ponència d’ous o la fugida de parasitoids o depredadors. La quimiorecepció inclou dues branques principals: l’olfacció i el gust. Diferents famílies de gens participen en l’olfacció i el gust com: receptors d’odorants (ORs), receptors ionotròpics (IRs), receptors gustatius (GRs), proteïnes d’unió a odorants (OBPs) o proteïnes quimiosensorials (CSPs). Cadascun d’estos repertoris gènics tenen funcions concretes en el sistema de quimiorecepció d’insectes, i permeten que la informació proporcionada per molècules químiques s’integre i es combine en el cervell. El cervell de l’insecte llavors emet respostes de comportament concretes segons el canviant entorn químic. Dins dels gens relacionats amb la quimiorecepció, ens hem centrat principalment en els receptors d’odorants, que són la peça central de l’olfacció de l’insecte. Els receptors d’odorants s’expressen a la membrana de les neurones olfactives receptores que estan situades dins de les sensilla distribuïdes al llarg de la cutícula de l’insecte, principalment a les parts bucals i a les antenes. Per tal d’analitzar la influència de SeMNPV en tots dos sistemes, hem seguit un protocol comú. En primer lloc, hem descrit els repertoris gènics dels neuropèptids i els gens quimiosensorials de S. exigua. Això, ha estat possible gràcies a la realització d’estudis d’ARN-Seq realitzats amb mostres de caps de S. exigua infectats i no infectats, però també, utilitzant enfocaments transcripcionals com la RT-qPCR. Després, hem estudiat canvis associats a SeMNPV en l’expressió d’estos repertoris gènics. Finalment, hem seleccionat candidats gènics per a la seua caracterització funcional i així intentar entendre el seu paper en la interacció hoste-patogen i les conseqüències de la seua regulació després de la infecció per baculovirus. Al primer capítol de la tesi, anotem el neuropeptidoma de S. exigua. La identificació i la descripció dels neuropèptids ajuda a entendre millor la regulació de la fisiologia dels insectes i la seua adaptació als diferents entorns, però també proporciona nous objectius per al desenvolupament d’estratègies avançades de control de plagues d’insectes. La primera descripció del neuropeptidoma d’un insecte va ser realitzada a Drosophila melanogaster, encara que durant els últims anys s’ha estès a diferents espècies, especialment a plagues agrícoles o vectors per a malalties humanes. En este context, anotem el neuropeptidoma més complet d’insectes fins el moment. S’obté a través de un transcriptoma de S. exigua generat a partir de mostres de caps de larva, intestí de larva i cervells d’adult. Seixanta-tres gens són identificats i anotats com a neuropèptids putatius, incloent-hi splicing variants per a sis gens i isoformes genètiques diferents per a dos gens específics. Es duu a terme una anàlisi filogenètica per estudiar l’homologia dels neuropèptids de S. exigua amb seqüències d’altres espècies d’insectes (algunes pertanyents a altres ordres d’insectes), i detectar possibles esdeveniments de duplicació gènica. Això ha permès revelar un nucli de neuropèptids format per 43 gens en lepidòpters. Al sistema neuropeptidèrgic, els neuropèptids gut-brain tenen una importància fonamental en la regulació de l’alimentació, el creixement i la digestió, ja que s’expressen tant en cervell com en les cèl·lules neurosecretores de l’intestí. Si comparem l’expressió dels neuropèptids anotats en el cap de larva i en les mostres d’intestí, setze transcrits es consideren brain-gut. Alguns exemples són: allatostatin, allatotropin, proctolin, CCHamide, neuropeptide F i short neuropeptide F. A més, per obtenir informació sobre la presència o absència dels diferents transcrits de neuropèptids en les larves i els adults, la seua expressió es compara en les mostres de cap de larva, intestí de larva i cervell d’adult. Encara que no apareixen neuropèptidsespecífics de larva, sis transcrits es consideren específics d’adults, suggerint una implicació potencial en processos específics d’adults. Per tal de completar la descripció del neuropeptidoma de S. exigua, s’estudia l’expressió d’alguns dels neuropèptids en condicions de fam induïda en les larves. La majoria dels transcrits seleccionats regulen l’alimentació i la digestió. Els resultats mostren que molts d’ells s’expressen de manera diferencial durant la fam induïda, la major part d’ells mostrant una sobreexpressió. Això possiblement correspon a una resposta general d’estrès. La sobreexpressió d’alguns d’ells, com ara el short neuropeptide F, allatostatin o CCHamide, podria estar relacionada amb modificacions olfactives provocades per la inanició, com ja s’havia observat prèviament en D. melanogaster. L’expressió dels neuropèptids també es compara sota diferents condicions de llum i temperatura, ja que estos factors influïxen en el desenvolupament d’insectes. A més, alguns dels neuropèptids tenen un paper en la regulació dels ritmes circadians, que estan connectats amb els cicles de llum i foscor. Cap dels neuropèptids apareix regulat significativament després de la privació de llum, i així es descarta un efecte directe sobre la regulació d’estos gens. Considerant els resultats, la temperatura no té cap efecte clar, suggerint que l’expressió de neuropèptids no està fàcilment influenciada per factors externs. En general, la anotació del neuropeptidoma de S. exigua ajudarà a identificar neuropèptids en altres espècies d’insectes proporcionant informació valuosa sobre la importància de l’acció dels neuropèptids en la regulació de la fisiologia de l’insecte. En el context d’esta tesi, permet el següent pas, dirigit a estudiar la influència de la infecció de SeMNPV en la regulació del sistema neuropeptidèrgic per tal de descobrir nous aspectes rellevants de la interacció baculovirus-eruga. Al segon capítol de la tesi, una vegada s’ha identificat i anotat el repertori de neuropèptids de S. exigua, s’intenta analitzar els possibles canvis produïts per SeMNPV durant la infecció de l’hoste. L’objectiu és identificar alteracions en la regulació dels gens del sistema nerviós central que podrien estar relacionats amb els fenotips induïts pel baculovirus. Com a primer enfocament, els canvis d’expressió gènica en el sistema neuropeptidèrgic relacionats amb SeMNPV s’estudien en mostres d’ARN-Seq de cap de larva. No s’observa un patró clar d’expressió diferencial després de la infecció vírica. Tot i que alguns gens, la funció dels quals ja estava descrita, apareixen regulats segons l’anàlisi estadística. Este és el cas de l’eclosion hormone, l’ecdysis triggering hormone i la prothoracicotropic hormone, que són inductors de l’ècdisi i tenen una funció oposada a l’hormona juvenil. La regulació d’este conjunt de gens produiria un retard en el procés de muda normal, estenent la vida de l’hoste. Això està funcionalment relacionat amb la funció del gen egt, que ja ha estat comentat anteriorment. La regulació d’este grup de gens podria complementar l’acció del gen egt en la interacció baculovirus-hoste. A causa de l’absència d’un patró general de regulació dels gens de neuropèptids després de la infecció per SeMNPV, i per centrar-se en el cervell, on s’expressen la majoria dels gens de neuropèptids, s’analitza l’expressió gènica de neuropèptids en mostres de cervell infectades per SeMNPV a través de RT-qPCR. Els resultats mostren que proctolin-like, un gen semblant al neuropèptid proctolin present en els ordres Coleoptera i Diptera, està clarament regulat després de la infecció vírica, mostrant una infraexpressió. A causa del seu patró d’expressió en els teixits cerebrals i intestinals, als seus llocs d’escissió predits, i la presència de la part activa del neuropèptid proctolin (RY/HLPT) en la seqüència de proctolin-like, es considera per a la seua caracterització funcional i per estudiar el seu paper en la interacció hoste-patogen. El silenciament de gens a través de la interferència d’ARN a millorat l’estudi de la funció gènica en els insectes. No obstant això, l’ús d’estes tècniques en lepidòpters s’ha demostrat que és difícil d’aconseguir. Per això, el mètode seleccionat per a estudiar la funció de proctolin-like és l’estratègia de guany de funció. Així es generen els baculovirus recombinants AcMNPV que expressen el fragment C-terminal de proctolin-like (Se-PLP). Posteriorment, es realitzen bioassajos per comprovar la influència de la sobreexpressió de Se-PLP en la patogenicitat del baculovirus. També s’analitza el seu efecte en el desenvolupament larvari i la locomoció larvària, que són factors que estan funcionalment relacionats amb el neuropèptid proctolin i la seua funció com a regulador de les contraccions dels músculs esquelètics i viscerals. Les infeccions amb el baculovirus AcMNPV que sobreexpressa Se-PLP mostren un augment de la mortalitat a dosis baixes, encara que no a dosis altes. Tot i això, ens porta a concloure que Se-PLP influïx en la interacció baculovirus-eruga. A més, apareix una reducció en el creixement larval i també en la digestió de les larves en aquelles infectades amb el baculovirus AcMNPV-PLP en comparació amb aquelles infectades pel virus control AcMNPV-Con i en les no infectades. D’altra banda, l’expressió de Se-PLP durant la infecció pel baculovirus produïx una reducció en la locomoció de les larves. Per estudiar-ho, desenvolupem un mètode que ens permet mesurar l’activitat de locomoció larvària, comparant els diferents tractaments d’infecció. Els resultats obtinguts ens permeten vincular la funció de Se-PLP amb la regulació de les contraccions dels músculs esquelètics i intestinals, que afecten la digestió i la locomoció, com s’havia descrit anteriorment per al neuropèptid proctolin. Com a conclusió d’este capítol, la infecció per SeMNPV produïx la infraexpressió de tres gens importants en el procés d’ècdisi, possiblement complementant la funció del gen egt en la interacció baculovirus-eruga. En el sistema nerviós central, proctolin-like apareix clarament regulat degut a la infecció per SeMNPV. La caracterització de Se-PLP podria connectar la seua funció amb el fenotip d’hiperactivitat induït pel baculovirus, ja que una disminució en l’expressió d’este gen podria produir un augment en l’activitat de locomoció de les larves. La disminució de expressió de Se-PLP també podria complementar els efectes gènics d’egt d’una manera alternativa, afectant a la regulació de les contraccions intestinals, produint larves més grans i possiblement alliberant més virus al medi ambient. Queda per dilucidar si la regulació de l’expressió de neuropèptids després de la infecció de SeMNPV representa un efecte directe de manipulació directa pel virus en l’hoste, una resposta de l’hoste o un efecte colateral de la infecció baculovírica. Seria necessària fer recerca addicional per revelar els mecanismes de regulació de l’expressió gènica pel virus, augmentant el nostre coneixement sobre els canvis induïts pel paràsit en els seus hostes. En el tercer capítol de la tesi, es descriu el repertori de gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua. Les descripcions anteriorment publicades dels gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua es van obtenir utilitzant nomes mostres d’adults i utilitzant diferents nomenclatures d’anotació que van dificultar les comparacions entre estudis. A més, hi havia una manca de coneixement dels gens quimiosensorials en estadis larvaris, que és l’etapa susceptible a la infecció per baculovirus. En este context, es reanoten els gens relacionats amb quimiosensors de S. exigua utilitzant mostres d’ARN-Seq d’adult i de larves, i també s’unifica la nomenclatura gènica amb l’espècie germana Spodoptera frugiperda, el repertori quimiosensorial de la qual ja s’havia anotat i publicat. Llavors, s’identifiquen un total de 200 gens relacionats amb la quimiorecepció en S. exigua, expandint el nombre de gens identificats en les anotacions publicades anteriorment. Per tal d’obtenir informació sobre l’expressió d’este repertori de gens en les fases larvàries, combinem tècniques d’ARN-Seq i RT-qPCR, centrant-nos principalment en els ORs, la peça central de l’olfacció de l’insecte. En total, s’expressen en larves 50 dels 63 ORs, tot i que no apareixen gens específics d’estadis larvaris. A més, 14 OBPs pareixen ser específics de larves i quatre PBPs (proteïnes d’unió a la feromona) es troben expressades en caps de larva, tot i que la seua funció principal és el reconeixement de la feromona sexual adulta. Això, s’ha vist en altres espècies de lepidòpters i s’ha teoritzat que les larves podrien utilitzar la senyal de la feromona per trobar aliment o per protecció (hipòtesi mother knows best). En altres estudis anteriors, s’havia observat una sobreexpressió de gens ORs i OBPs quan adults eren exposats a volàtils de plantes específiques, en un mecanisme conegut com “sensibilitat als olors”. En este capítol es quantifiquen els nivells d’expressió d’un conjunt d’ORs i PBPs en les larves després de la preexposició a diferents compostos odorants. Després de 24 hores d’exposició, diversos ORs apareixen regulats per sobre de qualsevol que fos l’olor utilitzat. Especulem que l’àmplia sobreexpressió dels ORs podria ser una resposta fisiològica a l’alta concentració de volàtils. Per provar si estos canvis corresponen a una resposta d’estrès general, es duu a terme una altra anàlisi fent passar fam a les larves durant 24 hores. No s’observa el mateix efecte en l’expressió de gens quimiosensorials, així que es conclou que els canvis d’expressió observats anteriorment, no corresponen a una resposta general d’estrès. La identificació d’olors que causen fenotips conductuals en larves de S. exigua, ajuda a enllaçar molècules volàtils amb l’ecologia de la larva. A causa de l’absència de protocols en les larves de S. exigua, es dissenya una nova configuració que permet estudiar les respostes de comportament de les larves a odorants específics. Per tal de provar el mètode, s’empren diferents odorants. Dos d’ells, 1-hexanol i benzaldehid, resulten atractius per a les larves; mentre que d’altres com indol, alcohol benzil, linalool, 3-octanona i cis-3-hexenil propionat, les repel·lixen. Els resultats obtinguts i l’atracció produïda per 1-hexanol, que coincidix amb l’anteriorment observat a Spodoptera littoralis i Lobesia botrana, valida el nostre mètode per identificar odorants que causen fenotips conductuals. En conclusió, en este capítol es duu a terme una nova i més fiable anotació dels gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua, centrant-se en els gens expressats en estadis larvaris. Per tal d’aprofundir en l’olfacció larvària, es realitzen experiments d’exposició a odorants a llarg termin

The role of ODV structural proteins in baculovirus replication

Baculoviruses are arthropod-specific viruses with a circular, double-stranded DNA genome (80-180 kb). Two structural forms are produced during virus replication, comprising budded virus (BV) and occlusion-derived virus (ODV). The BV is produced from 12 hours post infection (hpi) and spreads the infection from tissue to tissue within the host. The ODV is formed 20 hpi and enveloped within occlusion bodies (OBs). The aim of this project was to elucidate the mechanisms involved in ODV production by deleting putative genes involved in oDV, but not BV production. A secondary aim of the project was to determine whether removing these genes improved the quantity/quality of recombinant proteins produced by baculovirus expression vectors. Genes for ODV structural proteins were selected and individual gene deletion mutants were generated. Three of these (Δ orf79 , Δodv-e28, and Δodv-ec43) unexpectedly prevented virus replication in insect cell culture. orf79 and odv-ec43 were demonstrated to be essential genes as viability could be restored after a rescue assay with the target gene, whereas the loss of infectivity in t-.odv-e28 probably resulted from an effect on helicase, an essential neighbouring gene. j Three deletion mutant viruses (AcΔcg30, AcΔodv-e66 and AcΔ.odv-e56) that were viable in insect cell culture were studied for any effect on ODV production and OB formation using bioassays and electron microscopy imaging. Deletion of odv-e66 and odv-e56 both negatively affected oral infectivity of OBs, whereas the deletion of cg30 increased infectivity. The electron microscopy imaging of the OBs of these deletion mutant viruses identified abnormalities for AcΔcg30POl'+ and ActΔodv-e56po1+. AcΔcg30P01+ OBs seemed to be degraded due to deformities in the polyhedron envelope (PE) while AcΔodv-e56po,+ OBs were surrounded by another protein structure but had no apparent difference in structure or ODV packaging compared to the parental virus. The formation of BV by the pif3 deletion mutant virus was reduced, although plaques were still formed in titrations of infectivity. BV production could only be restored by a rescue assay with pif3, suggesting PIF3 may have another function that is yet to be fully characterized. The deletion of orf118/pif1 and pif2 were analysed for their effect on recombinant protein production expressed from the polh promoter, using activity assays. Both the deletion of orf118/pif1 and pif2 caused a reduction in the intracellular protein, beta-galactosidase. However, the deletion of pif2 did not impact the expression of urokinase, an extracellular recombinant protein. This project also investigated through mutagenesis the possible role of the PIF1 RGD motifs in oral infection of larvae. The initial findings suggest that the PIF1 RGD motifs functional role is not very clear and indicate that PIF1 RGD motifs are not involved in integrin binding but could mediate other interactions during viral entry into the midgut cells. While the mechanism involved in the production of ODV was not elucidated, a number of interesting observations have been made about the targeted structural components of the ODV that were investigated, which could aid the understanding of the major transition from BV to ODV production during the baculovirus infectionEThOS - Electronic Theses Online ServiceGBUnited Kingdo

Mamestra configurata nucleopolyhedrovirus (MacoNPV) : potential chitin-binding proteins and their role in oral infectivity

The bertha armyworm (Mamestra configurata) is a major pest of canola and other oilseed crops. A promising control agent for this species is the baculovirus Mamestra configurata nucleopolyhedrovirus (MacoNPV). Baculoviruses are insect-specific viruses. Infections initiate in the host midgut following ingestion of virus particles called occlusion bodies. For a productive infection to occur, the occlusion bodies must dissolve to release the infectious occlusion-derived virions. These virions must pass through the peritrophic matrix, a protein-chitin meshwork that lines the midgut of most insects and provides protection against abrasion and pathogen invasion. The mechanism by which the baculovirus virions transit the peritrophic matrix is unknown. Following the initial infection of midgut cells, a second virion phenotype, the budded virus, is released from infected cells and establishes a systemic infection within the insect. The 11K group of genes, which are conserved among baculovirus species and other insect-infecting viruses, encode proteins with a predicted chitin-binding domain. The degree of conservation of these genes among insect-infecting viruses suggests that they may play a role in insect infectivity. It is possible that the gene products could be involved in an interaction between the baculovirus occlusion-derived virions and the peritrophic matrix or the chitin-secreting cells of the midgut epithelium, and therefore may be involved in initial oral infectivity. The two 11K genes from MacoNPV (ORF 118 and ORF 164), and their homologues in a second species of baculovirus, Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV [ORF145 and ORF150]) were expressed in a baculovirus expression system. The ability of the proteins, Maco118, Maco164, Ac145, and Ac150, to bind to chitin was assessed in vitro using chitin-coated beads. Each of the four proteins binds to chitin, and hydrophobic interactions mediate the binding. Other binding mechanisms are likely involved, but were not determined in this project. To determine the function of these proteins, a series of gene knockout and repair constructs was produced for AcMNPV ORF 145 and ORF 150 using an established bacmid system. An analysis of the knockout and repair constructs using quantitative real-time polymerase chain reaction showed that deletion of either ORF 145 or ORF 150 had no effect on the rate of budded virus production or viral DNA replication. Oral and injection bioassays were performed in Trichoplusia ni larvae to determine if there were differences in infectivity between the knockout, repair, and wild type constructs. Injection assays, in which budded virus from each construct was injected directly into the insect haemocoel, therefore bypassing the midgut and peritrophic matrix, indicated that there was no statistical difference in infectivity between the knockout, repair, and wild type constructs at a dose of 15 TCID50 U per larva. Oral bioassays, in which larvae were fed occlusion bodies from each virus construct, indicated that there was no statistical difference in mortality rates between the knockout, repair, and wild type constructs. The results from this study indicate that although the baculovirus 11K genes are highly conserved among baculovirus species, and the 11K gene products from MacoNPV and AcMNPV interact with chitin, they are not required for oral infectivity in T. ni larvae, and likely serve another function in the baculovirus infection cycle

Vertical transmission of the Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus and its application in biological control

Las infestaciones de larvas de Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) son muy frecuentes en los cultivos de pimiento de los invernaderos de Almería. En estudios previos, la caracterización molecular e identificación de los aislados del nucleopoliedrovirus múltiple de S. exigua (SeMNPV; Baculoviridae) con mayor potencial insecticida así como el desarrollo de otras tecnologías (producción masiva y formulación) permitieron la obtención de un bioinsecticida que es más efectivo que los plaguicidas químicos convencionales para combatir las plagas de S. exigua en las condiciones de dichos invernaderos. Las aplicaciones de formulados de baculovirus se han realizado principalmente utilizando la modalidad de suelta inundativa, en la cual sólo cabe esperar que ejerza un efecto de control el inóculo liberado. Sin embargo, tras la aplicación de un tratamiento con baculovirus, además de la mortalidad producida por el inóculo liberado, se producen otros efectos sobre las sucesivas generaciones del insecto cuya repercusión en la regulación de las plagas que causa han sido poco estudiados. En esta tesis, básicamente se han analizado y cuantificado algunas interacciones huésped-baculovirus y se aportan datos cualitativos y cuantitativos que pueden servir de base para definir una metodología intermedia entre las sueltas de tipo inundativo e inoculativo.The beet armyworm, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) is an important pest of pepper crops in Almerian greenhouses. In previous studies, the identification and molecular characterization of native strains of the S. exigua multiple nucleopolyhedrovirus (SeMNPV; Baculoviridae) with great insecticide potential, as well as the development of additional technologies (mass-production and formulation procedures) has led to the creation of a baculovirus-based bioinsecticide which provides growers with alternative options that can be more effective than conventional chemical insecticides to suppress the damage of S. exigua larvae in Almerian greenhouses. So far, applications of baculovirusbased insecticides are almost invariably based on inundative methods, similar to the strategy of applications based on the use of chemical products. In the present thesis, the SeMNPV vertical transmission and long-term persistence infections in natural populations of S. exigua and their impact on successive generations of infected insects were examined. These findings could constitute the basis for a new strategy of inoculative applications.Para la realización de esta tesis, la autora obtuvo una beca predoctoral para la formación del personal investigador de la Universidad Pública de Navarra.Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología (RD 1393/2007)Bioteknologiako Doktoretza Programa Ofiziala (ED 1393/2007