La família Baculoviridae constitueix un grup divers de virus entomopatogens amb un genoma d’ADN de doble cadena circular. Generalment, els baculovirus infecten en estadis larvaris dels ordres Lepidoptera, Hymenoptera i Diptera. Dins dels baculovirus, els nucleopoliedrovirus són els més comuns, tenint els seus virions oclosos dins d’una estructura proteica anomenada cos d’inclusió (OB) amb forma de poliedre. Els baculovirus tenen dues classes de virions, els virions oclosos dins dels OBs, que s’anomenen occlusion-derived viruses (ODVs); i els virions no oclosos que es coneixen com budded viruses (BVs). El cicle d’infecció pel baculovirus comença quan les larves ingerixen els OBs després d’alimentar-se de superfícies contaminades pel virus. Quan les larves ingerixen els OBs, l’alta alcalinitat dels sucs intestinals de l’insecte, produïx la hidròlisi de l’estructura proteica dels OBs, alliberant els ODVs al lumen del intestí. Els ODVs són els causants de la infecció primària, infectant les cèl·lules columnars de l’intestí larvari. Llavors, els BVs comencen a ser produïts i s’estenen a través del cos de l’insecte, infectant i replicant en molts teixits diferents, en el que es coneix com la infecció secundària.
Com a conseqüència d’esta infecció sistèmica, el baculovirus produïx canvis de comportament en el seu hoste que promouen la dispersió vírica en el camp, en un clar exemple d’avantatge evolutiu. Un d’estos fenotips de comportament ben coneguts és l’augment de l’activitat de locomoció (enhanced locomotor activity, ELA) que fa que les larves esdevinguen més actives, augmentant els seus desplaçaments horitzontals, que alhora amplien la dispersió vírica al camp. En algunes espècies de lepidòpters, com ara Bombyx mori, este augment de la locomoció ha estat relacionada amb l’acció del gen ptp, present al genoma del baculovirus i que codifica per a la proteïna tirosina fosfatasa. Tot i que els mecanismes moleculars a través dels quals este gen produïx este fenotip encara no estan clars.
El tree-top disease és un altre dels fenotips de comportament induïts pels baculovirus que empeny les larves a escalar a posicions apicals en les plantes quan estan prop de morir a causa de la infecció. Allí liqüen i moren. Com a conseqüència, el virus augmenta les seues possibilitats de dispersió amb ajuda dels elements naturals com ara l’aigua o l’aire. Inicialment, este fenotip ha estat vinculat a l’acció del gen egt present al genoma del baculovirus, com s’ha vist al baculovirus de Lymantria dispar. El gen egt codifica per a una UDP-glucosiltransferasa que catalitza la conjugació de l’hormona ecdisteroide amb sucres, esdevenint inactiva i evitant o retardant la inducció de la muda o la pupació de les larves. Per tant, les larves de lepidòpters amb estes hormones inactivades, continuen alimentant-se i creixent, augmentant la seua vida mitja i esdevenint més grans al moment de la seua mort. Com a conseqüència, la progènie vírica lliurada al medi ambient és molt major. No obstant això, l’acció d’egt i el tree-top disease necessiten de més investigació per tal de revelar el mecanisme molecular que els connectaria entre sí.
Estos dos gens que han estat relacionats amb estos fenotips específics van ser adquirits ancestralment en el genoma del baculovirus procedent dels seus hostes. A més, l’existència d’estos fenotips induïts pel paràsit també pot implicar canvis d’expressió en els gens de l’hoste que jugarien un paper clau en el control de patrons fisiològics o de comportament. Tenint en compte això, plantegem la hipòtesi que estos ja descrits fenotips conductuals i d’altres que podrien ser descoberts, podrien estar relacionats amb canvis en els sistemes neurals dels hostes.
Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) (Hübner, 1808) també és conegut com el cuc soldat i constituïx una plaga polífaga distribuïda a tot el món, especialment en zones càlides i temperades. Les etapes larvàries de S. exigua s’alimenten de més de 200 espècies de cultius i plantes ornamentals, amb enormes conseqüències econòmiques i agronòmiques. S’han utilitzat diferents estratègies per al control de S. exigua al camp sobre tot emprant pesticides químics, així com diferents agents de control biològic, com ara bactèries, fongs, nematodes o virus, com els baculovirus. La majoria dels baculovirus tenen un rang d’hostes estret, i això representa un avantatge per al seu ús com insecticides en el camp. Això, juntament amb la seva gran virulència i el seu baix impacte mediambiental, els convertix en excel·lents alternatives al control químic. Els baculovirus són el producte víric més utilitzat en el control de plagues de lepidòpters.
Tenint en compte tot açò, el propòsit principal d’esta tesi doctoral és estudiar la influència del Spodoptera exigua nucleopoliedrovirus múltiple (SeMNPV) en els sistemes neuronals de S. exigua. El sistema nerviós de l’insecte està compost pel sistema nerviós central i el sistema nerviós perifèric. Tots dos participen en el control de la fisiologia i el comportament de l’insecte, encara que també en la comunicació de l’insecte amb el seu entorn circumdant. La nostra hipòtesi està recolzada pel fet que la presència i la replicació dels baculovirus en els òrgans neuronals, com el cervell o les antenes, ja s’ha observat.
Dins del sistema nerviós central, hem centrat els nostres esforços en l’estudi del sistema neuropeptidèrgic, format per neuropèptids que regulen la fisiologia interna de l’insecte i formen part del sistema de comunicació química entre les diferents cèl·lules de l’organisme. Els neuropèptids són xicotetes proteïnes lliurades per les neurones i cèl·lules neurosecretores que actuen com neuromoduladors, neurotransmissors i neurohormones. Els neuropèptids insecticides són sintetitzats principalment en les cèl·lules neurosecretores del protocerebrum de l’insecte. Desprès s’emmagatzemen en òrgans neurohemals i s’alliberen a través d’axons que s’estenen i penetren la barrera de sang a l’hemolimfa. Els neuropèptids deriven de precursors proteics anomenats prepropèptids que s’escindixen i després es modifiquen post-transcripcionalment. El resultat és el pèptid actiu que serà alliberat i enllaçat a receptors específics. Els neuropèptids també poden ser alliberats per glàndules endocrines situades en el tracte intestinal i en altres llocs perifèrics. Generalment es classifiquen segons la seua funció principal i el receptors que activen normalment són receptors acoblats a proteïnes G (GPCRs). Els neuropèptids regulen aspectes fisiològics molt diferents com ara: la alimentació i el desenvolupament, la reproducció, el moviment muscular, l’homeòstasi, la memòria i els ritmes circadians. Encara que la majoria d’ells són considerats pleiotròpics, es a dir, intervenen en més d’una funció biològica.
Dins del sistema nerviós perifèric, ens hem centrat en els gens relacionats amb la quimiorecepció. La quimiorecepció és el procés de detecció d’estímuls químics externs. És molt important en la biologia dels insectes, ja que la informació proporcionada pels senyals químics influïx en comportaments fonamentals com ara l’aparellament, la cerca d’aliments, la ponència d’ous o la fugida de parasitoids o depredadors. La quimiorecepció inclou dues branques principals: l’olfacció i el gust. Diferents famílies de gens participen en l’olfacció i el gust com: receptors d’odorants (ORs), receptors ionotròpics (IRs), receptors gustatius (GRs), proteïnes d’unió a odorants (OBPs) o proteïnes quimiosensorials (CSPs). Cadascun d’estos repertoris gènics tenen funcions concretes en el sistema de quimiorecepció d’insectes, i permeten que la informació proporcionada per molècules químiques s’integre i es combine en el cervell. El cervell de l’insecte llavors emet respostes de comportament concretes segons el canviant entorn químic. Dins dels gens relacionats amb la quimiorecepció, ens hem centrat principalment en els receptors d’odorants, que són la peça central de l’olfacció de l’insecte. Els receptors d’odorants s’expressen a la membrana de les neurones olfactives receptores que estan situades dins de les sensilla distribuïdes al llarg de la cutícula de l’insecte, principalment a les parts bucals i a les antenes.
Per tal d’analitzar la influència de SeMNPV en tots dos sistemes, hem seguit un protocol comú. En primer lloc, hem descrit els repertoris gènics dels neuropèptids i els gens quimiosensorials de S. exigua. Això, ha estat possible gràcies a la realització d’estudis d’ARN-Seq realitzats amb mostres de caps de S. exigua infectats i no infectats, però també, utilitzant enfocaments transcripcionals com la RT-qPCR. Després, hem estudiat canvis associats a SeMNPV en l’expressió d’estos repertoris gènics. Finalment, hem seleccionat candidats gènics per a la seua caracterització funcional i així intentar entendre el seu paper en la interacció hoste-patogen i les conseqüències de la seua regulació després de la infecció per baculovirus.
Al primer capítol de la tesi, anotem el neuropeptidoma de S. exigua. La identificació i la descripció dels neuropèptids ajuda a entendre millor la regulació de la fisiologia dels insectes i la seua adaptació als diferents entorns, però també proporciona nous objectius per al desenvolupament d’estratègies avançades de control de plagues d’insectes. La primera descripció del neuropeptidoma d’un insecte va ser realitzada a Drosophila melanogaster, encara que durant els últims anys s’ha estès a diferents espècies, especialment a plagues agrícoles o vectors per a malalties humanes.
En este context, anotem el neuropeptidoma més complet d’insectes fins el moment. S’obté a través de un transcriptoma de S. exigua generat a partir de mostres de caps de larva, intestí de larva i cervells d’adult. Seixanta-tres gens són identificats i anotats com a neuropèptids putatius, incloent-hi splicing variants per a sis gens i isoformes genètiques diferents per a dos gens específics. Es duu a terme una anàlisi filogenètica per estudiar l’homologia dels neuropèptids de S. exigua amb seqüències d’altres espècies d’insectes (algunes pertanyents a altres ordres d’insectes), i detectar possibles esdeveniments de duplicació gènica. Això ha permès revelar un nucli de neuropèptids format per 43 gens en lepidòpters.
Al sistema neuropeptidèrgic, els neuropèptids gut-brain tenen una importància fonamental en la regulació de l’alimentació, el creixement i la digestió, ja que s’expressen tant en cervell com en les cèl·lules neurosecretores de l’intestí. Si comparem l’expressió dels neuropèptids anotats en el cap de larva i en les mostres d’intestí, setze transcrits es consideren brain-gut. Alguns exemples són: allatostatin, allatotropin, proctolin, CCHamide, neuropeptide F i short neuropeptide F. A més, per obtenir informació sobre la presència o absència dels diferents transcrits de neuropèptids en les larves i els adults, la seua expressió es compara en les mostres de cap de larva, intestí de larva i cervell d’adult. Encara que no apareixen neuropèptidsespecífics de larva, sis transcrits es consideren específics d’adults, suggerint una implicació potencial en processos específics d’adults.
Per tal de completar la descripció del neuropeptidoma de S. exigua, s’estudia l’expressió d’alguns dels neuropèptids en condicions de fam induïda en les larves. La majoria dels transcrits seleccionats regulen l’alimentació i la digestió. Els resultats mostren que molts d’ells s’expressen de manera diferencial durant la fam induïda, la major part d’ells mostrant una sobreexpressió. Això possiblement correspon a una resposta general d’estrès. La sobreexpressió d’alguns d’ells, com ara el short neuropeptide F, allatostatin o CCHamide, podria estar relacionada amb modificacions olfactives provocades per la inanició, com ja s’havia observat prèviament en D. melanogaster.
L’expressió dels neuropèptids també es compara sota diferents condicions de llum i temperatura, ja que estos factors influïxen en el desenvolupament d’insectes. A més, alguns dels neuropèptids tenen un paper en la regulació dels ritmes circadians, que estan connectats amb els cicles de llum i foscor. Cap dels neuropèptids apareix regulat significativament després de la privació de llum, i així es descarta un efecte directe sobre la regulació d’estos gens. Considerant els resultats, la temperatura no té cap efecte clar, suggerint que l’expressió de neuropèptids no està fàcilment influenciada per factors externs.
En general, la anotació del neuropeptidoma de S. exigua ajudarà a identificar neuropèptids en altres espècies d’insectes proporcionant informació valuosa sobre la importància de l’acció dels neuropèptids en la regulació de la fisiologia de l’insecte. En el context d’esta tesi, permet el següent pas, dirigit a estudiar la influència de la infecció de SeMNPV en la regulació del sistema neuropeptidèrgic per tal de descobrir nous aspectes rellevants de la interacció baculovirus-eruga.
Al segon capítol de la tesi, una vegada s’ha identificat i anotat el repertori de neuropèptids de S. exigua, s’intenta analitzar els possibles canvis produïts per SeMNPV durant la infecció de l’hoste. L’objectiu és identificar alteracions en la regulació dels gens del sistema nerviós central que podrien estar relacionats amb els fenotips induïts pel baculovirus.
Com a primer enfocament, els canvis d’expressió gènica en el sistema neuropeptidèrgic relacionats amb SeMNPV s’estudien en mostres d’ARN-Seq de cap de larva. No s’observa un patró clar d’expressió diferencial després de la infecció vírica. Tot i que alguns gens, la funció dels quals ja estava descrita, apareixen regulats segons l’anàlisi estadística. Este és el cas de l’eclosion hormone, l’ecdysis triggering hormone i la prothoracicotropic hormone, que són inductors de l’ècdisi i tenen una funció oposada a l’hormona juvenil. La regulació d’este conjunt de gens produiria un retard en el procés de muda normal, estenent la vida de l’hoste. Això està funcionalment relacionat amb la funció del gen egt, que ja ha estat comentat anteriorment. La regulació d’este grup de gens podria complementar l’acció del gen egt en la interacció baculovirus-hoste.
A causa de l’absència d’un patró general de regulació dels gens de neuropèptids després de la infecció per SeMNPV, i per centrar-se en el cervell, on s’expressen la majoria dels gens de neuropèptids, s’analitza l’expressió gènica de neuropèptids en mostres de cervell infectades per SeMNPV a través de RT-qPCR. Els resultats mostren que proctolin-like, un gen semblant al neuropèptid proctolin present en els ordres Coleoptera i Diptera, està clarament regulat després de la infecció vírica, mostrant una infraexpressió. A causa del seu patró d’expressió en els teixits cerebrals i intestinals, als seus llocs d’escissió predits, i la presència de la part activa del neuropèptid proctolin (RY/HLPT) en la seqüència de proctolin-like, es considera per a la seua caracterització funcional i per estudiar el seu paper en la interacció hoste-patogen.
El silenciament de gens a través de la interferència d’ARN a millorat l’estudi de la funció gènica en els insectes. No obstant això, l’ús d’estes tècniques en lepidòpters s’ha demostrat que és difícil d’aconseguir. Per això, el mètode seleccionat per a estudiar la funció de proctolin-like és l’estratègia de guany de funció. Així es generen els baculovirus recombinants AcMNPV que expressen el fragment C-terminal de proctolin-like (Se-PLP). Posteriorment, es realitzen bioassajos per comprovar la influència de la sobreexpressió de Se-PLP en la patogenicitat del baculovirus. També s’analitza el seu efecte en el desenvolupament larvari i la locomoció larvària, que són factors que estan funcionalment relacionats amb el neuropèptid proctolin i la seua funció com a regulador de les contraccions dels músculs esquelètics i viscerals.
Les infeccions amb el baculovirus AcMNPV que sobreexpressa Se-PLP mostren un augment de la mortalitat a dosis baixes, encara que no a dosis altes. Tot i això, ens porta a concloure que Se-PLP influïx en la interacció baculovirus-eruga. A més, apareix una reducció en el creixement larval i també en la digestió de les larves en aquelles infectades amb el baculovirus AcMNPV-PLP en comparació amb aquelles infectades pel virus control AcMNPV-Con i en les no infectades. D’altra banda, l’expressió de Se-PLP durant la infecció pel baculovirus produïx una reducció en la locomoció de les larves. Per estudiar-ho, desenvolupem un mètode que ens permet mesurar l’activitat de locomoció larvària, comparant els diferents tractaments d’infecció. Els resultats obtinguts ens permeten vincular la funció de Se-PLP amb la regulació de les contraccions dels músculs esquelètics i intestinals, que afecten la digestió i la locomoció, com s’havia descrit anteriorment per al neuropèptid proctolin.
Com a conclusió d’este capítol, la infecció per SeMNPV produïx la infraexpressió de tres gens importants en el procés d’ècdisi, possiblement complementant la funció del gen egt en la interacció baculovirus-eruga. En el sistema nerviós central, proctolin-like apareix clarament regulat degut a la infecció per SeMNPV. La caracterització de Se-PLP podria connectar la seua funció amb el fenotip d’hiperactivitat induït pel baculovirus, ja que una disminució en l’expressió d’este gen podria produir un augment en l’activitat de locomoció de les larves. La disminució de expressió de Se-PLP també podria complementar els efectes gènics d’egt d’una manera alternativa, afectant a la regulació de les contraccions intestinals, produint larves més grans i possiblement alliberant més virus al medi ambient. Queda per dilucidar si la regulació de l’expressió de neuropèptids després de la infecció de SeMNPV representa un efecte directe de manipulació directa pel virus en l’hoste, una resposta de l’hoste o un efecte colateral de la infecció baculovírica. Seria necessària fer recerca addicional per revelar els mecanismes de regulació de l’expressió gènica pel virus, augmentant el nostre coneixement sobre els canvis induïts pel paràsit en els seus hostes.
En el tercer capítol de la tesi, es descriu el repertori de gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua. Les descripcions anteriorment publicades dels gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua es van obtenir utilitzant nomes mostres d’adults i utilitzant diferents nomenclatures d’anotació que van dificultar les comparacions entre estudis. A més, hi havia una manca de coneixement dels gens quimiosensorials en estadis larvaris, que és l’etapa susceptible a la infecció per baculovirus. En este context, es reanoten els gens relacionats amb quimiosensors de S. exigua utilitzant mostres d’ARN-Seq d’adult i de larves, i també s’unifica la nomenclatura gènica amb l’espècie germana Spodoptera frugiperda, el repertori quimiosensorial de la qual ja s’havia anotat i publicat. Llavors, s’identifiquen un total de 200 gens relacionats amb la quimiorecepció en S. exigua, expandint el nombre de gens identificats en les anotacions publicades anteriorment.
Per tal d’obtenir informació sobre l’expressió d’este repertori de gens en les fases larvàries, combinem tècniques d’ARN-Seq i RT-qPCR, centrant-nos principalment en els ORs, la peça central de l’olfacció de l’insecte. En total, s’expressen en larves 50 dels 63 ORs, tot i que no apareixen gens específics d’estadis larvaris. A més, 14 OBPs pareixen ser específics de larves i quatre PBPs (proteïnes d’unió a la feromona) es troben expressades en caps de larva, tot i que la seua funció principal és el reconeixement de la feromona sexual adulta. Això, s’ha vist en altres espècies de lepidòpters i s’ha teoritzat que les larves podrien utilitzar la senyal de la feromona per trobar aliment o per protecció (hipòtesi mother knows best).
En altres estudis anteriors, s’havia observat una sobreexpressió de gens ORs i OBPs quan adults eren exposats a volàtils de plantes específiques, en un mecanisme conegut com “sensibilitat als olors”. En este capítol es quantifiquen els nivells d’expressió d’un conjunt d’ORs i PBPs en les larves després de la preexposició a diferents compostos odorants. Després de 24 hores d’exposició, diversos ORs apareixen regulats per sobre de qualsevol que fos l’olor utilitzat. Especulem que l’àmplia sobreexpressió dels ORs podria ser una resposta fisiològica a l’alta concentració de volàtils. Per provar si estos canvis corresponen a una resposta d’estrès general, es duu a terme una altra anàlisi fent passar fam a les larves durant 24 hores. No s’observa el mateix efecte en l’expressió de gens quimiosensorials, així que es conclou que els canvis d’expressió observats anteriorment, no corresponen a una resposta general d’estrès.
La identificació d’olors que causen fenotips conductuals en larves de S. exigua, ajuda a enllaçar molècules volàtils amb l’ecologia de la larva. A causa de l’absència de protocols en les larves de S. exigua, es dissenya una nova configuració que permet estudiar les respostes de comportament de les larves a odorants específics. Per tal de provar el mètode, s’empren diferents odorants. Dos d’ells, 1-hexanol i benzaldehid, resulten atractius per a les larves; mentre que d’altres com indol, alcohol benzil, linalool, 3-octanona i cis-3-hexenil propionat, les repel·lixen. Els resultats obtinguts i l’atracció produïda per 1-hexanol, que coincidix amb l’anteriorment observat a Spodoptera littoralis i Lobesia botrana, valida el nostre mètode per identificar odorants que causen fenotips conductuals.
En conclusió, en este capítol es duu a terme una nova i més fiable anotació dels gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua, centrant-se en els gens expressats en estadis larvaris. Per tal d’aprofundir en l’olfacció larvària, es realitzen experiments d’exposició a odorants a llarg termin
