Structure based inhibitor design targeting glycogen phosphorylase b. Virtual screening, synthesis, biochemical and biological assessment of novel N-acyl-β-d-glucopyranosylamines

Glycogen phosphorylase (GP) is a validated target for the development of new type 2 diabetes treatments. Exploiting the Zinc docking database, we report the in silico screening of 1888 β- D-glucopyranose-NH-CO-R putative GP inhibitors differing only in their R groups. CombiGlide and GOLD docking programs with different scoring functions were employed with the best performing methods combined in a “consensus scoring” approach to ranking of ligand binding affinities for the active site. Six selected candidates from the screening were then synthesized and their inhibitory potency was assessed both in vitro and ex vivo. Their inhibition constants’ values, in vitro, ranged from 5 to 377 µM while two of them were effective at causing inactivation of GP in rat hepatocytes at low µM concentrations. The crystal structures of GP in complex with the inhibitors were defined and provided the structural basis for their inhibitory potency and data for further structure based design of more potent inhibitors

Computationally motivated synthesis and enzyme kinetic evaluation of N-(β-d-glucopyranosyl)-1,2,4-triazolecarboxamides as glycogen phosphorylase inhibitors

Following our recent study of N-(β-D-glucopyranosyl)-oxadiazole-carboxamides (Polyák et al., Biorg. Med. Chem. 2013, 21, 5738) revealed as moderate inhibitors of glycogen phosphorylase (GP), in silico docking calculations using Glide have been performed on N-(β-D-glucopyranosyl)-1,2,4-triazolecarboxamides with different aryl substituents predicting more favorable binding at GP. The ligands were subsequently synthesized in moderate yields using N-(2,3,4,6-terta-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)-tetrazole-5-carboxamide as starting material. Kinetics experiments against rabbit muscle glycogen phosphorylase b (RMGPb) revealed the ligands to be low µM GP inhibitors; the phenyl analogue (Ki = 1 µM) is one of the most potent N-(β-D-glucopyranosyl)-heteroaryl-carboxamide-type inhibitors of the GP catalytic site discovered to date. Based on QM and QM/MM calculations, the potency of the ligands is predicted to arise from favorable intra- and intermolecular hydrogen bonds formed by the most stable solution phase tautomeric (t2) state of the 1,2,4-triazole in a conformationally dynamic system. ADMET property predictions revealed the compounds to have promising pharmacokinetic properties without any toxicity. This study highlights the benefits of a computationally lead approach to GP inhibitor design

Synthetic, enzyme kinetic, and protein crystallographic studies of C-[béta]-D-glucopyranosyl pyrroles and imidazoles reveal and explain low nanomolar inhibition of human liver glycogen phosphorylase

LBK

An evaluation of indirubin analogues as phosphorylase kinase inhibitors

Phosphorylase kinase (PhK) has been linked with a number of conditions such as glycogen storage diseases, psoriasis, type 2 diabetes and more recently, cancer (Camus S. et al., Oncogene 2012, 31, 4333). However, with few reported structural studies on PhK inhibitors, this hinders a structure based drug design approach. In this study, the inhibitory potential of 38 indirubin analogues have been investigated. 11 of these ligands had IC50 values in the range 0.170 – 0.360 µM, with indirubin-3’-acetoxime (1c) the most potent. 7-bromoindirubin-3’-oxime (13b), an antitumor compound which induces caspase-independent cell-death (Ribas J. et al., Oncogene, 2006, 25, 6304) is revealed as a specific inhibitor of PhK (IC50 = 1.8 µM). Binding assay experiments performed using both PhK-holo and PhK-γtrnc confirmed the inhibitory effects to arise from binding at the kinase domain (γ subunit). High level computations using QM/MM-PBSA binding free energy calculations were in good agreement with experimental binding data, as determined using statistical analysis, and support binding at the ATP-binding site. The value of a QM description for the binding of halogenated ligands exhibiting -hole effects is highlighted. A new statistical metric, the ‘sum of the modified logarithm of ranks’ (SMLR), has been defined which measures performance of a model for both the “early recognition” (ranking earlier/higher) of active compounds and their relative ordering by potency. Through a detailed structure activity relationship analysis considering other kinases (CDK2, CDK5 and GSK-3α/β), 6’(Z) and 7(L) indirubin substitutions have been identified to achieve selective PhK inhibition. The key PhK binding site residues involved can also be targeted using other ligand scaffolds in future work

Structure-based inhibitor design targeting glycogen phosphorylase: potential treatment for type 2 diabetes

Type 2 diabetes (T2D), one of the most common metabolic disorders, is characterized by hyperglycaemia in the context of insulin resistance. Today it represents more than 90% of all diabetics. Liver glycogen phosphorylase is a key enzyme in glycogen metabolism catalyzing the degradation of glycogen to glucose-1-phosphate. Since glycogen in the liver serves as a source of glucose to maintain blood glucose homeostasis glycogen phosphorylase is a validated pharmaceutical target for the discovery of novel antihyperglycaemic agents (inhibitors of the enzymatic action) to combat type 2 diabetes. The discovery of new inhibitors is based on glucose, the natural inhibitor of the enzyme, which binds at the active site. The goal of the present thesis was to discover glucose derivatives which would have stronger potency than glucose for glycogen phosphorylase. For this the method of structure-based-inhibitor design was used. The method is based on the structural analysis of the molecular details that govern inhibitor recognition and specificity by the active site, followed by the assessment of each new inhibitor, in spiral pathway between structural analysis and biochemical assessment which concludes to an inhibitor with strong potency.In the framework of the present Thesis six different groups of glucose derivatives analogues have been studied initially with rabbit muscle glycogen phosphorylase and finally with human liver glycogen phosphorylase. Kinetic experiments used to determine the efficacy of these compounds and their Ki values while X-ray crystallographic studies of the protein-inhibitor complexes revealed the structural basis of their inhibitory potency. The first group studied was the C5 halogen substituted glucopyranosyl nucleosides with halogens at the C5 position of uracil with ClcClU being the most potent (Ki =1.02 μΜ). The next group comprised by C5-alkynyl and alkylfurano[2,3-d] pyrimidine glucopyranonucleosides where alkynyl groups of variable length were introduced in the C5-position replacing the halogen with the aim to exploit interactions with residues of the hydrophobic β-pocket within the active site. The results from this group emphasized the importance of the linker group connecting the glucopyranose moiety with an R group. Therefore, in the next group of ligands linkers of different length were used with the aim to enable the R groups to form favourable interactions with residues in the β-pocket. N-acyl-β-D-glucopyranosylamines had the linker –NHCO–. A variety of R groups were used based on the virtual screening of 1888 compounds of the ZINC, a free database of commercially-available compounds. The most potent compounds of this group were used as a scaffold for the design and study of a new group, the N-acyl-β-D-glucopyranosylureas where the –NHCO– linker was replaced by the –NHCONHCO– group. This proved to have the optimum length for inhibitory potency. The last of inhibitor groups studied had heterocyclic groups as linkers and R substituents of variable size and length. The study of C-glucopynosyl- 1,2,4 triazoles and 4(5)-Aryl-2 C glucopyranosyl-imidazoles led to the discovery of very strong inhibitors with Ki values at the nanomolar range. The most potent (BEva349) bearing an imidazole ring linker with a Ki value of 26 nM is the most potent inhibitor of the catalytic site discovered thus far. The efficacy of these inhibitors was also tested in human liver glycogen phosphorylase. The results verified their strong inhibitory potencies against the pharmaceutical target while at the same time provided experimental evidence for the safe use of data with rabbit muscle glycogen phosphorylase for the design of potent inhibitors of human liver glycogen phosphorylase.Ο διαβήτης τύπου II, μια από τις πιο σοβαρές μεταβολικές διαταραχές χαρακτηρίζεται από υπεργλυκαιμία και αντίσταση στη δράση της ινσουλίνης. Σήμερα, αντιπροσωπεύει το 90% των ασθενών με διαβήτη. Η ηπατική φωσφορυλάση του γλυκογόνου αποτελεί ένα βασικό ένζυμο του μεταβολισμού καθώς καταλύει την αποικοδόμηση του γλυκογόνου προς παραγωγή 1-φωσφορικής γλυκόζης. Μιας και στο ήπαρ το γλυκογόνο είναι η πηγή γλυκόζης για τη διατήρηση της ομοιόστασης της γλυκόζης στο αίμα, η φωσφορυλάση του γλυκογόνου (GP) αποτελεί ένα σημαντικό φαρμακευτικό στόχο πιστοποιημένο για την ανάπτυξη νέων αντι-υπεργλυκαιμικών φαρμάκων (αναστολέων της ενζυμικής δράσης) στο πλαίσιο της καταπολέμησης του διαβήτη τύπου ΙΙ. Η ανακάλυψη αναστολέων βασίζεται στη γλυκόζη, το φυσικό αναστολέα του ενζύμου, που συνδέεται στο καταλυτικό κέντρο. Η ανακάλυψη ανάλογων γλυκόζης τα οποία θα προσδένο-νται στο καταλυτικό κέντρο και θα εμφανίζουν υψηλότερη ανασταλτική ισχύ από αυτήν ήταν ο στόχος της παρούσας διατριβής. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του κατευθυνόμενου-από-τη-δομή σχεδιασμού αναστολέων. Η μέθοδος συνίσταται στην ανάλυση της μοριακής αρχιτεκτονικής που υπαγορεύει τη μοριακή αναγνώριση και εξειδίκευση του καταλυτικού κέ-ντρου του ενζύμου και στην αποτίμηση της ανασταλτικής δράσης κάθε νέου ανάλογου γλυκόζης ακολουθώντας μια συνεχή σπειροειδή πορεία δομικής ανάλυσης και αποτίμησης της βιοδραστι-κότητας η οποία τελικά οδηγεί σε έναν πολύ ισχυρό αναστολέα. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, μελετήθηκαν συστηματικά έξι διαφορετικές ομάδες ε-νώσεων αρχικά έναντι της μυϊκής φωσφορυλάσης του γλυκογόνου από κονίκλους και τελικά ένα-ντι της ανθρώπινης ηπατικής φωσφορυλάσης του γλυκογόνου. Με κινητικές μελέτες προσδιορί-στηκε η βιοδραστικότητα και η σταθερά αναστολής (Ki) τους ενώ η κρυσταλλογραφική μελέτη των ενζυμικών συμπλόκων των αναστολέων απεκάλυψε τη δομική βάση της αναστολής τους. Η πρώτη ομάδα αναστολέων που μελετήθηκε ήταν οι C5-αλογονοϋποκαστεστημένοι γλυκοπυρανονουκλεοζίτες, οι οποίοι έφεραν στη θέση C5 της ουρακίλης ως υποκαταστάτες αλογόνα, με τον ClcClU να είναι ο πλέον βιοδραστικός (Ki =1,02 μΜ). Η επόμενη ομάδα αναστολέων αποτελούνταν από τους C5- αλκυνυλ και αλκυλφουρανό[2,3–d] πυριμιδινό- γλυκοπυρανονουκλεοζίτες στους οποίους τα αλογόνα στη θέση C5 της ουρακίλης αντικαταστάθηκαν από υδρόφοβες ομάδες διαφορετικού μεγέθους και μήκους με στόχο τα νέα μόρια να αλληλεπιδράσουν με αμινοξικά κατάλοιπα μιας υδρόφοβης περιοχής του καταλυτικού κέντρου, την περιοχή της β-εσοχής. Τα αποτελέσματα της σύνδεσης τους ανέδειξαν τη σημαντικότητα της ομάδας η οποία ενώνει τη γλυκοπυρανόζη με έναν υποκαταστάτη R. Έτσι, στις επόμενες ομάδες αναστολέων που μελετήθηκαν χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές ομάδες συνδέτη με στόχο οι υποκαταστάτες R να αλληλεπιδράσουν με ακόμα περισσότερο αμινοξικά κατάλοιπα της β-εσοχής. Μελετήθηκαν μια ομάδα N-ακυλ-β-D-γλυκοπυρανοζυλαμινών που έφερε την ομάδα –NHCO–ως συνδέτη και επιλεγμένες ομάδες υποκαταστατών, που προέκυψαν μετά από υπολογιστική διαλογή 1888 ενώσε-ων της βάσης δεδομένων ZINC. Στη συνέχεια, οι πλέον βιοδραστικοί αναστολείς αυτής της ομά-δας χρησιμοποιήθηκαν ως ικρίωμα για το σχεδιασμό και τη μελέτη μιας νέας ομάδας αναστολέ-ων, τις Ν-ακυλ-β-D-γλυκοπυρανοζυλουρίες όπου ο συνδέτης –NHCO– αντικαταστάθηκε από τον –NHCONHCO–. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως αυτός ο συνδέτης είναι ο πλέον κατάλληλος για την αύξηση της βιοδραστικότητας.Οι τελευταίες ομάδες αναστολέων που εξετάστηκαν έφεραν ετεροκυκλικούς δακτυλίους ως συνδέτη και υποκαταστάτες διαφορετικού μήκους και μεγέθους. Η μελέτη των C-γλυκοπυρανοζυλο-1,2,4 τριάζολο και 4(5)-αρυλο-2-C-γλυκοπυρανοζυλο-ιμι-δάζολο αναστολέων οδήγησε στην ανακάλυψη ιδιαίτερα ισχυρών αναστολέων με σταθερές αναστολής της τάξης των nM. Ο πλέον ισχυρότερος όλων, (BEva349) εμφάνισε σταθερά αναστολής, Ki =26 nM, και αποτελεί τον πλέον ισχυρό αναστολέα του καταλυτικού κέντρου της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου σήμερα. Η βιοδραστικότητα των τελευταίων αυτών ομάδων εξετάστηκε και στην ανθρώπινη ηπατική φωσφορυλάση του γλυκογόνου. Τα αποτελέσματα επαλήθευσαν την ισχυρή ανασταλτική ισχύ αυτών των αναστολέων και έναντι του φαρμακευτικού στόχου ενώ παράλληλα απέδειξαν την ασφαλή χρήση πειραματικών δεδομένων της μυϊκής φωσφορυλάσης του γλυκογόνου από κονίκλους για το σχεδιασμό αναστολέων για το ανθρώπινο ηπατικό ισοένζυμ

Natural products and their derivatives as inhibitors of glycogen phosphorylase: potential treatment for type 2 diabetes

Glycogen phosphorylase (GP) (EC 2.4.1.1) is an important therapeutic target for the potential treatment of type 2 diabetes. The search for potent, selective and drug-like GP inhibitors which may eventually lead to hypoglycaemic agents has to date uncovered a number of natural product inhibitors with both pharmaceutical and nutraceutical potential. GP is an allosteric protein with at least six different ligand binding sites that modulate its enzymatic activity. Hence, inhibitors with considerable structural diversity can be designed. This review is focused on advances in the discovery of natural products and their derivatives as GP inhibitors

Structures of the Plasmodium falciparum heat-shock protein 70-x ATPase domain in complex with chemical fragments identify conserved and unique binding sites

Plasmodium falciparum invades erythrocytes and extensively modifies them in a manner that increases the virulence of this malaria parasite. A single heat-shock 70 kDa-type chaperone, PfHsp70-x, is among the parasite proteins exported to the host cell. PfHsp70-x assists in the formation of a key protein complex that underpins parasite virulence and supports parasite growth during febrile episodes. Previous work resolved the crystallographic structures of the PfHsp70-x ATPase and substrate-binding domains, and showed them to be highly similar to those of their human counterparts. Here, 233 chemical fragments were screened for binding to the PfHsp70-x ATPase domain, resulting in three crystallographic structures of this domain in complex with ligands. Two binding sites were identified, with most ligands binding proximal to the ATPase nucleotide-binding pocket. Although amino acids participating in direct ligand interactions are conserved between the parasite and human erythrocytic chaperones, one nonconserved residue is also present near the ligand. This work suggests that PfHsp70-x features binding sites that may be exploitable by small-molecule ligands towards the specific inhibition of the parasite chaperone