Evaluation of alternative IAA biosynthetic pathways in the bacteria from the pseudomonas syringae complex

Indole-3-acetic acid (IAA) is a phytohormone belonging to the auxin group which production is widely distributed among plant-associated bacteria. In phytopathogenic bacteria, several IAA biosynthetic pathways have been described. The best characterized is the indole-3-acetamide (IAM) pathway, where tryptophan is initially converted into IAM by a monooxygenase (iaaM gene), and later transformed to IAA in a reaction catalysed by a hydrolase (iaaH gene). Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 (Psv), which synthesizes IAA through IAM, encodes two paralogs of these two genes organized in two operons (iaaMH-1 and iaaMH-2). Previously, we have demonstrated that a Psv mutant in the iaaMH-1 operon produces an amount of IAA significantly lower than that synthesized by the wild type strain. This strain, shows a reduced virulence in olive plants. In contrast, a mutant in the iaaMH-2 operon (which encodes a iaaM-2 pseudogene), produces IAA levels similar to those of the wild type strain and is not affected in virulence. Unexpectedly, the iaaMH-1 mutant and the double mutant iaaMH- 1/iaaMH-2 synthesize a residual amount of IAA, suggesting the existence of an alternative route for the production of this compound in Psv.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Metabolic transition in mycorrhizal tomato roots

Beneficial plant–microorganism interactions are widespread in nature. Among them, the symbiosis between plant roots and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) is of major importance, commonly improving host nutrition and tolerance against environmental and biotic challenges. Metabolic changes were observed in a well-established symbiosis between tomato and two common AMF: Rhizophagus irregularis and Funneliformis mosseae. Principal component analysis of metabolites, determined by non-targeted liquid chromatography–mass spectrometry, showed a strong metabolic rearrangement in mycorrhizal roots. There was generally a negative impact of mycorrhizal symbiosis on amino acid content, mainly on those involved in the biosynthesis of phenylpropanoids. On the other hand, many intermediaries in amino acid and sugar metabolism and the oxylipin pathway were among the compounds accumulating more in mycorrhizal roots. The metabolic reprogramming also affected other pathways in the secondary metabolism, mainly phenyl alcohols (lignins and lignans) and vitamins. The results showed that source metabolites of these pathways decreased in mycorrhizal roots, whilst the products derived from α-linolenic and amino acids presented higher concentrations in AMF-colonized roots. Mycorrhization therefore increased the flux into those pathways. Venn-diagram analysis showed that there are many induced signals shared by both mycorrhizal interactions, pointing to general mycorrhiza-associated changes in the tomato metabolome. Moreover, fungus-specific fingerprints were also found, suggesting that specific molecular alterations may underlie the reported functional diversity of the symbiosis. Since most positively regulated pathways were related to stress response mechanisms, their potential contribution to improved host stress tolerance is discussed

Aproximación multi-ómica a la biosíntesis de IAA en la bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi

Las cepas de Pseudomonas savastanoi productoras de tumores en las partes aéreas de plantas leñosas, pertenecen al complejo Pseudomonas syringae y se incluyen en los patovares savastanoi (Psv olivo), nerii (Psn adelfa), retacarpa (Psr retama) y fraxini (Psf fresno). La mayoría de estas cepas producen ácido indol-3-acético (IAA) desde el triptófano (Trp) a través de la ruta de la indol-3-acetamida (operón iaaMH). Aunque este operón no se codifica en Psf ni es frecuente en este complejo bacteriano, la mayoría contienen uno o varios alelos del gen iaaL, responsable en Psn de la síntesis de IAA-Lys, un derivado con menor actividad biológica que el IAA. Aunque las cepas de Psv codifican 2 alelos del gen iaaL, no se ha detectado IAA-Lys en cultivos de estas. Resultados previos de nuestro grupo de investigación demostraron que un mutante de Psv iaaMH reduce drásticamente los niveles de IAA y no induce tumores en olivo. No obstante, en el sobrenadante de cultivos de esta cepa se detecta una concentración de IAA similar a la producida por cepas de Psf y otras P. syringae carentes de estos genes. Esto sugieren la existencia de una ruta de biosíntesis de IAA alternativa. Con el fin de identificar dicha ruta y conocer el papel de los diversos alelos iaaL en estas cepas, hemos realizado un análisis genómico comparativo de 10 cepas de P. savastanoi, y se están construyendo mutantes de Psv en genes potencialmente implicados en la biosíntesis de IAA. De manera complementaria, estamos comparando los transcriptomas y metabolomas de una cepa silvestre de Psv y del mutante iaaMH, tanto en presencia como en ausencia de Trp. Hasta la fecha, hemos detectado varios intermediarios indólicos posiblemente implicados en la producción de IAA en estas cepas y en el patógeno de tomate P. syringae DC3000. Asimismo, estamos ensayando la funcionalidad de 4 alelos iaaL diferentes mediante expresión heteróloga en Psv y análisis del efecto de estas cepas sobre la elongación de raíces de Arabidopsis.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Análisis metabolómico de la producción de compuestos indólicos por bacterias fitopatógenas del complejo Pseudomonas syringae

Las bacterias Gram negativas del complejo Pseudomonas syringae, entre las que se incluye Pseudomonas savastanoi, infectan gran variedad de plantas herbáceas y leñosas de relevancia agrícola y económica. Las cepas de P. savastanoi productoras de tumores o excrecencias en las partes aéreas de plantas leñosas se incluyen en los patovares savastanoi (Psv, aislados de olivo), nerii (Psn, aislados de adelfa), retacarpa (Psr, aislados de retama) y fraxini (Psf, aislados de fresno). La mayoría de las cepas de P. savastanoi producen ácido indol-3-acético (IAA) a través de la ruta de la indole-3-acetamida, en la cual intervienen los genes iaaM e iaaH. Esta ruta es la mejor caracterizada en bacterias fitopatógenas, sin embargo, estos genes no se codifican en cepas de Psf ni se encuentran ampliamente distribuidos en el complejo P. syringae. Aunque un mutante de Psv afectado en el operón iaaMH reduce drásticamente los niveles de IAA producidos, en el sobrenadante de cultivos de esta cepa se detecta una cantidad basal de IAA, similar a la presente en cultivos de cepas de Psf y de P. syringae carentes de estos genes. Esto sugiere la presencia de una ruta de biosíntesis de IAA alternativa en estas cepas. Con el fin de identificar dicha ruta hemos llevado a cabo un análisis metabolómico de los compuestos indólicos producidos por cepas pertenecientes a todos los patovares de P. savastanoi y por la cepa P. syringae DC3000 patógena de tomate (Pto). El agrupamiento de estas cepas según sus perfiles metabólicos es concordante con sus relaciones filogenéticas. Además, hemos observado una mayor similitud metabólica entre las cepas de Psf y Pto con un mutante de Psv carente del operón iaaMH.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

The nitrogen availability interferes with mycorrhiza-induced resistance against Botrytis cinerea in Tomato

Mycorrhizal plants are generally quite efficient in coping with environmental challenges. It has been shown that the symbiosis with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) can confer resistance against root and foliar pathogens, although the molecular mechanisms underlying such mycorrhiza-induced resistance (MIR) are poorly understood. Tomato plants colonized with the AMF Rhizophagus irregularis display enhanced resistance against the necrotrophic foliar pathogen Botrytis cinerea. Leaves from arbuscular mycorrhizal (AM) plants develop smaller necrotic lesions, mirrored also by a reduced levels of fungal biomass. A plethora of metabolic changes takes place in AMF colonized plants upon infection. Certain changes located in the oxylipin pathway indicate that several intermediaries are over-accumulated in the AM upon infection. AM plants react by accumulating higher levels of the vitamins folic acid and riboflavin, indolic derivatives and phenolic compounds such as ferulic acid and chlorogenic acid. Transcriptional analysis support the key role played by the LOX pathway in the shoots associated with MIR against B. cinerea. Interestingly, plants that have suffered a short period of nitrogen starvation appear to react by reprogramming their metabolic and genetic responses by prioritizing abiotic stress tolerance. Consequently, plants subjected to a transient nitrogen depletion become more susceptible to B. cinerea. Under these experimental conditions, MIR is severely affected although still functional. Many metabolic and transcriptional responses which are accumulated or activated by MIR such NRT2 transcript induction and OPDA and most Trp and indolic derivatives accumulation during MIR were repressed or reduced when tomato plants were depleted of N for 48 h prior infection. These results highlight the beneficial roles of AMF in crop protection by promoting induced resistance not only under optimal nutritional conditions but also buffering the susceptibility triggered by transient N depletion

Inactivation of UDP-glucose sterol glucosyltransferases enhances Arabidopsis resistance to Botrytis cinerea

Free and glycosylated sterols are both structural components of the plasma membrane that regulate their biophysical properties and consequently different plasma membrane-associated processes such as plant adaptation to stress or signaling. Several reports relate changes in glycosylated sterols levels with the plant response to abiotic stress, but the information about the role of these compounds in the response to biotic stress is scarce. In this work, we have studied the response to the necrotrophic fungus Botrytis cinerea in an Arabidopsis mutant that is severely impaired in steryl glycosides biosynthesis due to the inactivation of the two sterol glucosyltransferases (UGT80A2 and UGT80B1) reported in this plant. This mutant exhibits enhanced resistance against B. cinerea when compared to wild-type plants, which correlates with increased levels of jasmonic acid (JA) and up-regulation of two marker genes (PDF1.2 and PR4) of the ERF branch of the JA signaling pathway. Upon B. cinerea infection, the ugt80A2;B1 double mutant also accumulates higher levels of camalexin, the major Arabidopsis phytoalexin, than wild-type plants. Camalexin accumulation correlates with enhanced transcript levels of several cytochrome P450 camalexin biosynthetic genes, as well as of their transcriptional regulators WRKY33, ANAC042, and MYB51, suggesting that the Botrytis-induced accumulation of camalexin is coordinately regulated at the transcriptional level. After fungus infection, the expression of genes involved in the indole glucosinolate biosynthesis is also up-regulated at a higher degree in the ugt80A2;B1 mutant than in wild-type plants. Altogether, the results of this study show that glycosylated sterols play an important role in the regulation of Arabidopsis response to B. cinerea infection and suggest that this occurs through signaling pathways involving the canonical stress-hormone JA and the tryptophan-derived secondary metabolites camalexin and possibly also indole glucosinolate

Role of two UDP-Glycosyltransferases from the L group of arabidopsis in resistance against pseudomonas syringae

The role of the salicylic acid (SA) glycosides SA 2-O-β-D-glucose (SAG), SA glucose ester (SGE) and the glycosyl transferases UGT74F1 and UGT74F2 in the establishment of basal resistance of Arabidopsis against Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 (Pst) was investigated. Both mutants altered in the corresponding glycosyl transferases (ugt74f1 and ugt74f2) were affected in their basal resistance against Pst. The mutant ugt74f1 showed enhanced susceptibility, while ugt74f2 showed enhanced resistance against the same pathogen. Both mutants have to some extent, altered levels of SAG and SGE compared to wild type plants, however, in response to the infection, ugt74f2 accumulated higher levels of free SA until 24 hpi compared to wild type plants while ugt74f1 accumulated lower SA levels. These SA levels correlated well with reduced expression in PR1 and EDS1 in ugt74f1. In contrast, ugt74f2 has enhanced expression of Enhanced Disease Susceptibility 1 (EDS1) but a strong reduction in the expression of several jasmonate (JA)-dependent genes. Bacterial infection interfered with the expression of Fatty Acid Desaturase (FAD), Lipoxygenase2 (LOX2), carboxyl methyltransferase1 (BSMT1) and 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED3) genes in ugt74f1, thus promoting an antagonistic effect with SA-signalling and leading to enhanced bacterial growth. UGT74F2 might be a target for bacterial effectors since bacterial mutants affected in effector synthesis were impaired in inducing UGT74F2 expression. These results suggest that UGT74F2 negatively influences the accumulation of free SA, hence leading to an increased susceptibility due to reduced SA levels and increased expression of the JA and ABA markers LOX-2, FAD and NCED-3

Alteración de rutas metabólicas y promoción de defensas endógenas en Lycopersicon esculentum y Capsicum annuum inducidas por la aplicación de nuevos reguladores del crecimiento

Las plantas sintetizan reguladores de crecimiento endógenos que influyen de modo esencial en los procesos fisiológicos de los vegetales. Las prácticas agronómicas actuales están orientadas en su mayor parte a la modificación del desarrollo de las plantas mediante el uso de reguladores de crecimiento. Estas prácticas agrícolas se ven facilitadas, en parte, por la gran cantidad de reguladores sintéticos existentes en el mercado que imitan los efectos de las propias hormonas vegetales.El uso abusivo de fitorreguladores hormonales y pesticidas sintéticos ha provocado la aparición de normativas agrícolas que restringen el uso de aquellos compuestos químicos que provocan alteraciones y disfunciones hormonales en loscultivos. Por tanto, es interesante la investigación básica para desarrollar nuevosfitorreguladores que promuevan alteraciones temporales encaminadas a la reducción de los estreses limitantes de la producción y mejoren la sanidad de los cultivos mediante la inducción de defensas endógenas, lo cual permitiría la reducción del uso de hormonas sintéticas y pesticidas. También es interesante estudiar nuevos compuestos menos tóxicos que sean asimilados por el metabolismo de los vegetales y que tengan capacidad para reducir la aparición de podredumbres de origen fúngico.Entre otros compuestos de origen natural con propiedades reguladoras de crecimiento o bioestimulantes se encuentran los ácidos carboxílicos, las aminas y los azúcares modificados. Estos compuestos por su implicación en el metabolismo vegetal no pueden ser considerados como fitohomonas.Existen pocos estudios relativos a las propiedades de los ácidos carboxílicos como reguladores de crecimiento, sin embargo, hay evidencias suficientes como para afirmar que son compuestos con alto potencial regulador y bioestimulante.Concretamente en esta tesis se ha estudiado el efecto causado por combinaciones del éster etílico del ácido adípico, la furfurilamina, la 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-glucopiranosa y el adipato de etilo y 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-glucopiranosa.Las investigaciones que se han desarrollado en esta tesis han puesto de manifiesto el alto potencial regulador de tres nuevos reguladores del crecimiento vegetal los cuales se han denominado: FGA (furfurilamina + ester etílico del ácido adípico + 1, 2, 3,4 tetra-O-acetil D-glucopiranosa, TOGE-1 (furfurilamina + adipato de etilo y 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-clucopiranosa) y TOGE-2 (1,3-diaminopropano + adipato de etilo y 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-clucopiranosa). Estos compuestos son capaces de estimular ciertos aspectos del metabolismo vegetal alargando la vida productiva de las plantas de cultivo que han sido ensayadas como por ejemplo cítricos, tomate y pimiento.Como principales éxitos se ha logrado mejorar la respuesta de los cultivos frente a los procesos de senescencia inhibiendo las principales enzimas que desencadenan el decaimiento de las plantas. Otra de las cualidades que se han podido determinar es la capacidad de las nuevas moléculas para mejorar el intercambio gaseoso de las plantas y aumentar el uso eficiente del agua que estas realizan. Este aspecto puso de manifiesto que las plantas sometidas a tratamientos con los nuevos PGRs podrían mejorar las respuestas a cierto tipo de estreses, los cuales afectan sobre todo a la capacidad fotosintética de las plantas. En este sentido, la investigación realizada ha permitido comprobar se puede inducir cierto grado de tolerancia al estreses bióticos y tal vez abióticos en ciertas variedades de tomate que a priori se muestran sensibles.Estudios de interacción planta-patógeno han revelado que estos nuevos PGRs pueden estimular mecanismos de defensa inespecíficos en las plantas, los cuales permitirían inducir cierto grado de resistencia a hongos fitopatógenos. Los estudios realizados con hongos del género Alternaria y Botrytis en tomate y Phytophthora en cítricos y pimiento han mostrado resultados positivos en este sentido

Alteración de rutas metabólicas y promoción de defensas endógenas en Lycopersicon esculentum y Capsicum annuum inducidas por la aplicación de nuevos reguladores del crecimiento

Las plantas sintetizan reguladores de crecimiento endógenos que influyen de modo esencial en los procesos fisiológicos de los vegetales. Las prácticas agronómicas actuales están orientadas en su mayor parte a la modificación del desarrollo de las plantas mediante el uso de reguladores de crecimiento. Estas prácticas agrícolas se ven facilitadas, en parte, por la gran cantidad de reguladores sintéticos existentes en el mercado que imitan los efectos de las propias hormonas vegetales.El uso abusivo de fitorreguladores hormonales y pesticidas sintéticos ha provocado la aparición de normativas agrícolas que restringen el uso de aquellos compuestos químicos que provocan alteraciones y disfunciones hormonales en loscultivos. Por tanto, es interesante la investigación básica para desarrollar nuevosfitorreguladores que promuevan alteraciones temporales encaminadas a la reducción de los estreses limitantes de la producción y mejoren la sanidad de los cultivos mediante la inducción de defensas endógenas, lo cual permitiría la reducción del uso de hormonas sintéticas y pesticidas. También es interesante estudiar nuevos compuestos menos tóxicos que sean asimilados por el metabolismo de los vegetales y que tengan capacidad para reducir la aparición de podredumbres de origen fúngico.Entre otros compuestos de origen natural con propiedades reguladoras de crecimiento o bioestimulantes se encuentran los ácidos carboxílicos, las aminas y los azúcares modificados. Estos compuestos por su implicación en el metabolismo vegetal no pueden ser considerados como fitohomonas.Existen pocos estudios relativos a las propiedades de los ácidos carboxílicos como reguladores de crecimiento, sin embargo, hay evidencias suficientes como para afirmar que son compuestos con alto potencial regulador y bioestimulante.Concretamente en esta tesis se ha estudiado el efecto causado por combinaciones del éster etílico del ácido adípico, la furfurilamina, la 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-glucopiranosa y el adipato de etilo y 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-glucopiranosa.Las investigaciones que se han desarrollado en esta tesis han puesto de manifiesto el alto potencial regulador de tres nuevos reguladores del crecimiento vegetal los cuales se han denominado: FGA (furfurilamina + ester etílico del ácido adípico + 1, 2, 3,4 tetra-O-acetil D-glucopiranosa, TOGE-1 (furfurilamina + adipato de etilo y 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-clucopiranosa) y TOGE-2 (1,3-diaminopropano + adipato de etilo y 1,2,3,4 tetra-O-acetil D-clucopiranosa). Estos compuestos son capaces de estimular ciertos aspectos del metabolismo vegetal alargando la vida productiva de las plantas de cultivo que han sido ensayadas como por ejemplo cítricos, tomate y pimiento.Como principales éxitos se ha logrado mejorar la respuesta de los cultivos frente a los procesos de senescencia inhibiendo las principales enzimas que desencadenan el decaimiento de las plantas. Otra de las cualidades que se han podido determinar es la capacidad de las nuevas moléculas para mejorar el intercambio gaseoso de las plantas y aumentar el uso eficiente del agua que estas realizan. Este aspecto puso de manifiesto que las plantas sometidas a tratamientos con los nuevos PGRs podrían mejorar las respuestas a cierto tipo de estreses, los cuales afectan sobre todo a la capacidad fotosintética de las plantas. En este sentido, la investigación realizada ha permitido comprobar se puede inducir cierto grado de tolerancia al estreses bióticos y tal vez abióticos en ciertas variedades de tomate que a priori se muestran sensibles.Estudios de interacción planta-patógeno han revelado que estos nuevos PGRs pueden estimular mecanismos de defensa inespecíficos en las plantas, los cuales permitirían inducir cierto grado de resistencia a hongos fitopatógenos. Los estudios realizados con hongos del género Alternaria y Botrytis en tomate y Phytophthora en cítricos y pimiento han mostrado resultados positivos en este sentido