11 research outputs found
Regulation antigeninduzierter T-Zell Aktivierung durch Integration stimulierender und inhibitorischer Signale
Die Aktivierung naiver Lymphozyten bezeichnet einen komplexen, immunmodulatorischen
ProzeĂź, in dessen Verlauf mitotisch inaktive B- und T-Zellen als Folge des Kontakts
mit Antigen in den Zellzyklus eintreten, proliferieren und anschlieĂźend zu spezifischen
Effektorzellen oder zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren. Die klonale Expansion
von Lymphozyten ist somit einerseits bedeutsam für die Förderung der akuten Immunantwort,
andererseits ist sie auch Voraussetzung fĂĽr die Etablierung von dauerhafter, adaptiver
Immunität, deren zelluläre Grundlage die lymphozytären Gedächtniszellen darstellen. Auf
wiederholte Antigen-Exposition reagieren Lymphozyten mit unmittelbarer und effizienter
Aktivierung der Effektorfunktionen, beispielsweise der Produktion von Antikörpern durch BZellen
oder der zytotoxischen bzw. immunmodulatorischen Aktivität von T-Zellen.
Die Spezifität der Antigen-Erkennung wird in Lymphozyten durch hypervariable Antigenrezeptoren
gewährleistet, deren Stimulation ein komplexes Netzwerk von Signaltransduktionsprozessen
im Zellinneren initiiert. In T-Lymphozyten des Helfertyps resultieren diese
Signalkaskaden unter anderem in der transkriptionellen Induktion des IL-2 Promotors. Das
Signal des Antigenrezeptors wird jedoch moduliert durch die Aktivität von Corezeptoren, im
Falle von T-Helferzellen beispielsweise unter Beteiligung des CD4-MolekĂĽls. CD4 bindet an
konstante Bereiche der antigenpräsentierenden MHC-II-Moleküle und stabilisiert so deren
Interaktion mit dem T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Detaillierte Untersuchungen zu den
Mechanismen der Koordination und Integration von Signalen des T-Zell-Antigenrezeptors mit
denen des CD4-MolekĂĽls bildeten das ĂĽbergeordnete Thema der vorliegenden Arbeit.
Sowohl der T-Zell-Antigenrezeptor als auch CD4 gehören zu einer Klasse von
Rezeptoren, deren zytoplasmatische Anteile an Proteintyrosinkinasen (PTKs) koppeln. CD4
interagiert konstitutiv und nahezu stöchiometrisch mit der src-ähnlichen Kinase p56lck, welche
während der Induktion von T-Zell Aktivierung eng mit der TCR-assoziierten Syk-ähnlichen
Kinase ZAP-70 zu kooperieren vermag. Die VerknĂĽpfung beider Kinasen mit den nachgeschalteten
Signaltransduktionskaskaden erfolgt durch die Phosphorylierung spezifischer
Substrate, welche zu Beginn dieser Untersuchungen noch größtenteils unbekannt waren. Zwei
unabhängige experimentelle Ansätze sollten eine Identifikation potentieller in vivo Substrate
der Tyrosinkinase ZAP-70 ermöglichen. Aufgrund von Befunden mit transmembran
exprimierten Kinase-Fusionsproteine konnten mehrere Phosphoproteine als wahrscheinliche
Substrate von ZAP-70 bestätigt werden, die zur selben Zeit von anderen Autoren als solche
diskutiert wurden. Die zweite, parallel verfolgte experimentelle Strategie zielte auf die
Charakterisierung einer konstitutiv-aktiven Variante von ZAP-70, deren Expression in TZellen
zu einer Entkopplung von stimulierenden Signalen und somit zur Phosphorylierung
spezifisch nachgeschalteter Substrate führen sollte. Tatsächlich konnte - durch Substitution
carboxyterminaler Tyrosinreste von ZAP-70 - eine funktionell konstitutiv-aktive Mutante
generiert und deren Substrate in vivo analysiert werden. Dieser Ansatz resultierte in der
Charakterisierung einer bislang unvermuteten, positiv-regulatorischen Rückkopplungsschleife zwischen ZAP-70 und der ζ-Untereinheit des T-Zell-Antigenrezeptors. Dieser Rückkopplungsmechanismus
könnte bedeutsam sein für die Amplifikation von Signalen des T–
Zell Rezeptors. Dem Carboxyterminus von ZAP-70 wĂĽrde somit entscheidendes Potential zur
Modulation von T-Zell Aktivierung zukommen.
Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Charakterisierung des
bislang unbekannten Proteins ACP33, welches im Vorfeld als ein potentieller Interaktionspartner
der zytoplasmatischen Domäne von CD4 identifiziert worden war. Verschiedene
Befunde hatten zuvor darauf schließen lassen, daß - neben p56lck - alternative intrazelluläre
Liganden von CD4 existieren könnten. Mittels der Two-Hybrid Methodik konnte daraufhin
die cDNA des ACP33 Proteins kloniert und zudem dessen Bindungsspezifität analysiert
werden. ACP33 besitzt offenbar eine peptidbindende Domäne, welche spezifisch eine
Kombination zweier hydrophober, nicht-aromatischer Aminosäurereste am Carboxyterminus
von Peptiden erkennt. In der zytoplasmatischen Domäne von humanem CD4 und der aller
bekannter CD4-Orthologe ist ein derartiges Interaktionsmotiv konserviert. Copräzipitationsexperimente
und Mutationsanalysen bestätigten, daß C-terminale Deletionen von CD4 einen
Verlust der Interaktion mit ACP33 zur Folge haben. Derselbe Effekt resultierte ĂĽberraschenderweise
auch aus der Substitution des Serinrestes 109 in ACP33, wodurch eine zu
Hydrolasen homologe Region des ACP33 Proteins als neuartige peptidbindende Domäne
identifiziert werden konnte. Funktionelle Analysen der carboxyterminalen CD4-Deletionsmutanten
identifizierte das Interaktionsmotiv mit ACP33 als eine inhibitorische Determinante
der antigenabhängigen T-Zell Aktivierung. ACP33 könnte demnach als eine negativ-regulatorische
Komponente des Signalnetzwerkes einen bedeutenden Beitrag zur Modulation von TZell
Aktivierung leisten.
Zusammengenommen verdeutlichen die Resultate beider Teilprojekte, daĂź Regulation von
T-Zell Aktivierung als ein integrativer ProzeĂź aus stimulatorischen und inhibitorischen
Signalen anzusehen ist. Detailliertere Analysen zur Koordination dieser gegensätzlichen
Signale sollte in Zukunft wesentlich zu einem besseren Verständnis von T-Zell Aktivierungsprozessen
beitragen
Inhibition of CDK9 as a therapeutic strategy for inflammatory arthritis
Rheumatoid arthritis is characterised by synovial inflammation and proliferation of fibroblast-like synoviocytes. The induction of apoptosis has long been proposed as a target for proliferative autoimmune diseases, and has further been shown to act as a successful treatment of experimental models of arthritis, such as collagen-induced arthritis. Here we examined the effects of specific oral small-molecule inhibitors of the transcription regulating cyclin-dependent kinase 9 on the development and progression of collagen-induced arthritis. DBA/1 mice were immunised with bovine collagen type II and treated orally with specific CDK9 inhibitors. The effects of CDK9 inhibition on RNA levels and protein expression, apoptosis induction, caspase activation and lymphocyte phenotype were further analysed. Mice showed a significant delay in disease onset and a reduction in disease severity following treatment with CDK9 inhibitors. Inhibiting CDK9 activity in peripheral blood mononuclear cells resulted in the loss of Mcl-1 expression at both the protein and RNA levels, along with a subsequent increase in apoptosis. CDK9 specific inhibitors may be a potential alternative treatment not only of cancer, but also for autoimmune- and inflammatory diseases. Taken together, these results show that transient inhibition of CDK9 induces apoptosis in leukocyte subsets and modulates the immune response
The Justy mutation identifies Gon4-like as a gene that is essential for B lymphopoiesis
A recessive mutation named Justy was found that abolishes B lymphopoiesis but does not impair other major aspects of hematopoiesis. Transplantation experiments showed that homozygosity for Justy prevented hematopoietic progenitors from generating B cells but did not affect the ability of bone marrow stroma to support B lymphopoiesis. In bone marrow from mutant mice, common lymphoid progenitors and pre-pro–B cells appeared normal, but cells at subsequent stages of B lymphopoiesis were dramatically reduced in number. Under culture conditions that promoted B lymphopoiesis, mutant pre-pro–B cells remained alive and began expressing the B cell marker CD19 but failed to proliferate. In contrast, these cells were able to generate myeloid or T/NK precursors. Genetic and molecular analysis demonstrated that Justy is a point mutation within the Gon4-like (Gon4l) gene, which encodes a protein with homology to transcriptional regulators. This mutation was found to disrupt Gon4l pre-mRNA splicing and dramatically reduce expression of wild-type Gon4l RNA and protein. Consistent with a role for Gon4l in transcriptional regulation, the levels of RNA encoding C/EBPα and PU.1 were abnormally high in mutant B cell progenitors. Our findings indicate that the Gon4l protein is required for B lymphopoiesis and may function to regulate gene expression during this process
Cytohesin-1 regulates β-2 integrin-mediated adhesion through both ARF-GEF function and interaction with LFA-1
Intracellular signaling pathways, which regulate the interactions of integrins with their ligands, affect a wide variety of biological functions. Here we provide evidence of how cytohesin-1, an integrin-binding protein and guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for ARF GTPases, regulates cell adhesion. Mutational analyses of the β-2 cytoplasmic domain revealed that the adhesive function of LFA-1 depends on its interaction with cytohesin-1, unless the integrin is activated by exogenous divalent cations. Secondly, cytohesin-1 induces expression of an extracellular activation epitope of LFA-1, and the exchange factor function is not essential for this activity. In contrast, LFA-1-mediated cell adhesion and spreading on intercellular cell adhesion molecule 1 is strongly inhibited by a cytohesin-1 mutant, which fails to catalyze ARF GDP–GTP exchange in vitro. Thus, cytohesin-1 is involved in the activation of LFA-1, most probably through direct interaction with the integrin, and induces cell spreading by its ARF-GEF activity. We therefore propose that both direct regulation of the integrin and concomitant changes in the membrane topology of adherent T cells are modulated by dissectable functions of cytohesin-1
Mutation of mouse Mayp/Pstpip2 causes a macrophage autoinflammatory disease
Macrophage actin-associated tyrosine phosphorylated protein (MAYP)/PSTPIP2, a PCH protein, is involved in the regulation of macrophage motility. Mutations in a closely related gene, PSTPIP1/CD2BP1, cause a dominantly inherited autoinflammatory disorder known as PAPA syndrome. A mutant mouse obtained by chemical mutagenesis exhibited an autoinflammatory disorder characterized by macrophage infiltration and inflammation, leading to osteolysis and necrosis in paws and necrosis of ears. Positional cloning of this recessive mutation, termed Lupo, identified a T to A nucleotide exchange leading to an amino acid substitution (I282N) in the sequence of MAYP. MaypLp/Lp disease was transferable by bone marrow transplantation and developed in the absence of lymphocytes. Consistent with the involvement of macrophages, lesion development could be prevented by the administration of clodronate liposomes. MAYP is expressed in monocytes/macrophages and in a Mac1+ subfraction of granulocytes. LPS stimulation increases its expression in macrophages. Because of the instability of the mutant protein, MAYP expression is reduced 3-fold in MaypLp/Lp macrophages and, on LPS stimulation, does not rise above the level of unstimulated wild-type (WT) cells. MaypLp/Lp mice expressed elevated circulating levels of several cytokines, including MCP-1; their macrophages exhibited altered cytokine production in vitro. These studies suggest that MAYP plays an anti-inflammatory role in macrophages
An EF hand mutation in Stim1 causes premature platelet activation and bleeding in mice
Changes in cytoplasmic Ca2+ levels regulate a variety of fundamental cellular functions in virtually all cells. In nonexcitable cells, a major pathway of Ca2+ entry involves receptor-mediated depletion of intracellular Ca2+ stores followed by the activation of store-operated calcium channels in the plasma membrane. We have established a mouse line expressing an activating EF hand motif mutant of stromal interaction molecule 1 (Stim1), an ER receptor recently identified as the Ca2+ sensor responsible for activation of Ca2+ release–activated (CRAC) channels in T cells, whose function in mammalian physiology is not well understood. Mice expressing mutant Stim1 had macrothrombocytopenia and an associated bleeding disorder. Basal intracellular Ca2+ levels were increased in platelets, which resulted in a preactivation state, a selective unresponsiveness to immunoreceptor tyrosine activation motif–coupled agonists, and increased platelet consumption. In contrast, basal Ca2+ levels, but not receptor-mediated responses, were affected in mutant T cells. These findings identify Stim1 as a central regulator of platelet function and suggest a cell type–specific activation or composition of the CRAC complex