Structural and functional characterization of the bacterial ferrous homeostasis protein FeoA

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012O objectivo deste trabalho intitulado ““Structural and functional characterization of the bacterial ferrous homeostasis protein FeoA” consistiu na determinação da estrutura e função da proteína FeoA da bacteria E.coli. A principal via bacteriana de entrada do ferro ferroso é através do sistema Feo que deriva das palavras inglesas ferrous iron transport. O ferro é um elemento essencial para a maioria dos organismos participando em vias metabólicas essenciais. Os sistemas de importação de ferro seja ele ferro ferroso(Fe2+) ou ferro férrico (Fe3+ ) são importantes alvos terapêuticos limitando o crescimento celular e são por essas razões alvo de estudos científicos. O sistema Feo é o principal responsável pela importação de ferro ferroso nas bactérias E.coli quando estas habitam ambientes anaeróbicos e de baixo pH ricos em ferro ferroso. O operão feo na E.coli codifica três proteínas a FeoA, FeoB e a proteína FeoC. A proteína FeoB é o principal componente deste sistema actuando como uma permease pela qual o ferro ferroso é transportado para o interior do citoplasma da bactéria. A sua função de permease está dependente do seu domínio ”N-terminal G-protein” que possui actividade enzimática GTPase. A hidrolíse de GTP ocorre a uma taxa extremamente baixa e por isso é especulado que a proteína FeoA seja o factor utilizado para aumentar a sua taxa de hidrolíse. Recentemente a função da FeoA foi esclarecida num artigo científico publicado em Junho de 2012 durante o decurso deste projecto. Revelou-se neste artigo que a proteína FeoA é essencial para a função da FeoB. Sem interacção entre as duas proteínas não ocorre o influxo de Fe2+ para citoplasma. Para determinar a estrutura da proteína FeoA através de RMN foi necessário um longo processo de optimização das condições de expressão e purificação. A analise de proteínas através de RMN pressupõe que estas estejam isotopicamente marcadas seja com 15N ou 15N /13C de forma a diminuir a complexidade dos espectros obtidos. Esta marcação só foi possivel através da expressão da proteína FeoA em meios marcados com os respectivos elementos químicos. Os meios mínimos foram utilizados neste processo visto que possibilitavam a substituição das fontes de carbono e nitrogénio pelos respectivos reagentes equivalentes (13C-Glucose e 15NH4Cl). Durante o processo de optimização da purifição foi detectada a presença do dímero de FeoA (17kDa) em solução. Este resultado foi muito importante pois foi a primeira que foi detectada a presença do dímero de FeoA em solução, apesar de existirem algumas estruturas de FeoA em dímero cuja relevância fisiológica é ainda pouco clara. A concentração total de proteína afecta a proporção do monómero e do dímero de FeoA. Foi também determinado ao longo deste projecto a impossibilidade de separar ambas as formas visto que se encontram num equilíbrio dinâmico. Nas fases preliminares deste projecto foi produzida uma amostra cuja concentração era muito baixa 10uM que continha maioritariamente o monómero. Esta amostra era inicialmente mais concentrada mas com o tempo a amostra degradou-se e precipitou levando a uma diminuição da concentração total. Esta amostra apenas possibilitou a obtenção de um 1H-15N-HSQC que devido á sua diluição não permitiu a obtenção de espectros essenciais á determinação da estrutura. O 1H-15N-HSQC obtido quando comparado com o 1H-15N-HSQC na qual se encontram ambas as formas possibilitou a distinção dos picos relativos ao monómero e ao dímero. Para determinar a estrutura da FeoA foi utilizado o 1H-15N-HSQC como guia para identificar os picos em vários outros espectros. Os espectros HNCO,HN(CA)CO, HNCACB e HN(CO)CACB foram utilizados para a identificação dos átomos do backbone da proteína ao mesmo tempo que nos permitiram ligar os vários picos de acordo com a sequência da proteína FeoA. Por outro lado os espectros 15N-TOCSY, hCCH-TOCSY, 1H-13C-HSQC permitiram a identificação dos átomos da cadeia lateral dos aminoácidos. No fim este conjunto de picos identificados foram utilizados nos espectros NOESY que nos permitem identificar interaçãoes até um máximo de 5 A entre H-H. Esta informação permitiu-nos produzir a estrutura da FeoA ao fim de um longo processo de analise por parte de vários softwares e fases finais de refinamento. A estrutura final da FeoA da E.coli possui uma estrutura SH3 domain-like fold semelhante á estrutura determinada através de cristalografia do organismo Stenotrophomonas maltophilia.The goal of this project was to study the FeoA protein from E.coli, in terms of both structure and function as the title suggests. FeoA is a component of one of the major systems responsible for bacterial ferrous iron uptake, the Feo (ferrous iron-transport) system. In addition to FeoA it also contains the, FeoB and FeoC proteins. FeoB acts as a GTP dependent ferrous permease spanning the cytoplasmatic membrane of E.coli. Its N-terminal domain is a GTPase which regulates the ferrous influx. FeoC is believed to be a transcriptional activator or repressor which was recently found in in-vitro experiments to be directly interacting with FeoB potentially modulating its action. The FeoA function that is an important goal of this project was also further elucidated in June 2012 while this project was ongoing. It was shown in vivo that FeoA also interacts with FeoB protein being involved in its import of Fe (II). This agrees with our group’s hypothesis that the FeoA protein might stimulate the GTPase activity of FeoB. Our strategy was to probe the mode of interaction of the proteins of the feo operon in vitro using NMR spectroscopy. The first step in this task was to characterize each of its components. In order to determine the FeoA structure through NMR spectroscopy it was necessary to optimize its expression and purification conditions. During the process of purification it was reported for the first time the presence in solution of the FeoA homodimer. The FeoA monomer was structurally characterize by NMR analysis, where it was verified that the structure is an SH3-domain-like fold in agreement with the crystal structure (16). The residues affected by the dimerization were also determined by NMR

Caracterização nutricional e bioatividade de cogumelos silvestres: Lactarius citriolens, Lactarius turpis, Leucopaxillus candidus e Morchella conica

Mestrado em cooperação com a Universidade de SalamancaMorchella conica, Lactarius citriolens, L. turpis e Leucopaxillus candidus foram estudados com o intuito de fazer a sua caracterização em relação à composição química, valor nutricional e bioatividade. Amostras provenientes do Nordeste Transmontano e da Sérvia (apenas M. conica) foram submetidas a análise por técnicas cromatográficas adequadas identificação e quantificação de açúcares livres, ácidos gordos, ácidos orgânicos e compostos fenólicos. Os extratos metanólicos destas amostras foram estudados sob o ponto de vista bioativo, nomeadamente atividade antioxidante (poder redutor, atividade captadora de radicais livres e inibição da peroxidação lipídica) e, no caso de M. conica proveniente de Portugal e da Sérvia, atividade antimicrobiana (contra bactérias Gram positivo e Gram negativo, e microfungos). O valor nutricional de M. conica variou entre as duas amostras, sendo que a da Sérvia revelou a maior contribuição energética e teor em açúcares livres, ácidos gordos polinsaturados e compostos fenólicos, enquanto a amostra portuguesa foi mais rica em ácidos gordos saturados e monoinsaturados, tocoferóis e ácidos orgânicos. Em geral, a amostra de Portugal revelou o maior potencial antioxidante (com exceção da inibição da peroxidação lipídica), enquanto a da Sérvia exibiu uma maior atividade antimicrobiana. Já nas amostras do género Lactarius, a composição em macronutrientes variou entre as duas espécies, mas os perfis foram similares entre elas e relativamente a outras espécies de Lactarius; L. citriolens forneceu a maior contribuição energética, ácidos gordos saturados e ácidos orgânicos, enquanto a amostra de L. turpis foi mais rica em açúcares livres, ácidos gordos mono e polinsaturados, tocoferóis e compostos fenólicos. O extrato metanólico de L. turpis apresentou a maior atividade antioxidante. Por fim, L. candidus mostrou ser uma espécie interessante quanto ao valor nutricional, com alto teor de proteínas e hidratos de carbono, mas baixos níveis de lípidos, com a prevalência de ácidos gordos polinsaturados. O manitol foi o principal açúcar presente e o β-tocoferol a principal isoforma de tocoferóis. Outros compostos detetados foram os ácidos oxálico, fumárico, p-hidroxibenzóico e cinâmico. A ausência de citotoxicidade dos extratos foi confirmada numa cultura primária de células de fígado porco através do ensaio de sulforrodamina B. O presente trabalho fornece novas informações sobre as espécies em estudo, nomeadamente em relação às suas propriedades químicas, nutricionais e bioativas.Morchella conica, Lactarius citriolens, Lactarius turpis and Leucopaxillus candidus were studied to obtain their characterization in terms of chemical composition, nutricional value and bioactivity. The samples from Northeastern Portugal and from Serbia (only M. conica) were submitted to adequate chromatographic analyses to identify and quantify free sugars, fatty acids, organic acids and phenolic compounds. The methanolic extracts of the samples were studied for their bioactivity, namely antioxidant activity (reducing power, free radicals scavenging activity and lipid peroxidation inhibition) and antimicrobial activity (against Gram positive and negative bacteria, and microfungi), only for Portuguese and Serbian M. conica. The nutritional value of the mentioned species varied between the two samples, the Serbian revealing the major energetic contribution, and the highest content in free sugars, polyunsaturated fatty acids and phenolic compounds, meanwhile the Portuguese one was richer in saturated and monounsaturated fatty acids, tocopherols and organic acids. In general, he Portuguese sample presented higher antioxidant potential (with the exception of lipid peroxidation inhibition), while the Serbian sample exhibit higher antimicrobial activity. Among the studied samples from Lactarius genus, the macronutrients composition varied between the two species, but the profiles were similar within the studied and other Lactarius species. L. citriolens provided the highest energetic contribution, saturated fatty acids and organic acids, while L. turpis sample war richer in free sugars, polyunsaturated and monounsaturated fatty acids, tocopherols and phenolic compounds. The L. turpis methanolic extract presented the highest antioxidant activity. Finally, L. candidus showed to be an interesting species regarding nutritional value, with high content in proteins and carbohydrates, but low levels of lipids, mainly polyunsaturated fatty acids. Mannitol was the main sugar present and β-tocopherol was also the main tocopherol isoforms. Other compounds detected were oxalic, fumaric, p-hydroxybenzoic and cinnamic acids. The absence of cytotoxicity in the extracts was confirmed against a primary culture of porcine liver cells throught sulforhodamine B assay. The present work provides new information about the studied species, namely on their chemical, nutrition and bioactive properties

The role of Atgolgin-84A at the plant ER-Golgi interface

The eukaryotic cell is compartmentalised into an endomembrane system organised into several organelles. Some of these organelles, namely endoplasmic reticulum (ER) and Golgi bodies, are part of a so-called secretory pathway where vital cell components travel to reach the correct final destination or are recycled for further processing. In the plant cell cytoplasm there are numerous stacks of membrane bounded cisternae, each of which constitutes a discrete Golgi body. Golgi bodies are responsible in part for the processing of proteins received from the ER and their distribution to the plasma membrane and other compartments. Exactly how this motile structure is maintained while providing vital functions for the cell is still poorly understood. The ER is physically connected to Golgi bodies, and Golgi matrix components, such as golgins, have been identified and suggested to function as putative tethering factors. Golgins are proteins anchored to the Golgi membrane by the C-terminus either through transmembrane domains (TMDs) or interaction with small regulatory GTPases. The golgin N-terminus contains long coiled-coil domains which consist of a number of α-helices wrapped around each other to form a structure similar to a rope being made from several strands, reaching into the cytoplasm. Atgolgin84A may act as tethering factor at the ER-Golgi interface and within the Golgi stack. In animal cells golgins are also implicated in specific recognition of cargo at the Golgi. In plants, there is no clear evidence for the localisation of Atgolgin-84A at the Golgi. To investigate Atgolgin-84A subcellular localisation and putative function as a tether, fluorescent fusions to Atgolgin-84A and Atgolgin-84A truncation lacking the coiled-coil domains (Atgolgin-84A1-557) were transiently expressed in Nicotiana tabacum and imaged by confocal microscopy with Airyscan detector. High-resolution confocal imaging was used to resolve the Golgi cisternae and the ER-Golgi interface. The data presented here shows that Atgolgin-84A seems to be localised at a pre-cis-Golgi compartment that is also labelled by one of the COPII proteins. Optical trapping is a technology in which an infrared laser beam can be used to capture and manipulate Golgi bodies in planta. The trapping experiments using optical tweezers revealed differences in Golgi bodies trapping properties when the truncated version Atgolgin-84A1-557 was overexpressed in N. tabacum leaves. Under the hypothesis that Atgolgin-84A could also be implicated in ER to Golgi trafficking a secretion assay was optimised using Atgolgin-84A as effector expected to affect the transport of cargo molecules. The trafficking of cargo was imaged when cells were expressing Atgolgin-84A full-length and mutant Atgolgin-84A without coiled-coil domains. The cargo was redirected to a different compartment. This hypothesis was also tested using an α-amylase assay and the secretion index decreased when Atgolgin-84A was co-expressed with cargo supporting the effect observed using confocal imaging. The results show strong evidence for a role of Atgolgin-84A in trafficking between ER and Golgi

Adoção por Casais do Mesmo Sexo: uma trajetória de luta e concretização do direito à família

A presente dissertação carateriza as estratégias identitárias que os casais do mesmo sexo perspetivam para que a adoção seja aceite como um processo e vivência centrais na sua realização e felicidade familiar e social. Os casos em análise (por efeito bola de neve) são constituídos por 4 mulheres lésbicas e 2 homens gays, com idades compreendidas entre os 26 e os 47 anos, de várias regiões do país (Porto, Coimbra, Lisboa e Santarém). Os resultados revelam uma insatisfação perante o olhar discriminatório da sociedade, no geral, e de alguns elementos da comunidade LGBT, sobre a homossexualidade, contestando uma série de mitos a si associados. Porém, a maior insatisfação reside no facto de a discriminação se estender às crianças por estes adotadas, também com base em crenças tradicionais quanto ao seu desenvolvimento. E, ainda, quanto aos grandes contributos para a mudança apontam: os media e a religião, pela sua influência sobre a sociedade; a política, através da implementação de medidas a nível educativo e formativo; e, acima de tudo, o ativismo, que potencia uma maior visibilidade dos casais do mesmo sexo e, consequentemente, inibe a homofobia. / This work features the identity strategies that same-sex couples envisage for the adoption to be accepted as a central process and experience on their achievement and social and family happiness. The study cases (by snowball effect) are constituted by four lesbian and two gay men, aged between 26 and 47, from various regions of the country (Porto, Coimbra, Lisboa and Santarém). The results reveal dissatisfaction with the discriminatory look of society in general, and some elements of the LGBT community on homosexuality, challenging a number of myths associated to itself. But the main dissatisfaction is because that discrimination extends to children adopted by them, also based on traditional beliefs about their development. And yet, as the major contributors for the change, they point: the media and religion, for its influence on society; politics, by implementing measures to educational and training level; and, above all, activism, which promotes greater visibility of same-sex couples and thus inhibits homophobia

A Arte como Exercício da Desobediência Civil

The right of resistance goes back to the very notion of life in society, because the human being has always shown opposition to unfair rules, disobeying their content. From Thoreau, this resistance was called civil disobedience, translated as political, peaceful, illegal but legitimate act in the face of democracy adopted by constitutional States. As civil disobedience, culture also has the policy as a foundation, it represents a social activity that embodies the very exercise of citizenship, through freedom of expression. Art as a cultural manifestation, therefore, can become a political tool for civil disobedience.O direito de resistência se remonta à própria noção de vida em sociedade, pois o ser humano sempre demonstrou oposição às normas injustas, desobedecendo ao seu conteúdo. A partir de Thoureau, essa resistência foi denominada desobediência civil, traduzida como ato político, pacífico, ilegal, mas legítimo, em face do regime democrático adotado pelos Estados constitucionais. Assim como a desobediência civil, a cultura também tem a política como fundamento, por representar uma atividade social que concretiza o próprio exercício da cidadania, através da liberdade de expressão. A arte, como manifestação cultural, portanto, pode se tornar um instrumento político para a desobediência civil

O DIREITO À EDUCAÇÃO E O DIREITO AO TRABALHO À LUZ DO MULTICULTURALISMO.

O estudo busca apresentar elementos que demonstrem a análise do direito à educação e do direito ao trabalho sob a ótica do multiculturalismo, oferecendo ao leitor algumas reflexões acerca dos elos de ligação que podem ser estabelecidos entre os três conceitos em foco. Para tanto, a partir de uma perspectiva hermenêutica, é realizada uma breve explicação acerca de pontos principais que envolvem o multiculturalismo, seguida de noções basilares dos dois direitos fundamentais em comento no artigo, iniciando pelo direito à educação e continuando com o direito ao trabalho. A análise que corresponde ao foco do estudo ocorre na sequência, com algumas reflexões propostas no que concerne à percepção do direito à educação e do direito ao trabalho analisados à luz do multiculturalismo, procurando reconhecer situações de conflito e perceber seu alcance e aplicabilidade

Sensibilizar para incluir

O presente relatório, elaborado no âmbito da Unidade Curricular “Prática Educativa I” do Mestrado em Educação Pré-Escolar, procura refletir todo um percurso de sensibilização realizado em torno da temática do “Autismo”, descrevendo, assim, o trabalho desenvolvido ao longo do estágio. A proposta de intervenção educativa tem como base o livro intitulado “Olá, eu sou o João, um mundo só meu” da autoria de Alice Vieira que aborda de forma original o problema do autismo, o que permitiu fazer a sua exploração com diversas e interessantes atividades. Assim, depois de uma revisão da literatura com enfoque especial em três aspetos: Inclusão, Perturbação do Espetro do Autismo (PEA) e o papel do Educador de Infância na promoção da inclusão da criança, e não esquecendo o pressuposto de que as dificuldades das crianças com PEA também resultam da aceitação do meio que as envolve, foi esboçado um plano baseado em três fases: 1 – Recolha de informação, 2 – Partilha do plano de intervenção/sensibilização com a equipa técnica; 3 – Realização das atividades de sensibilização e as conclusões encontradas. Foi muito gratificante verificar que a temática da inclusão encontrou eco na instituição onde o estágio foi realizado, porque foi ao encontro de uma das preocupações abertas no projeto educativo da mesma. Além disso, deve referir-se que a metodologia adotada para a concretização deste trabalho foi de cariz essencialmente qualitativo, privilegiando-se essencialmente a técnica da entrevista e da observação na recolha dos dados

ANÁLISE DO TRABALHO NA RELAÇÃO COM A DIGNIDADE HUMANA, NO ROL DE DIREITOS FUNDAMENTAIS, NA ABORDAGEM DA CONSTITUIÇÃO FEDERAL DE 1988 E ALGUMAS REFLEXÕES SOBRE SUA CONFIGURAÇÃO ATUAL

O presente artigo consiste em uma pesquisa qualitativa, com método de revisão bibliográfica, que tem como escopo primordial delinear alguns aspectos relevantes acerca do trabalho, de modo a estabelecer as linhas mestras de sua compreensão. Para tanto, são ofertadas noções conceituais, os elos com a dignidade humana, elementos da teoria dos direitos fundamentais (até como forma de demonstrar a fundamentalidade do direito ao trabalho), as passagens constitucionais que dizem respeito ao trabalho e algumas questões que são pertinentes à sua configuração atual