Characterization of human UTF1, a chromatin-associated protein with repressor activity expressed in pluripotent cells

AbstractIn mice, during early embryonic development UTF1 (undifferentiated embryonic cell transcription factor 1) is expressed in the inner cell mass of blastocysts and in adult animals expression is restricted to the gonads. (Embryonic) Cells expressing UTF1 are generally considered pluripotent, meaning they can differentiate into all cell types of the adult body. In mouse it was shown that UTF1 is tightly associated with chromatin and that it is required for proper differentiation of embryonic carcinoma and embryonic stem cells. In this study we functionally characterized the human UTF1 protein. We show with localization, subnuclear fractionation, and strip-FRAP analyses that human UTF1 is a tightly DNA-associated protein with transcriptional repressor activity. Our data identify human UTF1 as a pluripotency-associated chromatin component with core histone-like characteristics

Production, characterization and determination of the real catalytic properties of the putative ‘succinate dehydrogenase’ from Wolinella succinogenes

Both the genomes of the epsilonproteobacteria Wolinella succinogenes and Campylobacter jejuni contain operons (sdhABE) that encode for so far uncharacterized enzyme complexes annotated as ‘non-classical’ succinate:quinone reductases (SQRs). However, the role of such an enzyme ostensibly involved in aerobic respiration in an anaerobic organism such as W. succinogenes has hitherto been unknown. We have established the first genetic system for the manipulation and production of a member of the non-classical succinate:quinone oxidoreductase family. Biochemical characterization of the W. succinogenes enzyme reveals that the putative SQR is in fact a novel methylmenaquinol:fumarate reductase (MFR) with no detectable succinate oxidation activity, clearly indicative of its involvement in anaerobic metabolism. We demonstrate that the hydrophilic subunits of the MFR complex are, in contrast to all other previously characterized members of the superfamily, exported into the periplasm via the twin-arginine translocation (tat)-pathway. Furthermore we show that a single amino acid exchange (Ala86→His) in the flavoprotein of that enzyme complex is the only additional requirement for the covalent binding of the otherwise non-covalently bound FAD. Our results provide an explanation for the previously published puzzling observation that the C. jejuni sdhABE operon is upregulated in an oxygen-limited environment as compared with microaerophilic laboratory conditions

Regulation der Stickstofffixierung in <i>Klebsiella pneumoniae</i>: Stickstoff- und Sauserstoff-Signalaufnahme durch den negativen Regulator NifL

In dem diazotrophen Organismus Klebsiella pneumoniae wird der nif - spezifische Transkriptionsaktivator NifA als Reaktion auf molekularen Sauerstoff und Ammonium durch NifL gehemmt. Die Komplexbildung zwischen NifL und NifA (etwa 1:1-Verhältnis) erfolgt, wenn die Synthese der beiden Proteine in Gegenwart von Sauerstoff und / oder Ammonium stattfindet. Bei Sauerstoff- und Stickstoff-Abwesenheit hingegen wird eine geringere Menge an NifL/NifA-Komplexen (ca. 1%) im Zytoplasma gebildet, da der Großteil des NifL-Proteins an der Zytoplasmamembran ankonzentriert wird. Dies deutet darauf hin, dass die Inhibierung von NifA in Gegenwart von Sauerstoff und / oder Ammonium über direkte Interaktion mit NifL erfolgt und die Bildung der inhibierenden NifL/NifA-Komplexe ausschließlich von der Lokalisation von NifL im Zytoplasma abhängt. Um einen tieferen Einblick in den Mechanismus der Membranassoziation von reduziertem NifL zu erhalten, wurde untersucht, ob die benötigten Elektronen direkt vom reduzierten Menachinonpool stammen. Durch Verwendung eines künstlichen Membransystems, das gereinigte Komponenten der anaeroben Atmungskette von Wolinella succinogenes enthält, wurde die Reduktion von NifL analysiert. Bei einem in vitro Ansatz, in dem Formiatdehydrogenase und Menachinon oder 8-Methyl-Menachinon aus W. succinogenes enthaltende Proteoliposomen verwendet wurden, wurde die Reduktion von gereinigtem NifL durch Oxidation von Formiat bewerkstelligt und mit UV-vis Spektren beobachtet. Die resultierenden Reduktionsraten, die mit gleichen Mengen an untersuchtem NifL errechnet wurden, zeigten, dass die Reduktion von NifL direkt sowohl von der Menge an in die Liposomen eingebauter Formiatdehydrogenase als auch der Menachinone abhängig ist. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass Elektronen direkt vom Menachinon auf den FAD Cofaktor von NifL transferiert werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass reduziertes NifL stark an die Proteoliposomen assoziiert vorliegt, was früheren in vivo Ergebnissen entspricht. Auf Basis dieser Experimente wird vermutet, dass der Redoxstatus des Menachinonpools das Redoxsignal der nif-Regulation durch den direkten Elektronentransfer auf NifL in K. pneumoniae unter anaeroben Bedingungen darstellt. Um die Aminosäuren zu identifizieren, die entweder für die Membranassoziation von NifL oder die Bindung des Cofaktors essentiell sind, wurde eine zufällige Mutagenese des nifL-Gens durchgeführt, die zu verschiedenen Aminosäure-Substitutionen im transkribierten Protein führt. Insgesamt wurden 11.500 Klone auf deren nif - - Phänotyp unter stickstofffixierenden Bedingungen gescreent, die aus 3 unabhängig erstellten Plasmidpools hergestellt wurden, welche zufällig mutagenisierte nifL-Gene auf einem Plasmid enthielten. Nach unterschiedlichen unabhängigen Wachstumsversuchen mit molekularem Stickstoff als alleiniger Stickstoffquelle konnten 26 Mutanten identifiziert und bestätigt werden, die nicht mehr in der Lage waren Stickstoff zu fixieren, und 41 Mutanten, die eine deutlich reduzierte Stickstofffixierung aufwiesen. Durch Sequenzanalysen wurden Aminosäure-Substitutionen identifiziert, die sich hauptsächlich innerhalb der N-terminalen Domäne befinden, welche für die Interaktion mit der Zytoplasmamembran verantwortlich ist und die den FAD-Cofaktor beinhaltet. Einige der so eingeführten Mutationen wurden ausgewählt und mit Hilfe von gerichteter Mutagenese vereinzelt, um deren Effekte zu klären. Für die Transduktion des Stickstoffsignals auf das nif-Regulationssystem wird das Stickstoff-Sensorprotein GlnK benötigt. Es wurde gefunden, dass GlnK unter stickstofflimitierten Bedingungen mit NifL und NifA trimere Komplexe bildet. Die Bindung von GlnK mit NifL/NifA ist spezifisch, wenngleich die Menge an GlnK innerhalb der Komplexe gering ist. Zwei weitere deutliche Hinweise zeigen, dass unter anaeroben Bedingungen aber in Anwesenheit von Ammonium zusätzliches NtrC-unabhängig synthetisiertes GlnK die Stabilität der inhibitorischen NifL/NifA-Komplexe verringert. Daher wird vorgeschlagen, dass der trimere NifL/NifA/GlnK-Komplex eine vorübergehende Struktur darstellt und es wird vermutet, dass GlnK mit dem inhibitorischen NifL/NifA-Komplex interagiert und dessen Dissoziation bei Stickstofflimitierung verursacht

Characterization and role of UTF1 in embryonic stem and carcinoma cells : implications for regulation of gene expression, chromatin structure and differentiation

ABSTRACT: In his thesis Rajkumar Thummer has investigated the role of Undifferentiated embryonic cell Transcription Factor 1 (UTF1) in regulating specific embryonic stem (ES) and carcinoma (EC) cell properties. ES and EC cells can differentiate into (almost for EC) all cell types present in the adult organism, i.e. pluripotency. In addition, ES cells are able to proliferate indefinitely through a process called self-renewal (after division, both daughter cells are equal to the mother cell). ES cells can be derived from the inner cell mass of blastocyst embryos, a developmental stage reached 3-4 days after fertilization in mice. EC cells have been isolated from different germ cell tumors. The UTF1 gene is highly expressed in ES and EC cells and is required for proper differentiation of these cells. Here Thummer shows that the human UTF1 protein represses gene expression and has biochemical properties very similar to core histones; essential structural chromatin proteins. In the human population, sequence variants of the UTF1 gene are present and one of these variant UTF1 genes encodes a protein with decreased histone-like properties. When ES or EC cells are generated with elevated UTF1 levels, their ability to properly differentiate is affected, a finding of Thummer also observed in ES and EC cells with reduced UTF1 levels. Summarizing, Thummers data show that UTF1 is a key chromatin component in ES and EC cells. His data propose that UTF1 is important for a chromatin organization that prevents aberrant gene expression and required for proper initiation of lineage-specific differentiation of ES and EC cells. SAMENVATTING: Rajkumar Thummer onderzocht de rol van Undifferentiated embryonic cell Transcription Factor 1 (UTF1) bij de regulatie van specifieke eigenschappen van embryonale stamcellen (ES) en embryonale carcinoma (EC) cellen. ES- en EC-cellen kunnen differentiëren tot bijna (in geval van EC-cellen) alle celtypen die aanwezig zijn in het volwassen organisme, ook wel pluripotentie genoemd. Daarnaast kunnen ES-cellen zich oneindig vermeerderen in een proces van zelfvernieuwing. Na celdeling zijn beide dochtercellen gelijk aan de moedercel. ES-cellen kunnen worden geïsoleerd uit blastocyst embryo's, een ontwikkelingsstadium dat in muizen in drie tot vier dagen na de bevruchting bereikt wordt. EC-cellen werden geïsoleerd uit verschillende kiemceltumoren. Het UTF1-gen komt sterk tot expressie in ES- en EC-cellen en is onmisbaar voor differentiatie van deze cellen. Thummer toont aan dat het menselijke eiwit UTF1-genexpressie onderdrukt en biochemische eigenschappen bezit die vergelijkbaar zijn met die van histonen; essentiële structurele chromatine-eiwitten. In de menselijke populatie, komen varianten van het UTF1-gen voor. Een van deze UTF1-varianten codeert voor een eiwit met verminderde histon-achtige eigenschappen. ES- of EC-cellen met verhoogde UTF1 hoeveelheden blijken beperkt in hun vermogen om correct te differentiëren, een bevinding ook waargenomen in ES- en EC-cellen met verminderde UTF1-hoeveelheden. Samengevat, uit Thummers bevindingen blijkt dat UTF1 een belangrijke chromatine component is in ES- en EC-cellen. Zijn gegevens suggereren dat UTF1 noodzakelijk is voor een chromatinestructuur die ongewenste genexpressie voorkomt en een juiste, weefselspecifieke differentiatie van ES- en EC-cellen mogelijk maakt.

Cell-permeant recombinant Nanog protein promotes pluripotency by inhibiting endodermal specification

A comprehensive understanding of the functional network of transcription factors establishing and maintaining pluripotency is key for the development of biomedical applications of stem cells. Nanog plays an important role in early development and is essential to induce natural pluripotency in embryonic stem cells (ESCs). Inducible gain-of-function systems allowing a precise control over time and dosage of Nanog activity would be highly desirable to study its vital role in the establishment and maintenance of pluripotency at molecular level. Here we engineered a recombinant cell permeable version of Nanog by fusing it with the cell penetrating peptide TAT. Nanog-TAT can be readily expressed in and purified from E. coli and binds to a consensus Nanog DNA sequence. At cellular level it enhances proliferation and self-renewal of ESCs in the absence of leukemia inhibitory factor (LIF). Nanog-TAT together with LIF acts synergistically as judged by enhanced clonogenicity and activation of an Oct4-promoter-driven GFP reporter gene. Furthermore Nanog-TAT, in the absence of LIF, promotes pluripotency by inhibiting endodermal specification in a Stat3-independent manner. Our results demonstrate that Nanog protein transduction is an attractive tool allowing control over dose and time of addition to the cells for studying the molecular control of pluripotency without genetic manipulation

Biochemical studies of Klebsiella pneumoniae NifL reduction using reconstituted partial anaerobic respiratory chains of Wolinella succinogenes

In the diazotroph Klebsiella pneumoniae the flavoprotein NifL inhibits the activity of the nif-specific transcriptional activator NifA in response to molecular oxygen and combined nitrogen. Sequestration of reduced NifL to the cytoplasmic membrane under anaerobic and nitrogen-limited conditions impairs inhibition of cytoplasmic NifA by NifL. To analyze whether NifL is reduced by electrons directly derived from the reduced menaquinone pool, we studied NifL reduction using artificial membrane systems containing purified components of the anaerobic respiratory chain of Wolinella succinogenes. In this in vitro assay using proteoliposomes containing purified formate dehydrogenase and purified menaquinone (MK6) or 8-methylmenaquinone (MMK6) from W. succinogenes, reduction of purified NifL was achieved by formate oxidation. Furthermore, the respective reduction rates, which were determined using equal amounts of NifL, have been shown to be directly dependent on the concentration of both formate dehydrogenase and menaquinones incorporated into the proteoliposomes, demonstrating a direct electron transfer from menaquinone to NifL. When purified hydrogenase and MK6 from W. succinogenes were inserted into the proteoliposomes, NifL was reduced with nearly the same rate by hydrogen oxidation. In both cases reduced NifL was found to be highly associated to the proteoliposomes, which is in accordance with our previous findings in vivo. On the bases of these experiments, we propose that the redox state of the menaquinone pool is the redox signal for nif regulation in K. pneumoniae by directly transferring electrons onto NifL under anaerobic conditions

Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells

Integrating viruses represent robust tools for cellular reprogramming; however, the presence of viral transgenes in induced pluripotent stem cells (iPSCs) is deleterious because it holds the risk of insertional mutagenesis leading to malignant transformation. Here, we combine the robustness of lentiviral reprogramming with the efficacy of Cre recombinase protein transduction to derive iPSCs devoid of transgenes. By genome-wide analysis and targeted differentiation towards the cardiomyocyte lineage, we show that transgene-free iPSCs are superior to iPSCs before Cre transduction. Our study provides a simple, rapid and robust protocol for the generation of clinical-grade iPSCs suitable for disease modeling, tissue engineering and cell replacement therapies