Crystal structure analysis of the spliceosomal DEAD-box protein hPrp28

DEAD-Box Proteine gehören zur Superfamilie der Helikasen. Sie verwenden die Energie aus der ATP-Hydrolyse, um RNA-RNA- oder RNA-Protein-Interaktionen aufzulösen und katalysieren auf diese Weise Konformationsänderungen in Ribonukleoproteinkomplexen. Das DEAD-Box Protein hPrp28 ist Bestandteil des U5 snRNP des humanen Spleißosoms. Es ist notwendig für die Integration des U4/U6.U5 tri-snRNP in diesen makromolekularen Komplex und die anschließend stattfindende Konformationsänderung, die zum aktiven Spleißosom und zur ersten Transester-Reaktion führt. Vermutlich katalysiert hPrp28 dabei an der 5 -Spleißstelle der prä-mRNA den Austausch der U1 snRNA gegen die U6 snRNA. In dieser Arbeit wurde die C-terminale Helikasedomäne von hPrp28 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenbeugungsexperimente bestimmt. Sie umfasst zwei Subdomänen, die jeweils ein zentrales β-Faltblatt enthalten, das von mehreren α-Helices umgeben wird. Dieser Aufbau ist sehr ähnlich zu demjenigen in bekannten Strukturen anderer DEAD-Box Proteine. Unterschiedlich ist aber die relative Orientierung der Subdomänen zueinander. In der erhaltenen Struktur von hPrp28 liegen die Subdomänen in einer sehr offenen Konformation vor. Zur biochemischen Charakterisierung der Helikasedomäne von hPrp28 wurden Interaktionsstudien mit möglichen Liganden duchgeführt. Die Untersuchung der RNA-Bindung mit verschiedenen Substraten weist darauf hin, dass sie möglicherweise mit doppelsträngiger RNA interagiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Helikasedomäne von hPrp28 in vitro ADP bindet, nicht aber ATP. Dementsprechend konnte auch keine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Die Molekularstruktur macht sichtbar, dass die ATP-Bindestelle der Helikasedomäne durch die Konformation der P-Schleife geschlossen ist und darum die Bindung von ATP sterisch inhibiert wird. N-terminal hat hPrp28 eine Arginin-Serin-reiche Domäne. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie in vitro durch die Kinasen SRPK1 und Clk1 vielfach phosphoryliert werden kann und dass sich die Phosphorylierung durch SRPK1 auf die ersten 125 Aminosäuren konzentriert. In Zusammenarbeit mit Rebecca Mathew und Reinhard Lührmann (MPI, Göttingen) ergab sich, dass diese Phosphorylierung essentiell für die Bindung von hPrp28 an das U4/U6.U5 tri-snRNP ist und damit auch für die Integration des tri-snRNP in das Spleißosom

Site-specific modification of ED-B-targeting antibody using intein-fusion technology

Abstract Background A promising new approach in cancer therapy is the use of tumor specific antibodies coupled to cytotoxic agents. Currently these immunoconjugates are prepared by rather unspecific coupling chemistries, resulting in heterogeneous products. As the drug load is a key parameter for the antitumor activity, site-specific strategies are desired. Expressed protein ligation (EPL) and protein trans-splicing (PTS) are methods for the specific C-terminal modification of a target protein. Both include the expression as an intein fusion protein, followed by the exchange of the intein for a functionalized moiety. Results A full-length IgG specific for fibronectin ED-B was expressed as fusion protein with an intein (Mxe GyrA or Npu DnaE) attached to each heavy chain. In vitro protocols were established to site-specifically modify the antibodies in high yields by EPL or PTS, respectively. Although reducing conditions had to be employed during the process, the integrity or affinity of the antibody was not affected. The protocols were used to prepare immunoconjugates containing two biotin molecules per antibody, attached to the C-termini of the heavy chains. Conclusion Full-length antibodies can be efficiently and site-specifically modified at the C-termini of their heavy chains by intein-fusion technologies. The described protocols can be used to prepare immunoconjugates of high homogeneity and with a defined drug load of two. The attachment to the C-termini is expected to retain the affinity and effector functions of the antibodies.</p