Purification of DNA vaccine to prevent or treat cervical cancer

Human Papillomavirus (HPV) is worldwide sexually transmitted and associated with 99.7% of cervical cancer. The cancer progression is due to the expression of the oncoproteins E6 and E7, which can alter the cell cycle and are responsible for the viral replication and transformation of host cells. The vaccines available are only preventive ones, it being necessary to develop therapeutic ones, to prevent and treat a pre-existent infection. Deoxyribonucleic acid (DNA) vaccination along with the use of plasmid DNA (pDNA) as a non-viral vector arises as a good strategy that can activate both humoral and cellular immune responses, allowing the prevention and treatment of HPV infections. The combination of the amino-acid affinity chromatography (AC) with the innovative monolithic supports appears as a promising approach to obtain highly purified supercoiled (sc) pDNA – the active biological conformation – with high purity and recovery. This allows the selective interaction of specific ligands to the target biomolecule adding to the higher capacity of monoliths when compared to conventional chromatographic supports. Monoliths also allow the use of high flow rates, which allows a fast purification procedure and decreases the retention time of the target biomolecule, avoiding its degradation. In the present work, different elution strategies (manipulation of sodium chloride (NaCl) concentrations and/or pH and competition) were explored, in order to purify the supercoiled HPV-16 E6/E7MUT pDNA, by using the arginine monolith with spacer arm. The best elution strategy applied on both laboratorial and preparative scales allowed the removal of impurities within the regulatory agency recommendations, with 93.3% and 98.5% of purity degree, respectively. This reinforces the applicability of this monolith for the sc pDNA purification. Moreover, only one in thousands naked plasmids presented to the cells reach the nucleus and are expressed. The use of nanoparticles is a valuable strategy that permits the protection of the pDNA by avoiding the enzymatic degradation and facilitates the specific delivery, enhancing the cellular transfection. Thus, different magnesium carbonate (MgCO3) systems were characterized regarding its encapsulation efficiency (around 87%), morphology (round shape), size (99.7-237.4 nm) and zeta potential (positive). These data suggest that the developed nanoparticles are suitable for cellular uptake and thus appropriate for therapeutic applications. Additionally, in vitro studies accompanied with confocal microscopy were performed, which revealed that all the formulated systems are able to transfect eukaryotic cells.A infeção causada pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) é uma doença sexualmente transmitida, que afeta tanto homens como mulheres a nível mundial. Em último caso, a infeção causada pelo HPV pode levar ao aparecimento de massas tumorais. De facto, o ácido desoxirribonucleico (DNA) do HPV foi encontrado em 99,7% dos casos de cancro do colo do útero, provocando mais de meio milhão de mortes. A progressão do cancro é devida à expressão das oncoproteínas E6 e E7, consideradas tumorogénicas pela sua capacidade de alterar o ciclo celular, sendo estas responsáveis pela replicação viral e transformação e imortalização das células hospedeiras. Atualmente, existem apenas duas vacinas comercializadas contra a infeção pelo HPV: a Gardasil® e a Cervarix®. Estas vacinas profiláticas ativam unicamente a imunidade humoral, pela geração de anticorpos contra o HPV e são somente preventivas, ou seja, apenas são efetivas antes de ocorrer a infeção. Assim, as vacinas terapêuticas têm a promissora vantagem de conseguir eliminar lesões pré-existentes e até tumores. Surgem então algumas estratégias terapêuticas inovadoras, como a terapia génica e as vacinas de DNA, que ativam tanto a resposta humoral como a celular, permitindo a prevenção e o tratamento de doenças como o cancro do colo do útero. Nas vacinas de DNA, o uso do DNA plasmídico (pDNA) como vetor não viral torna-se bastante apelativo, não só pela sua baixa toxicidade e elevada segurança, mas também pela simples produção e aplicação. A produção destas vacinas requer a purificação à escala preparativa do pDNA superenrolado (sc), considerada a isoforma biologicamente ativa. É, por isso, necessário explorar diversas estratégias de purificação de forma a obter o maior rendimento e pureza do pDNA sc. A cromatografia de afinidade com aminoácidos tem demonstrado ser uma abordagem promissora, pois permite a interação seletiva entre ligandos específicos e as biomoléculas de interesse, à semelhança de interações biológicas que ocorrem naturalmente entre proteínas a aminoácidos no organismo. Para além disso, o uso de monolitos como suporte cromatográfico tem vindo a demonstrar que estes suportes são uma excelente alternativa aos convencionais, visto terem uma maior capacidade de ligação para moléculas de grandes dimensões e que possibilitam a utilização de fluxos mais elevados, diminuindo o tempo de retenção da biomolécula de interesse, evitando assim a sua degradação. Assim, o presente trabalho teve como primeiro objetivo explorar diferentes estratégias de eluição cromatográficas, utilizando um monolito de arginina com um braço espaçador, no sentido de purificar o pDNA sc a usar numa vacina de DNA contra o cancro do colo do útero. Inicialmente, foram realizados vários ensaios, quer em condições de eluição iónicas quer hidrofóbicas, para avaliar o comportamento cromatográfico e a influência dos diferentes grupos imobilizados no monolito de epóxi. Depois, o monolito de arginina com um braço espaçador foi caracterizado em termos de capacidade dinâmica de ligação (2.53 mg/mL obtido a 10% da curva “breakthrough”), confirmando que este suporte apresenta maior capacidade de ligação do que um suporte convencional (0.133 mg/mL), modificados com o mesmo ligando (arginina). Por outro lado, este valor é menor que o valor de capacidade de ligação obtido com o monolito de arginina (3.55 mg/mL), provavelmente devido à eletronegatividade do braço espaçador que promove repulsão pelo pDNA. Para avaliar a seletividade do suporte, vários ensaios foram realizados utilizando amostras de plasmídeo pré-purificado com o kit comercial (isoformas circular aberta, linear e sc), manipulando a concentração de cloreto de sódio (NaCl) e o pH do tampão de eluição. Os resultados comprovaram que é possível obter a isoforma sc purificada, apesar da sua recuperação ser ligeiramente sacrificada. Posteriormente, prosseguiu-se para a purificação do pDNA sc a partir de uma amostra mais complexa de lisado de Escherichia coli (E. coli). Diferentes estratégias de eluição foram abordadas, incluindo a manipulação de NaCl e pH, assim como a adição de arginina no tampão de eluição como agente de competição. Após várias otimizações, a estratégia que melhor resultou na purificação da isoforma de interesse foi a de um gradiente por passos com o tampão de equilíbrio a 680 mM de NaCl em tampão 10 mM tris e 10 mM EDTA (Tris-EDTA), pH 7 e o tampão de eluição a 649 mM e 1 M de NaCl em Tris-EDTA, pH 7,5. Esta estratégia cromatográfica permitiu obter o plasmídeo sc com 93,3% de pureza e 72% de recuperação. A aplicabilidade do monolito de arginina com um braço espaçador na purificação do plasmídeo à escala preparativa também foi avaliada, tendo-se recuperado o plasmídeo com 98,5% de pureza. As impurezas (DNA genómico, proteínas e endotoxinas) das frações recolhidas de pDNA sc, tanto na escala laboratorial como na preparativa, foram quantificadas, estando os resultados dentro dos valores recomendados pelas agências reguladoras. Assim sendo, o monolito de arginina com um braço espaçador permitiu uma rápida e eficaz separação do pDNA sc, recorrendo a baixas concentrações de sal, tanto numa escala laboratorial como preparativa. Por outro lado, sabe-se que apenas um em mil plasmídeos apresentados às células eucarióticas conseguem alcançar o núcleo e levar à expressão do gene de interesse. Desta forma, torna-se crucial desenvolver estratégias que permitam a proteção do pDNA e que facilitem a sua entrada no núcleo. O uso de nanopartículas tem revelado ser uma valiosa solução, pois além de protegerem o pDNA da degradação enzimática, permitem uma entrega específica e, consequentemente, um aumento na transfeção celular. Assim sendo, este trabalho teve como segundo objetivo a formulação de nanopartículas de carbonato de magnésio (MgCO3) e gelatina, funcionalizadas com os ligandos de manose e galactose para direcionar as nanopartículas para as células alvo (células dendríticas). Em termos da morfologia, as imagens obtidas na microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e na microscopia eletrónica de transmissão (TEM) permitiram concluir que todos os sistemas adquirem uma forma arredondada. Foi também calculada a eficiência de encapsulação (EE) dos diferentes sistemas com diferentes quantidades de pDNA, constatando-se que o sistema com 5 µg de pDNA possibilitou uma melhor encapsulação (cerca de 87%). Para além disso, a gelatina permitiu diminuir o tamanho médio das nanopartículas e a funcionalização com os ligandos de manose e galactose não aumentou significativamente o tamanho das nanopartículas de gelatina, estando os valores entre 99,7 nm e 237,4 nm. Por fim, os valores do potencial zeta foram positivos, o que sugere uma interação facilitada das nanopartículas com a membrana celular que é carregada negativamente, possibilitando uma transfeção mais eficiente. Todos os sistemas estudados apresentam características promissoras para um uptake celular adequado, o que foi comprovado pela transfecção de células HeLa. Em conclusão, o presente trabalho mostrou que o monolito de arginina com braço espaçador permitiu a purificação do pDNA sc com um bom grau de pureza e recuperação e as nanopartículas de MgCO3 provaram ser um sistema de entrega eficiente, sendo uma estratégia promissora para o desenvolvimento de uma vacina de DNA eficaz contra infeções provocadas pelo HPV

Severe interstitial pneumonia due to murine typhus in a patient returning from Bali

Murine typhus has been increasingly reported as a cause of fever in returning travelers from Southeast Asia. We report a case of a previously healthy traveler returning from Bali with an non-specific febrile illness which quickly progressed to a severe form of interstitial pneumonia. After a careful epidemiological evaluation and laboratory analysis, murine typhus was diagnosed.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Distinguishing Kingella kingae from Pyogenic Acute Septic Arthritis in Young Portuguese Children

This article belongs to the Special Issue Kingella kingae: Virulence Factors, Clinical Disease, and Diagnostics.(1) Background: We aim to identify clinical and laboratorial parameters to distinguish Kingella kingae from pyogenic septic arthritis (SA). (2) Methods: A longitudinal, observational, single-centre study of children 6 months ≤ 2 years, apyrexy and CRP ≤ 100 mg/L were significative, with an overall predictive positive value of 86.5%, and 88.4% for K. kingae. For this model, ROC curves were capable of differentiating (AUC 0.861, 95% CI 0.767-0.955) K. kingae SA from typical pathogens. (4) Conclusions: Age > 6 months ≤ 2 years, apyrexy and PCR ≤ 100 mg/L were the main predictive factors to distinguish K. kingae from pyogenic SA < 5 years. These data need to be validated in a larger study.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Tradução e validação da Clinician Administered PTSD Scale (CAPS-CA-5) em crianças e adolescentes portugueses

Introduction: The aim of this study was to translate and validate into European Portuguese the CAPS-CA-5 (Clinician Administered PTSD Scale for Children and Adolescents), a semi-structured scale for the diagnosis of post-traumatic stress disorder in children and adolescents, according to the DSM-5 criteria. Material and Methods: This study was developed in three stages. In the first stage, the translation and back-translation of CAPS-CA-5 into European Portuguese was carried out. In the second stage, the version obtained in the previous step was subjected to a pre-test. In the third stage, the final version of CAPS-CA-5, the KIDCOPE questionnaires and the Depression, Anxiety and Stress Scale-Children were applied to 101 children who had experienced at least one potentially traumatic event. The children included in this study were between seven and 18 years old and had a follow-up period in a Child Psychiatry or Pediatrics Clinic in one of the three hospitals involved in this project of at least one month. Results: Regarding the confirmatory factor analysis, our results show that the CAPS-CA-5 is a suitable psychometric instrument to assess the diagnosis and symptoms severity of post-traumatic stress disorder according to DSM-5. Convergent validity was comparable to its original version. Although there were negative relationships with almost all of its clusters, these were not statistically significant when applied with the positive coping strategies of the KIDCOPE. The European Portuguese version of the CAPS-CA-5 showed a good internal consistency (Cronbach’s α for the total scale was 0.89). Conclusion: The European Portuguese version of CAPS-CA-5 has similar psychometric properties to its original versionIntrodução: O objetivo deste estudo foi traduzir e validar para português europeu a CAPS-CA-5 (Clinician Administered PTSD Scale for Children and Adolescents), uma escala semiestruturada para o diagnóstico de perturbação de stress pós-traumático em crianças e adolescentes, de acordo com os critérios do DSM-5. Material e Métodos: Este estudo foi desenvolvido em três etapas. Na primeira, foi realizada a tradução e contra-tradução da CAPS- -CA-5 para português europeu. Na segunda etapa, a versão obtida anteriormente foi submetida a um pré-teste. Na terceira etapa, a versão final da CAPS-CA-5, os questionários KIDCOPE e a Escala de Depressão, Ansiedade e Stresse - Crianças foram aplicados em 101 crianças que experienciaram pelo menos um evento potencialmente traumático. As crianças incluídas neste estudo tinham entre sete e 18 anos e tinham um período de acompanhamento em consulta de Psiquiatria Infantil ou Pediatria de pelo menos um mês, num dos três hospitais envolvidos neste projeto. Resultados: Em relação à análise fatorial confirmatória, os nossos resultados mostram que a CAPS-CA-5 é um instrumento psico-métrico adequado para avaliar o diagnóstico e a gravidade dos sintomas de perturbação de stresse pós-traumático de acordo com o DSM-5. A validade convergente foi comparável à versão original. Embora tenha havido relações negativas com quase todos os seus clusters, estas não foram estatisticamente significativas quando aplicadas com as estratégias de coping positivo do KIDCOPE. A versão em português europeu da CAPS-CA-5 apresentou boa consistência interna (α de Cronbach para a escala total foi de 0,89). Conclusão: A versão em português europeu do CAPS-CA-5 possui propriedades psicométricas semelhantes à sua versão originalinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Sedação paliativa: análise bioética de um caso real em final de vida

Introduction: Ethically conscious Palliative Care represents complex challenges, particularly with regard to the management of refractory symptoms such as pain. Palliative sedation has been subject of intense debate, as it involves ethically controversial issues, leading health professionals, patients, and family members to be confronted with conflicts regarding its initiation. Objectives: To promote a bioethical reflexion on the institution of palliative sedation in patients actively dying. Material and methods: Based on a clinical case, we intend to develop a bioethical analysis of the topic of palliative sedation initiation and its complexity, based on the literature and ethical principles. Results: Ethical reflections on palliative sedation have been based on the principles of double effect, proportionality, and autonomy. These highlight the intentionality of the medical act and the existence of proportional reasons in the choice of palliative sedation, considering the patient’s autonomous decision. The principles on beneficence and non-maleficence define that the initiation of palliative sedation should be a beneficial act for the patient with the least negative impact possible. The health care provided must be fair and appropriate to the person and their clinical situation. Conclusions: Given the deontological conduct, palliative sedation is an ethically permissible therapy, which has nothing to do with medically assisted suicide or euthanasia. The decision-making process of its institution must occur as a result of a multidisciplinary teamwork, based on the will and/or the consent of the person that is actively dying. A compreensive approach to the patient is necessary, and the intervention of a team specialized in Palliative Care essential.Introdução: Cuidados Paliativos eticamente conscientes representam desafios complexos, nomeadamente no que concerne à abordagem de sintomas refratários como a dor. A sedação paliativa tem sido objeto de intenso debate, já que envolve questões eticamente controversas, levando os profissionais de saúde, doentes e familiares a confrontarem-se com conflitos relativamente à sua iniciação. Objetivos: Promover uma reflexão bioética sobre a instituição de sedação paliativa em doentes em final de vida. Materiais e métodos: Tendo por base um caso clínico, pretende-se desenvolver uma análise bioética do tema da iniciação de sedação paliativa e sua complexidade, tendo por base a literatura e princípios éticos. Resultados: As reflexões éticas sobre sedação paliativa têm sido baseadas nos princípios do duplo efeito, proporcionalidade e autonomia. Estes salientam a intencionalidade do ato médico e a existência de razões proporcionais na escolha de sedação paliativa, considerando a decisão autónoma da doente. Os princípios da beneficência e não maleficência definem que a iniciação de sedação paliativa deve ser um ato benéfico para a doente e do qual resulte o menor dano possível. Os cuidados de saúde proporcionados devem ser justos e adequados à pessoa e sua situação clínica. Conclusões: Atendendo à conduta deontológica, a sedação paliativa é uma terapêutica eticamente permissível, que em nada se relaciona com suicídio medicamente assistido ou eutanásia. O processo de tomada de decisão sobre a sua instituição deve ocorrer como resultado do trabalho de equipa multidisciplinar, a partir da vontade e/ou consentimento da pessoa em fim de vida. A abordagem integral do doente é necessária, e a intervenção por uma equipa especializada em Cuidados Paliativos fundamental

Influenza seroprotection correlates with predominant circulating viruses during 2014/15 and 2015/16 seasons in Portugal

Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da GripeBACKGROUND: Population immune profile for influenza is highly affected by circulating influenza viruses, thus changing the risk of infection for influenza. This study aims to assess influenza immunity in the Portuguese population by age groups, during 2014 and 2015 and establish a relationship between seroprotection and circulating influenza viruses in 2014/15 and 2015/16 seasons. METHODS: Two cross-sectional studies were developed based on a convenience serum sample collected in June 2014 (n=626) and July 2015 (n=675) in hospitals from mainland and Azores and Madeira.Serums equally represent all age groups. Antibody titers were evaluated by HI assay for strains recommended for seasonal influenza vaccine northern hemisphere,2014/15 and 2015/2016. Seroprevalences were estimated for each strain by age group and the association with seasonal cumulative influenza-like illness (ILI) rates for influenza virus during both seasons was analised. RESULTS: In June 2014 the highest seroprotection was observed for influenza A(H3) (39.0%; 95% CI: 36.2-43.8%) and A(H1)pdm09 (29.7; 95% CI: 26.3-33.4%), with higher levels in children 5-14 years old. In 2014/2015 a dominant circulation of influenza B/Yamagata was observed with high incidence rates in individuals under 65 years old, the ones that had lower seroprotection. Although before the start of the season high protection for A(H3) was observed, the circulation of the new drift A(H3) strains had gained an immunological advantage,in accordance with A(H3) elevated incidence rates observed during 2014/15. In July 2015 the highest seroprotection was observed for influenza B/ Yamagata (55.1%; 95% CI: 51.4-58.9%), 2.4 times the estimated 2014.This increase was even more pronounced in younger (≤ 4 years old), 6.3 times increase in 2015.This fact is in agreement with the predominant influenza B virus detected and the high ILI incidence rate observed in children during 2014/2015 epidemic. Seroprotection levels for influenza A in July 2015 were not significantly different from 2014.During 2015/16 season, influenza A(H1N1)pdm09 was predominant, with high incidence rate in < 65 year old. Influenza B/Victoria lineage,although detected at low levels increased in frequency, in agreement with the lowest level of seroprotection detected in the general population before the start of 2015/2016 season (21.8%; 95% CI: 18.7-24.0%). CONCLUSIONS There was a correlation between virus circulation, incidence rates for each age group and the previous seroprotection for seasonal influenza viruses.Our study highlights the value of measuring the serological profile for influenza to establishe risk groups for infection for which an increase preventive measures, including vaccination, should be fostered.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Abordagem geriátrica ampla na promoção de um envelhecimento ativo e saudável: componentes do modelo de intervenção AGA@4life

info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Measuring adherence to inhaled control medication in patients with asthma: Comparison among an asthma app, patient self‐report and physician assessment

Background Previous studies have demonstrated the feasibility of using an asthma app to support medication management and adherence but failed to compare with other measures currently used in clinical practice. However, in a clinical setting, any additional adherence measurement must be evaluated in the context of both the patient and physician perspectives so that it can also help improve the process of shared decision making. Thus, we aimed to compare different measures of adherence to asthma control inhalers in clinical practice, namely through an app, patient self-report and physician assessment. Methods This study is a secondary analysis of three prospective multicentre observational studies with patients (≥13 years old) with persistent asthma recruited from 61 primary and secondary care centres in Portugal. Patients were invited to use the InspirerMundi app and register their inhaled medication. Adherence was measured by the app as the number of doses taken divided by the number of doses scheduled each day and two time points were considered for analysis: 1-week and 1-month. At baseline, patients and physicians independently assessed adherence to asthma control inhalers during the previous week using a Visual Analogue Scale (VAS 0–100). Results A total of 193 patients (72% female; median [P25–P75] age 28 [19–41] years old) were included in the analysis. Adherence measured by the app was lower (1 week: 31 [0–71]%; 1 month: 18 [0–48]%) than patient self-report (80 [60–95]) and physician assessment (82 [51–94]) (p 0.05). There was a moderate correlation between patient self-report and physician assessment (ρ = 0.596, p < 0.001). Conclusions Adherence measured by the app was lower than that reported by the patient or the physician. This was expected as objective measurements are commonly lower than subjective evaluations, which tend to overestimate adherence. Nevertheless, the low adherence measured by the app may also be influenced by the use of the app itself and this needs to be considered in future studies.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Influenza severe cases in hospitals, between 2014 and 2016 in Portugal

Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da GripeBackground: Since 2009, the Portuguese Laboratory Network (PLNID) for Influenza Diagnosis has integrated 15 Laboratories in mainland and Atlantic Islands of Azores and Madeira. This PLNID added an important contribute to the National Influenza Surveillance Program regarding severe and hospitalized influenza cases. The present study aims to describe influenza viruses detected in influenza like illness (ILI) cases: outpatients (Outp), hospitalized (Hosp), and intensive care units (ICU), between 2014 and 2016. Methods: The PLNID performs influenza virus diagnosis by biomolecular methodologies. Weekly reports to the National Influenza Reference Laboratory ILI cases tested for influenza. Reports include data on detecting viruses, hospital assistance, antiviral therapeutics, and information on death outcome. Were reported during two winter seasons 8059 ILI cases,being 3560 cases in 2014/15 (1024 in Outp, 1750 Hosp, and 606 in ICU) and 4499 cases in 2015/2016 (1933 in Outp, 1826 Hosp, and 740 in ICU). Results: The higher percentage of influenza positive cases were detected in Outp in both seasons, 18% during 2014/15 and 20% in 2015/16. In 2014/15,influenza cases were more frequent in individuals older than 65 years old and these required more hospitalizations,even in ICU. In 2015/16,the influenza cases were mainly detected in individuals between 15-64 years old. A higher proportion of influenza positive cases with hospitalization in ICU were observed in adults between 45-64 years old.During the study period,the predominant circulating influenza viruses were different in the two seasons: influenza B and A(H3) co-circulated in 2014/15,and influenza A(H1)pdm09 was predominant during 2015/16. Even when influenza A is notthe dominant virus, A(H3) and A(H1)pdm09 subtypes correlate with higher detection rate in hospitalized cases (Hosp and UCI), with higher frequencies in adults older than 45. Influenza B,detected in higher proportion in outpatients, was frequently relatedwith influenza cases in younger age groups: 0-4 and 5-14 years old. Conclusions: This study highlights the correlation of theinfluenza virus type/subtype that circulates in each season with the possible need for hospitalization and intensive care in special groups of the population. Circulation of influenza A subtypes can cause more frequentdisease in individuals older than 45, with need of hospitalization including intensive care. On the other hand, influenza B is more frequently associated with less severe cases and with infection in children and younger adults. Influenza B circulation might predict lower number of hospitalizations.The identification of influenza type in circulation,byPLNID ineach season, could guide action planning measures in population health care.info:eu-repo/semantics/publishedVersio