Avaliação dos efeitos citotóxicos em Saccharomyces cerevisiae exposta a cianotoxinas

Dissertação de mestrado em Microbiologia Aplicada, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019O trabalho apresentado nesta Dissertação de Mestrado foi realizado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge sob a orientação direta da Doutora Elisabete Valério.As cianobactérias são microrganismos procariotas que se encontram maioritariamente em comunidades fitoplantónicas. Sob condições favoráveis, estas são capazes de atingir grandes densidades celulares (blooms). Algumas espécies de cianobactérias produzem cianotoxinas que podem ser prejudiciais para a saúde pública e animal. Das cianotoxinas conhecidas, foram escolhidas a Microcistina-LR (MC-LR) e a Cilindrospermopsina (CYL) para desenvolver este trabalho. Tendo em conta a frequente ocorrência e a elevada toxicidade da MC-LR, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu um valor limite de concentração desta toxina na água potável de 1 μg/L. Para a CYL ainda não há um valor guia, pelo que não está controlada. Os ensaios de viabilidade celular são muito usados para procurar moléculas com efeitos na proliferação celular ou efeitos tóxicos que possam levar à morte celular. Para realizar estes ensaios, foi selecionada a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), já anteriormente usada para investigar mecanismos moleculares de toxicidade da Microcistina-LR (MC-LR). Neste estudo foi usado o ensaio de Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), após exposição das leveduras a diferentes concentrações das cianotoxinas. Neste ensaio, células viáveis com metabolismo ativo convertem o reagente MTT num produto de cor roxa, que nos permite quantificar a viabilidade das células testadas, enquanto que células mortas não conseguem fazer essa conversão. Testou-se ainda uma enzima lítica, a Liticase, a qual vai atuar e digerir a camada externa da parede celular. Para além do ensaio MTT, foi também testado o ensaio de coloração com Azul Tripano (AT), que é usado para determinar o número de células viáveis (que excluem o corante) presentes numa suspensão, onde é feita a contagem das células por observação direta ao microscópio em Câmara de Neubauer. Este trabalho permitiu dar uma contribuição numa área ainda pouco explorada, referente ao uso de métodos de análise de viabilidade celular para detetar efeitos citotóxicos provocados por duas cianotoxinas, utilizando S. cerevisiae como organismo eucariota modelo. Como conclusões, dos dois métodos usados neste estudo, o ensaio MTT é o mais fiável na medida em que o comportamento dos controlos reflete claramente o que está descrito na literatura para os mesmos (p ≤ 0,05). Contudo, o método AT revelou ser bastante reprodutível. No que diz respeito às toxinas, não se observam efeitos citotóxicos significativos em S. cerevisiae (p > 0,05) com nenhuma das duas toxinas testadas. Quando foi usada liticase de forma a facilitar a entrada das toxinas nas células, estes ensaios também não refletiram efeitos citotóxicos significativos (p > 0,05).Cyanobacteria are prokaryotic microorganisms found mostly in phytoplanktonic communities. Under favorable conditions, they are capable to reach high cell densities (blooms). Some cyanobacterial species produce cyanotoxins that can be harmful to public and animal health. Among the known cyanotoxins, Microcystin-LR (MC-LR) and Cylindrospermopsin (CYL) were chosen to develop this work. Given the frequent occurrence and high toxicity of MC-LR, World Health Organization (WHO) has established a guideline value for this toxin in drinking water of 1 μg / L. There is still no guideline value for CYL yet, so this toxin is not controlled. Cell viability assays are widely used to look for molecules with effects on cell proliferation or toxic effects that may lead to cell death. To perform these assays, the yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), already previously used to investigate molecular mechanisms of Microcystin-LR (MC-LR) toxicity, was selected to perform this study. In this study the 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium (MTT) bromide assay was used after exposure of yeast cells to different concentrations of these two cyanotoxins. In this assay, viable cells with active metabolism convert MTT reagent into a purple product, which allows us to quantify the viability of the cells tested, while dead cells cannot make this conversion. We also tested a lytic enzyme, Liticase, which will act on the outer layer of the cell wall, degrading it. In addition to the MTT assay, the Trypan Blue staining assay, which is used to determine the number of viable cells (able to exclude the dye) that are present in a suspension, was also tested. The cells are counted by direct observation under the microscope in a Neubauer Chamber. This work intended to give a contribution to an area still under-explored, related with the use of cell viability tests to evaluated cytotoxic effect of two cyanotoxins, and the yeast S. cerevisiae as eukaryotic model organism. As conclusions, from the two methods used in this study, the MTT assay is the most reliable and reproducible as the behavior of the controls clearly reflects what is described in the literature for them (p ≤ 0.05). For toxins, no significant cytotoxic effects are observed in S. cerevisiae (p > 0.05). Liticase was tested to facilitate the toxins entrance into the cells, however, these trials also did not reflect significant effects (p > 0.05).N/

VAGINAL BIOPOLITICS

Vaginal Biopolitics considers the relationship between biopower and the vulva and vagina. Although feminist scholars have theorized reproduction through the lens of biopolitics and examined vaginas in some instances, there remains an absence of analyses that explore the relationship between biopower and female genitalia. This absence is interesting given that the female genitalia are a rich site for such an inquiry: female genitalia firmly straddle the boundary between the erotic body and the reproductive body and it is in this sense that they become biopolitical. The intervention of biopower produces the vulva and vagina as that which can be made measurable and controllable by discourses, practices, and institutions of power. Taking up “vulval aesthetics” (i.e., Brazilian waxing, vajazzling, pubic hair and labia dyes) and female genital cosmetic surgery, I argue that the introduction of aesthetics and morphology has become another dimension of disciplinary control that produces and regulates women based on their erotic, and not reproductive, potential and capacity

Chemical and physical pretreatments of microalgal biomass

Non-axenic microalga Chlorella sorokiniana was cultivated in batch cultures, and its total sugar composition was determined. The microalga under study showed a total sugar concentration of 21.44 ± 0.46% (w/w). The effects of freeze-drying, oven-drying, freezing and thawing, chemical and the combination of hydrothermal and chemical pretreatments were evaluated. In the combined pretreatment different concentrations of H2SO4 and reaction times were also optimized. It was possible to determine that the sugar extraction yields more significant were 59.5% for the lyophilization, 6.2% with 6 cycles of freeze and thawing and around 100% for 2 and 4% (v/v) of H2SO4 at 121 °C for 30 min. Some of the methods that were described in this study are interesting to facilitate cost-efficient conversion of microalgal biomass into biofuels.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Seismostratigraphic model of the Sines contourite drift (SW portuguese margin) - depositional evolution, structural control and paleoceanographic implications

Tese de mestrado, Geologia (Estratigrafia, Sedimentalogia e Paleontologia) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017The Sines Contourite Drift, located in the Southwest Portuguese margin, is a distal drift of the Contourite Depositional System of the Gulf of Cadiz, built by the influence of the Mediterranean Outflow Water (MOW). This drift is located between 1000 and 2000 m water depth on the Alentejo margin continental slope. The Sines Drift is bounded by four major morphologic features: the 1.4 km high Pereira de Sousa Fault escarpment to the west, the upper continental slope to the east and the Setúbal and São Vicente canyons to the north and south, respectively. This work presents a seismic stratigraphic analysis and proposes an evolutionary model for the Sines Drift, as well as the identification of its main driving mechanisms and constraints. In pursuing such objectives, the following dataset was used: i) new and unpublished seismic reflection profiles acquired during the MOWER/CONDRIBER cruise in September-October 2014; ii) pre-existent multichannel seismic profiles BIGSETS, STEAM and GSI; iii) SWIM multibeam bathymetry; iv) lithostratigraphic and chronological data from Site U1391 of IODP (Integrated Ocean Drilling Program) Expedition 339 carried out in 2011-2012. Three evolutionary phases are identified for the Sines Drift development: 1) a sheeted-contourite-drift phase (<5.3-3.2 Ma) built since the Late Miocene by an initially weak flowing MOW; 2) a mounded-contourite-drift phase (3.2-0.7 Ma) from Late Pliocene to Early Quaternary times characterized by a mounded drift in the south and sheeted in the north, with a succession of sinuous N-S paleomoats in the east built as a result of a MOW enhancement; and 3) a plastered-contourite-drift phase from Mid-Pleistocene (0.7 Ma) till the present-day, characterized by the present depositional (sandy-muddy drifts) and erosional (moats) contourite features associated with two major events of MOW intensification. The growth of the Sines Drift was constrained by seafloor paleomorphologies that resulted from the rifting processes of the Southwest Portuguese margin, inherited from the Mesozoic rifting phases. The paleomorphologies provided accommodation space for drift growth and conditioned its overall architecture. The N-S horsts and grabens built during the Mesozoic rifting confined drift deposition and did not allow its lateral migration. The formation of the Sines Drift has also been influenced by climatic fluctuations and sea-level changes especially during the Quaternary. The succession of sinuous paleomoats beneath the present-day moat suggests a persistent and northward flowing MOW with several phases of enhancement. It was also perceived that the São Vicente and Setúbal canyons took most of the downslope sediment supply, as well as the occurrence of mass-movement processes in the west associated with the steep gradient of the Pereira de Sousa escarpment. All these results suggest the Sines Drift had a complex evolution controlled by several factors at different scales.Contornitos são corpos sedimentares depositados ou retrabalhados por correntes de fundo que circulam paralelamente aos contornos batimétricos da margem. A formação dos contornitos é afetada, a longo e curto prazo, por fatores externos e/ou internos que podem modificar o padrão de circulação das correntes. Os depósitos contorníticos podem atingir dimensões consideráveis com vários quilómetros de largura e comprimento, os quais conservam informação paleoclimática e paleoceanográfica. Os contornitos também desempenham um papel importante no estudo dos riscos naturais submarinos, associados à ocorrência de deslizamentos, e na indústria de exploração petrolífera, como potenciais reservatórios e selantes. Um extenso Sistema Deposicional Contornítico (CDS, Contourite Depositional System) formou-se no Golfo de Cádis, desde o fim do Miocénico Superior (5.33 Ma), pela ação da Água de Saída Mediterrânica (MOW, Mediterranean Outflow Water). Este CDS abrange vários depósitos contorníticos e outras formas sedimentares, deposicionais e erosivas, ao longo da margem continental Sul e Sudoeste Ibérica. O Contornito de Sines, localizado na margem Sudoeste Portuguesa, é um contornito distal do CDS do Golfo de Cádis. Este corpo situa-se entre 1000 e 2000 m de profundidade na Bacia do Alentejo, com aproximadamente 70 km de comprimento, 40 km de largura, 1 km de espessura, morfologia assimétrica e configuração agradante com inclinação para oeste. O Contornito de Sines está limitado por quatro morfoestruturas: a escarpa da Falha Pereira de Sousa com 1.4 km de altura a oeste, a plataforma continental a este e os canhões de Setúbal e São Vicente a norte e sul, respetivamente. Este trabalho apresenta uma análise sismostratigráfica e propõe um modelo evolutivo para o Contornito de Sines, além da identificação dos principais mecanismos e constrangimentos que controlaram a sua evolução. Para atingir estes objetivos, recorreu-se ao seguinte conjunto de dados: i) linhas de reflexão sísmica multicanal não publicadas, adquiridas durante a campanha MOWER/CONDRIBER em setembro-outubro de 2014; ii) linhas de reflexão sísmica multicanal, pré-existentes, dos projetos BIGSETS, STEAM e GSI; iii) batimetria multifeixe SWIM e iv) dados litostratigráficos e cronológicos da sondagem U1391 da Expedição 339 do IODP (Integrated Ocean Drilling Program), realizada em 2011-2012. A metodologia utilizada durante este trabalho consistiu em interpretação de estratigrafia sísmica, análise batimétrica, calibração e correlação cronostratigráfica dos horizontes e unidades sísmicas com a sondagem U1391 e representação gráfica das propriedades litológicas e físicas da sondagem referida. A interpretação sismostratigráfica dos dados apresentados permitiu identificar seis unidades sísmicas (U1 a U6), com idades compreendidas entre o Miocénico Superior e o Presente. Estas unidades foram depositadas sobre uma superfície basal erosiva (B) e estão separadas por cinco horizontes sísmicos (H2 a H6), que marcam descontinuidades na sucessão sísmica. As unidades sísmicas apresentam fácies transparente a maior profundidade, com configuração em cunha, que transita para uma fácies estratificada de elevada amplitude e configuração lobular a menor profundidade. A análise litostratigráfica da sondagem U1391 permitiu a calibração cronostratigráfica das unidades sísmicas interpretadas, bem como a caracterização da sua litologia. As unidades U2 (onde a sondagem U1391 atingiu a sua máxima profundidade) e U3, situadas entre os 671.5 e 566.1 m de profundidade, têm idades compreendidas entre o Pliocénico Superior e o Quaternário Inferior (3.2-2.5 Ma). Estas unidades são constituídas por vasa carbonatada, de composição dolomítica (~0.87 m) aos 632 m de profundidade e um debrito (~0.35 m) aos 604 m de profundidade. Às unidades U4 e U5, recuperadas entre 566.1 e 196.1 m de profundidade, foram atribuídas idades entre o Pleistocénico Inferior a Médio (2.5-0.7 Ma) e são constituídas por contornitos finos intercalados por sucessões de vasa carbonatada. A unidade sedimentar mais recente, U6, depositou-se desde o Pleistocénico Médio (0.7 Ma) até ao Presente. A unidade U6 é composta por alternância de depósitos contorníticos finos e grosseiros recuperados entre 196.1 m de profundidade e o fundo oceânico. Estes depósitos apresentam sucessões com bigradação, gradação normal e inversa (separadas por contactos gradacionais, bioturbados e, mais raramente, descontinuidades). Esta unidade contém seis intervalos contorníticos arenosos, areias finas a grosseiras, a 2, 50, 83, 96, 115 e 150 m de profundidade. Foram identificadas três fases na evolução deposicional do Contornito de Sines: 1) uma primeira fase de contornito com configuração em camada (sheeted drift) (<5.3-3.2 Ma), construída desde o final do Miocénico Superior, por uma corrente MOW de fraca intensidade; 2) uma fase de contornito monticular (mounded drift) (3.2-0.7 Ma), desde o Pliocénico Superior ao Quaternário Inferior, caracterizada por uma morfologia monticular a sul e agradante a norte, com uma sucessão de paleo-fossas sinuosas ao longo da margem continental a este, que atestam a ocorrência de uma intensificação moderada a elevada da MOW e 3) uma fase final de contornito agradante (plastered drift), desde o Pleistocénico Médio (0.7 Ma) até ao Presente, caracterizada pelas atuais formas deposicionais (contornitos argilosos a arenosos) e erosivas (fossas), associadas a dois eventos de intensificação da MOW. A formação do Contornito de Sines terá tido início no Miocénico Superior, possivelmente após o final da Crise de Salinidade do Messiniano, que afetou a região Mediterrânica entre 5.33 e 5.96 Ma, a qual teve repercussões drásticas para a circulação oceânica entre o Mediterrâneo e o Atlântico. Após a Crise de Salinidade do Messiniano e o restabelecimento da circulação através do Estreito de Gibraltar, a MOW possuía fraca intensidade. A sucessão de paleo-fossas subjacentes à fossa atual sugere uma corrente semipermanente e persistente ao longo da margem Sudoeste Portuguesa, em direção a norte, com vários eventos de intensificação. A edificação do Contornito de Sines foi constrangida pelas paleo-morfologias do fundo do mar que resultaram dos processos de rifting, herdados das fases de rifting Mesozóicas na margem Sudoeste Portuguesa. Estas paleo-morfologias forneceram espaço de acomodação para o crescimento do contornito e condicionaram a sua arquitetura deposicional. Os horsts e grabens, com orientação aproximada N-S, resultantes do rifting Mesozóico, confinaram a formação do contornito impedindo a sua migração lateral. A edificação do Contornito de Sines foi também influenciada por variações climáticas e eustáticas, especialmente durante a sua última fase de desenvolvimento. Durante o Quaternário, os eventos de intensificação da MOW correlacionam-se com dois eventos climáticos do Pleistocénico, registados na região Mediterrânica e nos depósitos contorníticos do Golfo de Cádis: o Middle Pleistocene Revolution (0.7-0.78 Ma) e o Late Quaternary Discontinuity (0.4 Ma). Os sedimentos que constituem o Contornito de Sines são maioritariamente sucessões contorníticas de composição carbonatada, com uma maior componente biogénica na primeira fase de desenvolvimento (sheeted drift), e uma maior componente siliciclástica (contornitos arenosos), na última fase de desenvolvimento (plastered drift). A componente biogénica na primeira fase provavelmente indica a ocorrência de fenómenos de afloramento costeiro e deposição hemipelágica ao longo da margem Oeste Portuguesa, enquanto que a maior contribuição siliciclástica na última fase está associada a eventos de intensificação da MOW. O Contornito de Sines evoluiu de um sistema deposicional inicialmente carbonatado para siliciclástico na última fase de desenvolvimento, testemunhando variações de intensidade da MOW. Os sedimentos carreados para a margem do Alentejo são maioritariamente fornecidos por deposição hemipelágica, fenómenos de afloramento costeiro e resultante de erosão da margem continental pela circulação da MOW. O Contornito de Sines não é significativamente afetado por processos gravíticos, sendo registado apenas uma ocorrência no Pliocénico (debrito de ~0.35 m). A baixa incidência de processos gravíticos resulta, provavelmente, da morfologia da margem e da existência dos canhões de Setúbal e São Vicente, que canalizam grande parte do material deslocado. No entanto, existem depósitos de movimento de massa que afetam o sector ocidental do Contornito de Sines, que estão associados ao elevado declive da escarpa da Falha Pereira de Sousa. A formação destes depósitos poderá estar associada a vários fatores intrínsecos e extrínsecos à área em estudo. No que se refere aos fatores intrínsecos, destaca-se a potencial geração de planos de descolamento nas interfaces entre sedimentos contorníticos arenosos e vasosos caso se encontrem sobre pressão, com excesso de fluídos e/ou intercalados por sedimentos menos porosos. No que respeita aos fatores extrínsecos, a atividade sísmica registada na margem Sudoeste Ibérica poderá espoletar a ocorrência de deslizamentos submarinos no Contornito de Sines. Os resultados obtidos sugerem que o Contornito de Sines teve uma evolução complexa, controlada por vários fatores, a diferentes escalas

All Eyes on You: The Impact of Increased Surveillance and Media Publicity on Police Identity

The recent surge in media footage surrounding police killings of unarmed black men clearly signifies the national concern for police violence, yet researchers have yet to study police identity in connection with such publicized inequality. This qualitative study closes this gap in research by addressing the following questions: “How do patrolling officers think about and experience their jobs at this particular historical juncture of increased internet and media exposure?” and, “How does the mass exposure and scrutiny of police violence shape police perceptions of their work and impact their work identity?” Face to face semi-structured interviews, symbolic interactionism, and interpretive research methods were used to uncover how eighteen current Bay Area patrolling officers come to perceive their collective identity as threatened and the four strategies they use to cope. First, some officers strengthen their collective identity by isolating themselves from civilians and spending more time on and off-duty strengthening their bonds with fellow likeminded officers. Secondly, a number of officers separate their collective and individual identities by concealing their occupational identities when off-duty. Thirdly, some officers deliberate over the choice of remaining in the occupation, and lastly, officers work towards preserving their collective identity by avoiding “negative” media and by using a bad apple narrative that distances the “few bad police officers” from the larger group of heroes. These four coping strategies, in turn, hold great potential in negatively impacting police-civilian relationships

The impact of integrase inhibitors on the development of hepatic steatosis and fibrosis in HIV-monoinfected patients

Introdução: A Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) tem uma elevada prevalência nos doentes com infeção pelo VIH. Uma vez que os inibidores da integrase (INSTIs) são usados a nível mundial e têm sido associados a ganho de peso, é importante determinar o seu efeito no desenvolvimento de NAFLD e Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) nestes doentes. O objetivo deste estudo foi determinar o impacto dos INSTIs no risco de desenvolver esteatose e fibrose hepáticas no doente com infeção pelo VIH, através do uso do Hepatic Steatosis Index (HSI), do Fibrosis-4 Index (FIB-4), do BARD score e do NAFLD Fibrosis Score (NFS). Métodos: Foi realizado um estudo observacional de coorte retrospetivo unicêntrico em doentes com infeção pelo VIH que nunca tinham realizado terapêutica antirretroviral (TAR) e que iniciaram INSTIs entre dezembro de 2019 e janeiro de 2022. Os dados foram recolhidos na baseline, aos 6 e aos 12 meses após o início da terapêutica. As características demográficas, clínicas e laboratoriais e os índices de esteatose e fibrose hepáticas foram comparados entre a baseline e a última visita, aos 12 meses. Modelos de regressão linear foram realizados de modo a analisar as associações entre os dados analíticos na baseline e a variação dos índices hepáticos ao longo dos 12 meses de seguimento. Os modelos foram realizados com e sem ajuste para a idade e para o sexo. Resultados: 99 doentes foram incluídos no estudo. Oitenta e dois por cento eram do sexo masculino e a mediana de idades era 36 anos. Foi observado um aumento significativo do índice de massa corporal, do HDL, da contagem de plaquetas, da albumina e da creatinina e uma diminuição significativa dos níveis de AST. O HSI não demonstrou diferenças estatisticamente significativas durante o seguimento (p=0.114). Foi observada uma diminuição significativa do FIB-4 (p=0.007) e do NFS (p=0.002). O BARD score mostrou um aumento significativo (p=0.006). No modelo de regressão linear, foi demonstrada uma associação negativa significativa entre o VIH RNA e a variação do FIB-4 (β= -0.08, 95% CI [-0.16 to -0.00], p=0.045), sugerindo que cargas mais elevadas de VIH RNA na baseline se associam com uma maior diminuição do FIB-4. Conclusão: Os INSTIs parecem não demonstrar impacto na esteatose hepática, embora tenham sido associados a um aumento significativo do índice de massa corporal. Isto pode ser explicado pelo efeito direto do uso de regimes terapêuticos com dolutegravir e/ou pelo "return-to-health effect" observado com o início da TAR. Por fim, os INSTIs foram associados a uma redução do risco de fibrose hepática nos doentes com monoinfeção pelo VIH, possivelmente devido ao seu efeito na supressão vírica.Background: Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) has a high prevalence among patients with HIV infection. Since Integrase Strand Transfer Inhibitors (INSTIs) are used worldwide and have been associated with weight gain, we must determine their effect in the development of NAFLD and Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) in these patients. The aim of this study was to explore the impact of INSTIs in the development of liver steatosis and fibrosis in the patient with HIV infection, using Hepatic Steatosis Index (HSI), Fibrosis-4 Index (FIB-4), BARD score and NAFLD Fibrosis Score (NFS). Methods: We performed a monocentric, retrospective cohort study in HIV-monoinfected cART-naïve patients that initiated INSTI based regimens between December 2019 and January 2022. Data was collected at baseline, 6 and 12 months after initiation. Demographic, clinical and laboratory characteristics, hepatic steatosis, and fibrosis scores were compared between baseline and last visit at 12 months. Linear regression models were performed to analyse the associations between analytical data at baseline and hepatic scores variation during the 12 months of treatment. Models were performed unadjusted and adjusted for age and sex. Results: 99 patients were included in our study. Eighty-two percent were male and median age was 36 years. We observed a significant increase in body mass index (BMI), HDL, platelet count, albumin, and creatinine and a significant decrease in AST levels. HSI showed no statistically significant differences during follow-up (p=0.114). We observed a significant decrease in FIB-4 (p=0.007) and NFS (p=0.002). BARD score showed a significant increase (p=0.006). The linear regression model demonstrated a significant negative association between baseline HIV RNA and FIB-4 change (β= -0.08, 95% CI [-0.16 to -0.00], p=0.045), suggesting that higher HIV RNA loads at baseline were associated with a greater decrease in FIB-4. Conclusion: INSTIs seem to have no impact on hepatic steatosis, even though they were associated with a significant increase in BMI. This might be explained by the direct effect of a dolutegravir-containing regimen and/or by the "return-to-health effect" observed with cART initiation. Furthermore, INSTIs were associated with a reduction in risk of liver fibrosis in HIV-monoinfected patients, possibly due to their effect on viral suppression

Evaluating cortical transcriptomic differences between Alzheimer’s disease PSEN1- mutated mouse models and human patients, and their implications in drug development

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença de Alzheimer (AD) é uma doença progressiva e irreversível do sistema nervoso central, sendo atualmente a demência mais prevalente a nível mundial, cuja incidência aumenta com o avançar da idade. Esta patologia caracteriza-se pela acumulação extracelular de placas insolúveis de péptido amiloide-beta (A), e pela acumulação intracelular de proteína tau irregularmente hiperfosforilada sob a forma de agregados fibrilares. Outras características patofisiológicas incluem morte neuronal e perda de sinapses, exacerbação do sistema imunitário e inflamação crónica, e atrofia cerebral. O presente rápido envelhecimento da população mundial prevê, com o aumento da proporção de população envelhecida, um igual aumento da prevalência e incidência de doenças neurodegenerativas associadas à idade, como é o caso das demências, categoria em que se inclui a AD. Atualmente não existe um tratamento eficaz que abrande ou impeça a progressão desta doença, o que, simultaneamente com a escassez de aprovação de novos medicamentos que se tem sentido na última década, constitui uma preocupação social, económica e de saúde pública. Adicionalmente, a maioria dos ensaios clínicos em doenças neurodegenerativas, inclusive em AD, apresenta elevadas taxas de insucesso, especialmente a nível dos ensaios de toxicidade e eficácia. O insucesso nesta fase dos ensaios reflete as dificuldades de transpor os resultados obtidos através dos modelos animais durante os estudos pré-clínicos para a doença humana, sugerindo que esta não será bem representada por estes modelos. Neste sentido, é imperativo avaliar as diferenças moleculares que distinguem os modelos animais e os doentes com Alzheimer em termos da fisiopatologia da doença, e também desenvolver diferentes abordagens que possam auxiliar a descoberta de modelos animais mais representativos da AD. Nesse sentido, este projeto propõe avaliar os perfis de alteração de expressão génica (também referenciadas como alterações transcritómicas) entre amostras de cérebro de controlos e doentes com AD, tanto para amostras humanas como para amostras obtidas a partir de modelos animais, sendo que em ambas as espécies as amostras relativas aos portadores de um fenótipo de doença apresentam mutações no gene da presenilina 1 (PSEN1). Com esta abordagem pretendeu-se comparar os perfis de alterações transcritómicas induzidos pela AD no cérebro obtidos para cada uma das espécies através de modelação linear de dados de microarrays, sendo que para essa análise foi considerada, para além da condição (controlo versus doente), outra informação sobre as amostras como a idade do dador. A interpretação biológica dessas alterações transcritómicas foi feita por análise de alguns genes encontrados diferencialmente expressos, e também com recurso a Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), um método que identifica as vias metabólicas mais desreguladas, tendo por base o perfil das alterações transcritómicas entre as condições em estudo. As amostras de ratinhos com AD consideradas no presente estudo dividem-se em três categorias: (1) animais com mutações exclusivamente a nível do PSEN1, e animais que adicionalmente são portadores de mutações no gene APP, podendo estes ser (2) heterozigóticos ou (3) homozigóticos. Os três modelos mostraram inexistente ou fraca correlação com a doença humana, aquando da comparação dos perfis de alteração transcritómica. Adicionalmente, os dois primeiros modelos não apresentaram diferenças de expressão significativas entre as amostras controlo e as amostras doentes. Considerando que o modelo homozigótico com mutações em PSEN1 e APP foi o único a apresentar alterações a nível do perfil transcritómico, todas as análises e comparações descritas consideraram apenas estes ratinhos. Os resultados mostram que tanto em humano como em ratinho portadores de doença de Alzheimer existe uma sobre-expressão dos genes envolvidos nos mecanismos de regulação do sistema imunitário, nomeadamente a nível de inflamação crónica, e uma diminuição do transporte de neurotransmissores. As restantes vias mais alteradas com a AD diferem entre humano e ratinho, embora a maioria esteja alinhada com a bibliografia existente sobre a patologia. Algumas vias metabólicas também surgiram inversamente desreguladas entre as duas espécies. Genes envolvidos em vias metabólicas de diferenciação, proliferação e apoptose celular, processamento de DNA e RNA, e mecanismos relacionados com o sistema cardiovascular surgiram sobre-expressos na doença humana; enquanto genes envolvidos em vias associadas com atividade sináptica e neuronal, canais de transporte de membrana, e com a diabetes surgiram sub-expressos. Contrariamente, no caso do ratinho, verificou-se um exacerbar da diabetes, juntamente com o de vias metabólicas relacionadas com a colesterol e interações celulares; e sub-expressão de genes envolvidos na atividade mitocondrial e respiração celular, e em mecanismos de expressão génica, nomeadamente a nível do spliceossoma. Realizou-se também uma análise conjunta dos dados de humano e ratinho, com a qual se observou uma maior variância de expressão génica entre os controlos humanos e os indivíduos doentes humanos, comparativamente com os ratinhos controlo e doentes, reforçando a possibilidade de que o desenvolvimento e a progressão da doença em ratinho não sejam demarcados o suficiente para que, a nível do transcritoma, exista uma explícita diferenciação entre as condições de doença e de não-doença. As diferenças de expressão génica para os dados conjuntos foram modeladas linearmente, incorporando nos modelos, como variáveis, informação não só sobre a idade e condição das amostras, mas também sobre a espécie a que pertencem. Deste modo, foi possível isolar o efeito doença do efeito espécie e obter as diferenças transcritómicas ocorridas mais preponderantemente em humano e em ratinho, bem como as diferenças comuns às duas espécies, ou seja, independentes da espécie. Esta análise revelou que a diminuição da atividade neuronal e sináptica está associada à AD, mas que surge menos afetada nos modelos de ratinho comparativamente aos doentes humanos. Quanto aos genes envolvidos nos mecanismos de regulação do sistema imunitário que também se revelam sobre-expressos na doença geral, encontraram-se mais sobre-expressos na doença humana do que no modelo de ratinho considerado. Estas subtis diferenças entre a informação transcritómica do humano e do ratinho sugerem que as dinâmicas associadas à AD possam ser específicas da espécie, reforçando a necessidade de ajustar os modelos animais para que simulem mais eficientemente a patologia humana. Este projeto teve ainda como objetivo encontrar compostos e perturbações genéticas (knockdowns ou sobre-expressões) com potencial de recapitular as diferenças de expressão mais específicas da AD humana, para que possam ser administrados/manipulados em modelos de ratinho com o intuito de melhorar modelos já existentes ou encontrar um novo e aperfeiçoado modelo animal que replique de forma mais fidedigna as alterações decorridas da doença humana. Adicionalmente, também serão de interesse perturbações químicas e genéticas com capacidade de replicar perfis transcritómicos antagónicos daquele encontrado para a generalidade da doença, que possam ser utilizados como novas terapêuticas ou como objetos de estudo dos mecanismos associados à AD. Para o propósito mencionado acima, recorreu-se à base de dados do Connectivity Map, que inclui informação transcritómica para diversas linhas celulares, antes e após lhes serem administrados diferentes compostos ou alterações genéticas. Usando um software desenvolvido no nosso laboratório, cTRAP, podemos, a partir dos perfis de alteração de expressão genética encontrados no nosso estudo, obter as perturbações químicas e genéticas que recapitulem as alterações transcritómicas do nosso interesse. No tempo do estudo, analisou-se apenas as perturbações químicas, fazendo uma separação entre dois grupos de compostos: (1) aqueles com indicações para doenças do foro neurológico e (2) os com indicação de foro não neurológico. Para cada uma das duas categorias foram selecionados os 10 compostos mais relevantes, isto é, aqueles que estatisticamente estão mais correlacionados com as alterações transcritómicas de interesse. Apenas compostos em fase III de desenvolvimento clínico ou disponíveis no mercado foram considerados. A análise similar das perturbações genéticas fica então referenciada para trabalho a desenvolver no futuro. Adicionalmente, dada a complexidade celular do sistema nervoso central em termos de heterogeneidade e proporção celular, a qual é afetada em estados de doença, e especificamente neste caso de doenças neurodegenerativas, seria de interesse acrescentar uma assinatura que distinga os vários tipos celulares à informação proporcionada ao modelo linear utilizado para derivar os perfis de alteração transcritómica. Desta forma, seria possível distinguir alterações de expressão genética associadas a mudanças na composição celular daquelas relacionadas com mecanismos específicos da AD. O objetivo final do projeto será testar perturbações químicas e genéticas escolhidas cuidadosamente, em linhas celulares e em modelos de ratinho, e testar a sua capacidade em gerar um modelo animal cujo desenvolvimento e progressão da AD seja mais similar ao observado em condições de doença humana; bem como o potencial dos mesmos em reverter características desta patologia.Alzheimer’s disease (AD) is a progressive and irreversible neurodegenerative disease of the central nervous system, being nowadays considered the most prevalent age-related dementia worldwide. AD pathology is characterized by the extracellular deposition of insoluble amyloidbeta plaques, and the intracellular accumulation of abnormally phosphorylated tau protein into neurofibrillary tangles. Other hallmarks include neuronal death, exacerbation of the immune system and chronic inflammation, synaptic loss, and brain atrophy. The world population is rapidly aging, and an increase in the older population is foreseen, as well as in the prevalence of dementias such as AD. Currently, there is no effective treatment to neither decrease nor cease the damage of this disease, which, allied with the lack of new approved medicines since 2003, comprises a social, economic and health burden. Moreover, clinical trials have been exhibiting high failure rates, especially during toxicity and efficacy assessments, which implies a poor representation of the actual human disease in preclinical animal models. Thus, it is vital to evaluate what molecularly distinguishes them in terms of disease pathophysiology, and how can they be improved to better represent the human disease. On this note, this project purposes to assess the dissimilarities between the AD-induced gene expression (i.e. transcriptomic) alterations between preclinical AD mouse models and human AD patients, both carrying mutations in the PSEN1 gene. For this purpose, microarray data was used for both species, and gene expression differences between AD and non-AD conditions were assessed through linear modelling for each specie. To unveil the biological meaning behind this changes, gene set enrichment analyses (GSEA) were performed. Mechanisms associated with the immune system, namely with the inflammatory response, appear up-regulated in both human AD patients and mouse models, whereas neurotransmitter trafficking processes appear down-regulated in both. The majority of the other most strikingly disrupted pathways varied between human and mouse, but were often in accordance with prior scientific knowledge on AD. However, a few of them appeared differently altered between species, such as diabetes mellitus associated pathways, that appeared down-regulated in human patients and up-regulated in AD mouse models. The analysis of the joint dataset (resulting of merging the human and mouse datasets) unveiled synaptic and neuronal activity -related pathways as down-regulated in the disease common to both species, but less so in mouse AD compared to human patients. On the other hand, immune system genes and pathways were commonly up-regulated in the disease but more so in the human patients. These subtle variations between human and mouse transcriptomic information suggest that disease dynamics are potentially species-specific and reinforce the need to generate models that are able to more effectively replicate the human disease. Additionally, we also identified compounds able to induce GE alterations opposite to those observed for the species-common component of the disease, as well as those capable of emulating human-specific AD-induced transcriptomic alterations. Those candidate compounds can be further explored as therapeutics to combat AD or as a vehicle to obtain novel and innovative mouse models that more effectively replicate the transcriptomic signature of the actual human disease. Two groups of compounds were considered: those with prescription information for neurology-related conditions and those prescribed for other conditions. Moreover, only compounds positioned at the phase III of clinical trials or already available in the market were considered. For future work, it would be possible to perform a similar analysis but to assess genetic perturbations (i.e. knockdowns or overexpression) rather than compounds, which could, likewise, be able to induce an opposite transcriptomic profile to that of the species-common disease, and of those that could promote the development of a human AD signature in a mouse model. Moreover, given the complexity of the brain in terms of cell type composition and interactions between cell types, and the consequences of a neurodegenerative disease upon these, it would be interesting to incorporate brain cell-type-specific signatures as explanatory variables in the linear model used to estimate GE changes, in order to decouple AD-associated cell-type-specific and systemic GE alterations from brain cellular composition changes (namely neuronal loss). The end goal of the present project would be to evaluate the effects of carefully selected genetic perturbations and compounds in cell lines and mouse models, in order to obtain a model able to more accurately develop the human AD.Com o patrocínio do Instituto de Medicina Molecular (iMM) João Lobo Antunes

Elective Breast Surgery and Body Image: A Poststructural-Phenomenological Investigation

This dissertation examines what happens when elective breast surgery intervenes on women at the level of their body images. In this theoretical-empirical project, I compare practitioner discourses and patient narratives of the impact of breast augmentation and reduction surgeries on female body image. To this end, I conducted two case studies: first, a feminist-poststructuralist discourse analysis of practitioner-authored studies on elective breast surgery and body image, as published in peer-reviewed journals; and second, a feminist-phenomenological inquiry into womens first-hand accounts of their experiences of these surgical procedures. I argue that body image is, at one and the same time, an uncritically accepted concept that encourages normative understandings of surgical outcomes and a productive lens through which women make sense of how surgery instigates a reorientation of the body and its habits. The unique contributions of this project are that it brings together poststructuralism and phenomenology so as to concurrently examine practitioner and patient perspectives of the effects of surgery, and critically examines the mainstream notion and widespread acceptance of body image

Impacto dos fungos na saúde pública

Grande parte da população já sofreu de infeções fúngicas superficiais facilmente tratáveis. Contudo, milhões de indivíduos são vítimas de infeções fúngicas invasivas potencialmente fatais, de difícil diagnóstico e tratamento. A incidência de infeções fúngicas invasivas em pacientes imunodeprimidos e/ou hospitalizados tem vindo a aumentar nos últimos anos, originando elevadas taxas de morbilidade e mortalidade. A Candida spp, Cryptococcus neoformans e Aspergillus spp. são os fungos mais frequentemente isolados neste tipo de infeções. Por outro lado, as micoses superficiais afetam cerca de 25% da população sendo as infeções fúngicas mais comuns em todo o mundo. Trichophyton rubrum representa o agente etiológico da maioria dos casos de tinea unguium, tinea cruris, tinea corporis e tinea pedis. Não menos importantes, destacam-se o Microsporum canis e Trichophyton tonsurans responsáveis por tínea capitis principalmente em crianças

(In)admissibilidade de provas ilícitas : dissemelhança na produção de prova no direito processual?

Dissertação de Mestrado em Direito, na área de especialização de Ciências Jurídico-Forenses, apresentada à Faculdade de Direito da Universidade de Coimbr