Coltivazione di cellule staminali mesenchimali da sangue di cordone ombelicale umano:studi per la definizione del ruolo dello stress ossidativo nel controllo della proliferazione e del differenziamento cellulare

Negli ultimi anni è¨ divenuto sempre più¨´ evidente il ruolo dello stress ossidativo nella regolazione del differenziamento cellulare, sia attraverso la produzione di specie chimiche derivanti dal danno perossidativo, come le idrossialchenali, sia attraverso la regolazione di tioli critici di proteine quali recettori e fattori di crescita (es. attraverso S-glutatiolazione e S-cisteinilglicilazione). Anche la tensione di ossigeno, attraverso la funzione del fattore inducibile da ipossia (HIF-1), esercita una potente azione a livello cellulare. Tali acquisizioni hanno dato luogo all'attuale concetto di "redox regulatio", che implica proprio l'azione regolatrice di tali meccanismi. Tale cognizione ha una rilevanza particolare per quanto concerne lo studio delle cellule staminali, ed in particolare quelle embrionali e di cordone ombelicale umano. Infatti, mentre la tensione di ossigeno all'interno dei tessuti dell'adulto oscilla tra i 5 ed i 30 mm di Hg, i tessuti fetali sono ancora più ipossici, in virtù della particolare affinità per l'ossigeno dell'emoglobina fetale. Al contrario, tutte le colture cellulari vengono normalmente mantenute in condizioni standard di atmosfera, con la semplice aggiunta del 5%di CO2, in terreni con elevate concentrazioni di tioli: in tali condizioni la tensione di ossigeno è praticamente uguale a quella normale, cioè 120 mmHg. Questo espone le colture cellulari ad un potente stress ossidativo, che consente solo ad una discreta percentuale di cellule di sopravvivere e proliferare in vitro. Lo stress ossidativo, infatti, è noto essere un potente fattore di regolazione delle funzioni cellulari, in particolare della proliferazione, dell'apoptosi e del differenziamento. Proprio questi tre fattori hanno una cruciale importanza se si pensa alle problematiche connesse con il mantenimento, l'espansione e l'utilizzo delle cellule staminali, in particolare delle cellule della linea mesenchimale, presenti in piccolissima percentuale nel sangue cordonale ed estremamente difficili da mantenere in coltura, forse proprio a causa dell'elevato stress ossidativo esistente in vitro, ma di grande utilità per quanto riguarda possibili futuri scopi terapeutici di tali cellule, in quanto capaci di differenziare, oltre che in elementi ematici, anche in altri tipi cellulari, quali ad es. condrociti, osteoblasti, adipociti. La presente tesi è stata condotta in collaborazione con la Banca del sangue placentare dell'Azienda Ospedaliera Universitaria di Pisa. Lo scopo è stato quello di chiarire il ruolo dello stress ossidativo nella coltura delle cellule mononucleate del sangue cordonale, iniziando a studiare il maggior sistema di difesa antiossidante delle cellule eucariotiche, il glutatione (GSH) e le sue modificazioni nelle cellule nucleate ottenute da sangue di cordone ombelicale umano, prima della coltura e, successivamente, nelle colture attraverso le quali si ottengono cellule mesenchimali. In tali cellule sono state caratterizzate, in condizioni normali e di ipossia relativa, le attività degli enzimi del metabolismo del glutatione, in particolare della gamma-glutammil-transpeptidasi, (GGT), mediante analisi citochimica, e le concentrazioni intracellulari ed extracellulari del GSH e degli altri tioli a basso peso molecolare mediante saggio enzimatico ed analisi cromatografica (HPLC). Inoltre, in previsione dell'utilizzo di tali cellule in sistemi tridimensionali misti di cellule staminali e cellule somatiche, sono stati condotti studi su di un tracciante, derivato dalla fluoresceina, il Cell Tracker Green. Proprio utilizzando tale tracciante, che viene metabolizzato attraverso enzimi GSH-dipendenti,è stata messa a punto una procedura citofluorimetrica per la determinazione del GSH su singola cellula. Il presente studio ha dimostrato, sia su cellule ematiche in coltura che su cellule ematiche appena prelevate dal sangue cordonale e di adulto sano, l'effettiva specificità di coniugazione del Cell Tracker Green, nei confronti del GSH intracellulare. La validazione del metodo ha permesso di studiare lo stato redox delle cellule, sia mediante analisi quantitativa del contenuto di GSH , sia mediante visualizzazione citofluorimetrica, sfruttando le proprietà del tracciante, che diventa fuorescente una volta modificato all'interno della cellula da alcune attività enzimatiche. Grazie a questa procedura, che permette la doppia marcatura fluorescente per il GSH e per antigeni di superficie, è stato osservato che nel sangue cordonale le cellule che mostrano positività alla marcatura per l'antigene di membrana CD73, che è uno degli antigeni di superficie caratteristici delle cellule mesenchimali, presentano anche maggior positività alla marcatura con il Cell Tracker Green, rispetto alle cellule positive per il CD34, identificabili come progenitori della linea emopoietica. Ciò potrebbe riflettersi in un diverso contenuto di GSH intracellulare, ma, dato l'esigua percentuale di queste cellule nel sangue cordonale, come riferiscono anche i dati presenti in letteratura, sarà necessario in futuro procedere all'analisi di colture arricchite in tali cellule per avvalorare tale ipotesi. L'analisi cromatografica, (HPLC), ha evidenziato maggiori livelli di tioli a basso peso molecolare nelle colture di sangue cordonale in condizioni di ipossia relativa, (che riproducono l'ambiente fetale), rispetto alle stesse cellule mantenute in condizioni standard di atmosfera, confermando l'importante ruolo svolto dalla tensione di ossigeno in vitro nel regolare il metabolismo e, verosimilmente le funzioni dei tioli. Come atteso, la coltura di cellule del sangue cordonale ha determinato, dopo circa una settimana, la comparsa d due diversi tipi cellulari: uno dalla morfologia sferica, assimilabile a precursori della linea emopoietica, che tendono poi a regredire nel tempo dall'ambiente in vitro, ed uno a cellule fusiformi, morfologicamente simili ai fibroblasti, che nel tempo danno origine a dei veri e propri cloni, del tutto simili aquelli di cellule mesenchimali staminali presenti ed ampiamente caratterizzate dal midollo osseo, che risulta esserne tuttora la fonte più efficiente. L'analisi citochimica delle cellule del sangue cordonale e delle colture da sangue di cordone ha permesso di evidenziare in alcuni tipi cellulari, la presenza di un'intensa attivita di gamma-glutammil transpeptidasi (GGT). Poichè l'attività in strisci di sangue appare in polimorfonucleati e monociti, ma non nei globuli rossi e nei linfociti, ed in vitro compare solo in grandi cellule apparentemente dotate di attività fagocitaria si è concluso che le cellule GGT-positive in vitro sono cellule della linea mieloide. La GGT è stato dimostrato di recente svolgere, oltre all'idrolisi del GSH extracellulare e al recupero intracellulare dei precursori amminoacidici necessari alla sintesi del tripeptide stesso, una forte azione pro-ossidante in coltura, mediante la produzione proprio di un tiolo a basso peso molecolare, la cisteinilglicina (CysGly). La GGT, infatti, attraverso l'idrolisi del GSH, e la formazione di CysGly, è responsabile della genesi di specie reattive dell'ossigeno (ROS), coinvolte in importanti processi dannosi per le cellule, tra cui la perossidazione lipidica (LPO) delle membrane, ma anche la regolazione attraverso meccanismi redox, dei processi di differenziamento, proliferazione, morte cellulare. In conclusione, quindi, i risultati della presente tesi suggeriscono che le cellule circolanti nel sangue di cordone ombelicale abbiano un elevato contenuto di GSH intracellulare, e che tale contenuto diminuisca in presenza delle elevate tensioni di ossigeno presenti in coltura. Inoltre, la presenza nelle colture di cellule di sangue di cordone di elementi ricchi di attività di GGT può rappresentare un potente elemento pro-ossidante che somma i suoi effetti a quelli della elevata tensione di ossigeno. Ulteriori studi sono necessari allo scopo di determinare le condizioni di coltura più favorevoli alla proliferazione e al differenziamento delle cellule staminali mesenchimali da sangue di cordone ombelicale umano

Spheroids from equine amnion mesenchymal stem cells: an in vitro study

Background: Equine amnion mesenchymal stem cells (EAMSCs) from amnion isolated after the foal birth represented an alternative source of easy collection of mesenchymal cells used in equine regenerative medicine. Methods: These cells grown as 2D culture in α-MEM medium supplemented with EGF were differentiated in adipogenic, chondrogenic and osteogenic cells. Half a million cells as pellet were left in 15ml tubes with the same differentiation media for 20 days. After the pellets were collected, embedded in paraffin for morphological study. Results: 2D culture showed EAMSCs with an embryonic phenotype (C-kit+, CD105+, Oct-4+) and a differentiation potential in adipogenic, chondrogenic and osteogenic multipotent cells. By a reproducible method of 3D culture, at day 20 the Authors evidenced a formation of small aggregated spheroids gradually gathering. In cross sections the surface of spheroid evidenced flattened cells embedded in a red matrix by Alizarin staining and occasionally a core of calcium precipitation. A network of apoptotic or necrotic cells in a not mineralized matrix was present into the center of nodules. The 3D spheroids appeared larger (mean diameter of 605±53 µm for gathering spheroids and 1486±79 µm for spheroids already gathered) than those from standard monolayer cultures (mean diameter of 200 ± 73 µm). Conclusions: EAMSCs cultured in 3D method preserve their in vitro multipotent differentiation than adherent 2D culture method. These EAMSCs included in extracellular matrix not mineralized at day 20 seem to be a good source of MSCs for tissue repair and regeneration in equine medicine

Different media and supplements modulate the clonogenic and expansion properties of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

<p>Abstract</p> <p>Background -</p> <p>Rabbits provide an excellent model for many animal and human diseases, such as cardiovascular diseases, for the development of new vaccines in wound healing management and in the field of tissue engineering of tendon, cartilage, bone and skin.</p> <p>The study presented herein aims to investigate the biological properties of bone marrow rabbit MSCs cultured in different conditions, in order to provide a basis for their clinical applications in veterinary medicine.</p> <p>Findings -</p> <p>MSCs were isolated from 5 New Zealand rabbits. Fold increase, CFU number, doubling time, differentiation ability and immunophenotype were analyzed.</p> <p>With the plating density of 10 cells/cm²the fold increase was significantly lower with DMEM-20%FCS and MSCs growth was significantly higher with αMEM-hEGF. The highest clonogenic ability was found at 100 cell/cm²with MSCBM and at 10 cell/cm²with M199. Both at 10 and 100 cells/cm², in αMEM medium, the highest CFU increase was obtained by adding bFGF. Supplementing culture media with 10%FCS-10%HS determined a significant increase of CFU.</p> <p>Conclusion -</p> <p>Our data suggest that different progenitor cells with differential sensitivity to media, sera and growth factors exist and the choice of culture conditions has to be carefully considered for MSC management.</p

Sulfatase modifying factor 1–mediated fibroblast growth factor signaling primes hematopoietic multilineage development

Self-renewal and differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs) are balanced by the concerted activities of the fibroblast growth factor (FGF), Wnt, and Notch pathways, which are tuned by enzyme-mediated remodeling of heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). Sulfatase modifying factor 1 (SUMF1) activates the Sulf1 and Sulf2 sulfatases that remodel the HSPGs, and is mutated in patients with multiple sulfatase deficiency. Here, we show that the FGF signaling pathway is constitutively activated in Sumf1−/− HSCs and hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs). These cells show increased p-extracellular signal-regulated kinase levels, which in turn promote β-catenin accumulation. Constitutive activation of FGF signaling results in a block in erythroid differentiation at the chromatophilic erythroblast stage, and of B lymphocyte differentiation at the pro–B cell stage. A reduction in mature myeloid cells and an aberrant development of T lymphocytes are also seen. These defects are rescued in vivo by blocking the FGF pathway in Sumf1−/− mice. Transplantation of Sumf1−/− HSPCs into wild-type mice reconstituted the phenotype of the donors, suggesting a cell autonomous defect. These data indicate that Sumf1 controls HSPC differentiation and hematopoietic lineage development through FGF and Wnt signaling

Search for heavy neutral lepton production in K+ decays

A search for heavy neutral lepton production in K + decays using a data sample collected with a minimum bias trigger by the NA62 experiment at CERN in 2015 is reported. Upper limits at the 10−7 to 10−6 level are established on the elements of the extended neutrino mixing matrix |Ue4| 2 and |Uμ4| 2 for heavy neutral lepton mass in the ranges 170–448 MeV/c2 and 250–373 MeV/c2, respectively. This improves on the previous limits from HNL production searches over the whole mass range considered for |Ue4|2 and above 300 MeV/c2 for |Uμ4|2

Review of Kaon Physics at CERN and in Europe

The Kaon physics program at CERN and in Europe will be presented. I will first give a short review of recent results form the NA48/2 and NA62 experiments, with special emphasis to the measurement of RK , the ratio of Kaon leptonic decays rates, K → eν and K → μν, using the full minimum bias data sample collected in 2007-2008. The main subject of the talk will be the study of the highly suppressed decay K → πνν. While its rate can be predicted with minimal theoretical uncertainty in the Standard Model (BR ∼ 8 × 10−11), the smallness of BR and the challenging experimental signature make it very difficult to measure. The branching ratio for this decay is thus a sensitive probe of the flavour sector of the SM. The aim of NA62 is the measurement of the K → πνν BR with ∼ 10% precision in two years of data taking. This will require the observation of 10K decays in the experiment's fiducial volume, as well as the use of high-performance systems for precision tracking, particle identification, and photon vetoing. These aspects of the experiment will also allow NA62 to carry out a rich program of searches for lepton flavour and/or number violating K decays. Data taking will start in October 2014. The physics prospects and the status of the construction and commissioning of the NA62 experiment will be presented. In the last part of the talk I will report on Kaon physics results and prospects from other experiments at CERN (e.g. LHCb) and in Europe (e.g. KLOE and KLOE-2) and briefly mention the status in US

Measurement of the very rare K+→π+ννˉK^+ \to \pi^+ \nu \bar\nu decay

The decay K+→π+νν¯ , with a very precisely predicted branching ratio of less than 10−10 , is among the best processes to reveal indirect effects of new physics. The NA62 experiment at CERN SPS is designed to study the K+→π+νν¯ decay and to measure its branching ratio using a decay-in-flight technique. NA62 took data in 2016, 2017 and 2018, reaching the sensitivity of the Standard Model for the K+→π+νν¯ decay by the analysis of the 2016 and 2017 data, and providing the most precise measurement of the branching ratio to date by the analysis of the 2018 data. This measurement is also used to set limits on BR(K+→π+X ), where X is a scalar or pseudo-scalar particle. The final result of the BR(K+→π+νν¯ ) measurement and its interpretation in terms of the K+→π+X decay from the analysis of the full 2016-2018 data set is presented, and future plans and prospects are reviewed

Identification of genetic variants associated with Huntington's disease progression: a genome-wide association study

Background Huntington's disease is caused by a CAG repeat expansion in the huntingtin gene, HTT. Age at onset has been used as a quantitative phenotype in genetic analysis looking for Huntington's disease modifiers, but is hard to define and not always available. Therefore, we aimed to generate a novel measure of disease progression and to identify genetic markers associated with this progression measure. Methods We generated a progression score on the basis of principal component analysis of prospectively acquired longitudinal changes in motor, cognitive, and imaging measures in the 218 indivduals in the TRACK-HD cohort of Huntington's disease gene mutation carriers (data collected 2008–11). We generated a parallel progression score using data from 1773 previously genotyped participants from the European Huntington's Disease Network REGISTRY study of Huntington's disease mutation carriers (data collected 2003–13). We did a genome-wide association analyses in terms of progression for 216 TRACK-HD participants and 1773 REGISTRY participants, then a meta-analysis of these results was undertaken. Findings Longitudinal motor, cognitive, and imaging scores were correlated with each other in TRACK-HD participants, justifying use of a single, cross-domain measure of disease progression in both studies. The TRACK-HD and REGISTRY progression measures were correlated with each other (r=0·674), and with age at onset (TRACK-HD, r=0·315; REGISTRY, r=0·234). The meta-analysis of progression in TRACK-HD and REGISTRY gave a genome-wide significant signal (p=1·12 × 10−10) on chromosome 5 spanning three genes: MSH3, DHFR, and MTRNR2L2. The genes in this locus were associated with progression in TRACK-HD (MSH3 p=2·94 × 10−8 DHFR p=8·37 × 10−7 MTRNR2L2 p=2·15 × 10−9) and to a lesser extent in REGISTRY (MSH3 p=9·36 × 10−4 DHFR p=8·45 × 10−4 MTRNR2L2 p=1·20 × 10−3). The lead single nucleotide polymorphism (SNP) in TRACK-HD (rs557874766) was genome-wide significant in the meta-analysis (p=1·58 × 10−8), and encodes an aminoacid change (Pro67Ala) in MSH3. In TRACK-HD, each copy of the minor allele at this SNP was associated with a 0·4 units per year (95% CI 0·16–0·66) reduction in the rate of change of the Unified Huntington's Disease Rating Scale (UHDRS) Total Motor Score, and a reduction of 0·12 units per year (95% CI 0·06–0·18) in the rate of change of UHDRS Total Functional Capacity score. These associations remained significant after adjusting for age of onset. Interpretation The multidomain progression measure in TRACK-HD was associated with a functional variant that was genome-wide significant in our meta-analysis. The association in only 216 participants implies that the progression measure is a sensitive reflection of disease burden, that the effect size at this locus is large, or both. Knockout of Msh3 reduces somatic expansion in Huntington's disease mouse models, suggesting this mechanism as an area for future therapeutic investigation

Residential Composting as an instrument of environmental education and reduction of solid wastes. Campos do Jordão, São Paolo.

No Brasil, a parcela orgânica dos resíduos sólidos urbanos (RSU) representa mais de 50% de sua composição, na grande maioria dos municípios. No entanto, a compostagem, como método de tratamento dos resíduos orgânicos, não é empregada como poderia, somente 1,5% dos RSU no país é compostados; mesmo a compostagem caseira sendo prática de baixo custo e apropriada a áreas residenciais não é usual. O presente trabalho enfatiza a educação ambiental (EA) como instrumento para a organização e participação social, visando à minimização de resíduos sólidos urbanos, através da implantação de composteiras caseiras. O enfoque é dado no envio dos resíduos orgânicos domiciliares para compostagem caseira e na incorporação de novos hábitos, após execução de programa de educação ambiental em uma comunidade, do município de Campos do Jordão, São Paulo, Brasil. No presente estudo, partiu-se das seguintes hipóteses; comunidades de baixos ingressos e pouca instrução, localizadas em bairros periféricos de centros urbanos, são capazes de se organizar e alterar seu comportamento com relação à questão da geração e descarte de RSU, quando convidados a integrar grupos submetidos a programa de Educação Ambiental, com metodologia participativa; aliando-se atividades teóricas e práticas elaborado de acordo com as necessidades específicas da comunidade e implantados considerando-se a realidade local. Os resultados alcançados foram a organização social da comunidade, com o desvio de 83,5% dos resíduos orgânicos do aterro para a compostagem, isso quando não foram minimizados antes, no aproveitamento completo dos alimentos. A prática da compostagem possibilitou testar vários tipos de composteira caseira e garantiu melhorias nas condições de disposição dos RSU, reduzindo os impactos ambientais.In Brazil, the organic portion of the solid wastes represents more than 50% of its composition in most of the cities. However, the composting , as a method of organic wastes treatment, is not applied as it could be, only 1.5% of the Urban Solid Waste (USW or in Portuguese, RSU) is recycled; even the home composting, which has a low cost and is appropriated in residential areas, is not common. This current paper emphasizes the environmental education as an instrument for the social organization and participation as well as minimization of solid wastes, which are essential elements for a sustainable development. The approach is based on the reduction of solid wastes by sending the home organic waste to home composting and the incorporation of new habits after the execution of an environmental education program in a community from the city of Campos do Jordão (São Paulo - Brazil). The research was originated on the hypothesis that communities with lack of basic facilities and lower education rates located in surrounding areas of urban centers are capable of organizing and changing its habits in relation to production and discarding of USW. This is possible especially when people are invited to integrate groups committed to an environmental education program according to the specific needs of the community and considering the local reality. The obtained results were the social organization of the community, with the allocation of 83,5% of the organic wastes from landfills to composting, that is when it was not minimized before, with the complete use of food. The composting made it to possible to test various types of home composting and assured improvements in the disposal conditions of the USW, reducing environmental impact

High resolution magic angle spinning (HR-MAS) 1H NMR investigation of the active surfaces of MgCl2-supported Ziegler-Natta catalysts. The MgCl2 matrix

"Classical" MgCl2-supported Ziegler-Natta catalysts (ZNCs) continue to dominate the industrial prodn. of isotactic polypropylene. There is a growing awareness of the inherent competitive edge of these low-cost systems over single-center (primarily metallocene) catalysts and of the potential for further improvement, particularly if deeper insight into the structure of the catalytic surfaces and the mechanisms of their modification by electron donors can be achieved. In the framework of a project ultimately aiming at the implementation of ZNCs with known and controlled surface structures, the authors are revisiting this whole area by using a combination of advanced computational (periodic DFT) and spectroscopic (high-resoln. magic-angle-spinning 1H NMR spectroscopy) tools. In this article, the authors report on the neat MgCl2 matrix and on model MgCl2/electron-donor adducts