Coltivazione di cellule staminali mesenchimali da sangue di cordone ombelicale umano:studi per la definizione del ruolo dello stress ossidativo nel controllo della proliferazione e del differenziamento cellulare

Abstract

Negli ultimi anni è¨ divenuto sempre più¨´ evidente il ruolo dello stress ossidativo nella regolazione del differenziamento cellulare, sia attraverso la produzione di specie chimiche derivanti dal danno perossidativo, come le idrossialchenali, sia attraverso la regolazione di tioli critici di proteine quali recettori e fattori di crescita (es. attraverso S-glutatiolazione e S-cisteinilglicilazione). Anche la tensione di ossigeno, attraverso la funzione del fattore inducibile da ipossia (HIF-1), esercita una potente azione a livello cellulare. Tali acquisizioni hanno dato luogo all'attuale concetto di "redox regulatio", che implica proprio l'azione regolatrice di tali meccanismi. Tale cognizione ha una rilevanza particolare per quanto concerne lo studio delle cellule staminali, ed in particolare quelle embrionali e di cordone ombelicale umano. Infatti, mentre la tensione di ossigeno all'interno dei tessuti dell'adulto oscilla tra i 5 ed i 30 mm di Hg, i tessuti fetali sono ancora più ipossici, in virtù della particolare affinità per l'ossigeno dell'emoglobina fetale. Al contrario, tutte le colture cellulari vengono normalmente mantenute in condizioni standard di atmosfera, con la semplice aggiunta del 5%di CO2, in terreni con elevate concentrazioni di tioli: in tali condizioni la tensione di ossigeno è praticamente uguale a quella normale, cioè 120 mmHg. Questo espone le colture cellulari ad un potente stress ossidativo, che consente solo ad una discreta percentuale di cellule di sopravvivere e proliferare in vitro. Lo stress ossidativo, infatti, è noto essere un potente fattore di regolazione delle funzioni cellulari, in particolare della proliferazione, dell'apoptosi e del differenziamento. Proprio questi tre fattori hanno una cruciale importanza se si pensa alle problematiche connesse con il mantenimento, l'espansione e l'utilizzo delle cellule staminali, in particolare delle cellule della linea mesenchimale, presenti in piccolissima percentuale nel sangue cordonale ed estremamente difficili da mantenere in coltura, forse proprio a causa dell'elevato stress ossidativo esistente in vitro, ma di grande utilità per quanto riguarda possibili futuri scopi terapeutici di tali cellule, in quanto capaci di differenziare, oltre che in elementi ematici, anche in altri tipi cellulari, quali ad es. condrociti, osteoblasti, adipociti. La presente tesi è stata condotta in collaborazione con la Banca del sangue placentare dell'Azienda Ospedaliera Universitaria di Pisa. Lo scopo è stato quello di chiarire il ruolo dello stress ossidativo nella coltura delle cellule mononucleate del sangue cordonale, iniziando a studiare il maggior sistema di difesa antiossidante delle cellule eucariotiche, il glutatione (GSH) e le sue modificazioni nelle cellule nucleate ottenute da sangue di cordone ombelicale umano, prima della coltura e, successivamente, nelle colture attraverso le quali si ottengono cellule mesenchimali. In tali cellule sono state caratterizzate, in condizioni normali e di ipossia relativa, le attività degli enzimi del metabolismo del glutatione, in particolare della gamma-glutammil-transpeptidasi, (GGT), mediante analisi citochimica, e le concentrazioni intracellulari ed extracellulari del GSH e degli altri tioli a basso peso molecolare mediante saggio enzimatico ed analisi cromatografica (HPLC). Inoltre, in previsione dell'utilizzo di tali cellule in sistemi tridimensionali misti di cellule staminali e cellule somatiche, sono stati condotti studi su di un tracciante, derivato dalla fluoresceina, il Cell Tracker Green. Proprio utilizzando tale tracciante, che viene metabolizzato attraverso enzimi GSH-dipendenti,è stata messa a punto una procedura citofluorimetrica per la determinazione del GSH su singola cellula. Il presente studio ha dimostrato, sia su cellule ematiche in coltura che su cellule ematiche appena prelevate dal sangue cordonale e di adulto sano, l'effettiva specificità di coniugazione del Cell Tracker Green, nei confronti del GSH intracellulare. La validazione del metodo ha permesso di studiare lo stato redox delle cellule, sia mediante analisi quantitativa del contenuto di GSH , sia mediante visualizzazione citofluorimetrica, sfruttando le proprietà del tracciante, che diventa fuorescente una volta modificato all'interno della cellula da alcune attività enzimatiche. Grazie a questa procedura, che permette la doppia marcatura fluorescente per il GSH e per antigeni di superficie, è stato osservato che nel sangue cordonale le cellule che mostrano positività alla marcatura per l'antigene di membrana CD73, che è uno degli antigeni di superficie caratteristici delle cellule mesenchimali, presentano anche maggior positività alla marcatura con il Cell Tracker Green, rispetto alle cellule positive per il CD34, identificabili come progenitori della linea emopoietica. Ciò potrebbe riflettersi in un diverso contenuto di GSH intracellulare, ma, dato l'esigua percentuale di queste cellule nel sangue cordonale, come riferiscono anche i dati presenti in letteratura, sarà necessario in futuro procedere all'analisi di colture arricchite in tali cellule per avvalorare tale ipotesi. L'analisi cromatografica, (HPLC), ha evidenziato maggiori livelli di tioli a basso peso molecolare nelle colture di sangue cordonale in condizioni di ipossia relativa, (che riproducono l'ambiente fetale), rispetto alle stesse cellule mantenute in condizioni standard di atmosfera, confermando l'importante ruolo svolto dalla tensione di ossigeno in vitro nel regolare il metabolismo e, verosimilmente le funzioni dei tioli. Come atteso, la coltura di cellule del sangue cordonale ha determinato, dopo circa una settimana, la comparsa d due diversi tipi cellulari: uno dalla morfologia sferica, assimilabile a precursori della linea emopoietica, che tendono poi a regredire nel tempo dall'ambiente in vitro, ed uno a cellule fusiformi, morfologicamente simili ai fibroblasti, che nel tempo danno origine a dei veri e propri cloni, del tutto simili aquelli di cellule mesenchimali staminali presenti ed ampiamente caratterizzate dal midollo osseo, che risulta esserne tuttora la fonte più efficiente. L'analisi citochimica delle cellule del sangue cordonale e delle colture da sangue di cordone ha permesso di evidenziare in alcuni tipi cellulari, la presenza di un'intensa attivita di gamma-glutammil transpeptidasi (GGT). Poichè l'attività in strisci di sangue appare in polimorfonucleati e monociti, ma non nei globuli rossi e nei linfociti, ed in vitro compare solo in grandi cellule apparentemente dotate di attività fagocitaria si è concluso che le cellule GGT-positive in vitro sono cellule della linea mieloide. La GGT è stato dimostrato di recente svolgere, oltre all'idrolisi del GSH extracellulare e al recupero intracellulare dei precursori amminoacidici necessari alla sintesi del tripeptide stesso, una forte azione pro-ossidante in coltura, mediante la produzione proprio di un tiolo a basso peso molecolare, la cisteinilglicina (CysGly). La GGT, infatti, attraverso l'idrolisi del GSH, e la formazione di CysGly, è responsabile della genesi di specie reattive dell'ossigeno (ROS), coinvolte in importanti processi dannosi per le cellule, tra cui la perossidazione lipidica (LPO) delle membrane, ma anche la regolazione attraverso meccanismi redox, dei processi di differenziamento, proliferazione, morte cellulare. In conclusione, quindi, i risultati della presente tesi suggeriscono che le cellule circolanti nel sangue di cordone ombelicale abbiano un elevato contenuto di GSH intracellulare, e che tale contenuto diminuisca in presenza delle elevate tensioni di ossigeno presenti in coltura. Inoltre, la presenza nelle colture di cellule di sangue di cordone di elementi ricchi di attività di GGT può rappresentare un potente elemento pro-ossidante che somma i suoi effetti a quelli della elevata tensione di ossigeno. Ulteriori studi sono necessari allo scopo di determinare le condizioni di coltura più favorevoli alla proliferazione e al differenziamento delle cellule staminali mesenchimali da sangue di cordone ombelicale umano