Genomics and Functional Genetics of the Zoonotic Pathogen Helicobacter Bizzozeronii

Helicobacter spp. are common causes of bacterial infection worldwide in both humans and animals.The canine Gram-negative Helicobacter bizzozeronii is one out of seven species in the group of H. heilmannii sensu lato (s. l.) also known as non-H. pylori gastric Helicobacter species (NPGHS) that are detected in 0.2-6% in gastric biopsies of human patients with gastritis. At present, H. bizzozeronii and H. felis are the only H. heilmannii s. l. species that have been successfully cultivated from human gastric biopsies. In contrast to human-to-human transmission described for H. pylori, the H. heilmannii sensu lato (s. l). are transmitted from animals to humans (zoonotic). To date, an understanding of the pathogenesis of non-pylori Helicobacter infections in humans and also of the mechanisms of their adaptation are lacking. In order to provide new insights into these topics, the present study focused on the molecular biology of H. bizzozeronii with particular interest in unravelling the bacterial features involved in host-jumping and adaptation to the human gastric mucosa. The study also investigated the molecular mechanisms of metronidazole resistance in H. bizzozeronii. Using comparative genome analysis between H. pylori and a human isolate of H. bizzozeronii CIII-1, we investigated several molecular genetic features that could explain the zoonotic nature of NPGHS. In particular, we propose the hypothesis that the high metabolic versatility and the ability to react to a range of environmental signals, factors which differentiate H. bizzozeronii and other species belonging to H. heilmannii s. l. from H. pylori, are the molecular basis of the of the zoonotic nature of H. heilmannii s. l. infection in humans. Further we characterized the biosynthesis of lipopolysaccharide (LPS) of H. bizzozeronii in order to understand the factors involved in host adaptation during host jump from dogs to humans. As a major Gram-negative cell surface component, LPS has the potential to interact with certain surface components of the host s cells during infection, which modifies the inflammatory response and promotes progress of chronic infection. Our results showed that H. bizzozeronii expresses sialyl-LPS (containing the sialyl-lactoseamine epitope), which is a common characteristic among canine and human H. bizzozeronii strains. The expression of sialyl-glycans undergoes phase- and antigen variation and may influence the adaptation process of H. bizzozeronii during the transmission from dogs to humans. Metronidazole, in combination with other antibiotics, is frequently used for the eradication of H. pylori and H. heilmannii s. l. infections but resistance to this antibiotic is a serious, increasing problem and a major cause of treatment failure. In this study, we performed comparative genomic analysis between antrum derived H. bizzozeronii populations that had been isolated from biopsy samples from a female Finnish patient who was suffering from chronic gastritis. The biopsies were taken three months before (T0) and six months after (T1) an unsuccessful eradication treatment. Our results that H. bizzozeronii had undergone genome diversification in order to colonize the patient s stomach successfully. We hypothesised that antimicrobial treatment induced a sudden decrease of H. bizzozeronii population size but effectively favoured the selection of a subpopulation, which subsequently acted as the founder of a new population that was characterized by higher numbers of fixed mutations. H. bizzozeronii isolates obtained after the treatment underwent a frame length extension of the oxygen-insensitive NAD(P)H-nitroreductase HBZC1_00960 (homologue of H. pylori RdxA) that is associated with the disruption of the C-terminal cysteine-containing conserved region (IACLXALGK). This disruption was the result of the extension (from C8 to C9) of a simple sequence cytosine repeat (SSCR) (homopolymeric tract) that is located in the 3 region of the rdxA gene. Further we investigated the role of rdxA gene in the molecular mechanisms of metronidazole in H. bizzozeronii. Our results showed that, in most of the in vitro spontaneous H. bizzozeronii metronidazole resistant mutants, the only observed mutation was that of the extension of the 3 SSCR of rdxA. Another major observation was that the MIC value of metronidazole for both spontaneous mutant isolates and an H. bizzozeronii ΔrdxA mutant strain were similar, which indicates that a loss of rdxA function is associated with the reduced susceptibility of H. bizzozeronii to metronidazole. Another key finding was that H. bizzozeronii acquires resistance to metronidazole at high mutation rates and that serial passages in vitro without selection induce reversibility of the resistant phenotype. These results suggest that the potential contingency nature of rdxA should be carefully considered if metronidazole is administered for the treatment of H. heilmannii-associated gastritis. The results of the present studies contribute substantially in the understanding of the zoonotic nature of non-H. pylori gastric Helicobacter species and of the molecular mechanisms behind successful colonization and acquired antimicrobial resistance. Further studies are required in order to elucidate the specific roles of characterized factors, such as polysaccharide lyase and Sialyl-LPS, in the development of gastritis and MALT lymphoma.Helicobakteerit (Helicobacter spp.) ovat mahasuolikanavassa kolonisoiva bakteerisuku, jossa on useita patogeenisia lajeja, jotka aiheuttavat sekä ihmisten että eläinten infektioita. H. bizzozeronii on koiran mahalaukun helikobakteerilaji (kuluu ns. mahalaukussa kolonisoituvaan non-H.pylori helikobakteeriryhmään; H. heilmannii sensu lato; s.l.). Tätä lajia eristetään myös 0.2-6% eriasteista gastriittia sairastavien ihmisten mahalaukun biopsianäytteistä. H. bizzozeronii ja toinen eläinten helikobakteerilaji H. felis ovat non-H.pylori lajeja, joita on myös onnistuttu eristämään viljelemällä potilaiden biopsianäytteistä. Näitä eläinten mahalaukun helikobakteereita voidaankin pitää zoonoottisina taudinaiheuttajina, jotka voivat tarttua koirista ihmisiin. Sen sijaan H. pylori tarttuu ainoastaan ihmisestä ihmiseen. Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin H. bizzoreroniin patogeenisuuteen liittyviä geneettisiä ominaisuuksia ja bakteerin adaptoitumista ihmispotilaaseen. Tavoitteena oli saada yleisemminkin tietoa ominaisuuksista, joita bakteeri tarvitsee, jotta se pystyy siirtymään eri lajien välillä (koira-ihminen). Menetelminä käytettiin laajasti molekyylibiologisia menetelmiä; sekä bakteerin genomitason analytiikkaa että bakteerin yksittäisten ominaisuuksien selvittämistä. Genomitutkimuksen avulla verrattiin ihmispotilaasta eristetyn H. bizzozeronii kannan (III) eroja ja samanlaisuutta H. pylorin kanssa sekä myös muihin eläinten mahalaukussa kolonisoituviin helikobakteerilajeihin, joista koko genomitason tietoa oli saatavilla. Analyysissä havaittiin, että, vaikka H.bizzozeroniin (Hb) ja H. pylorin genomit ovat samankokoisia, H.blla on geneettisesti paljon laajempi metabolinen kapasiteetti ja muita ominaisuuksia, joiden avulla se voi vastata erilaisiin ympäristön vasteisiin kuin Hplla. Bakteerisolun pinnan lipopolysakkaridilla (LPS) on merkitystä isännän ja bakteerin vuorovaikutuksessa, erityisesti kolonisoitumisen alkuvaiheessa, jossa muovaamalla inflammaatiovastetta edistetään kolonisoitumista ja kroonisen infektioprosessin etenemistä. Tulokset osoittivat että H. bizzozeroniin LPSn rakenne on sialyloitunut (sialyylilaktoosiamiiniepitooppi), joka oli tyypillinen myös muille eläinten mahalaukun helikobakteereille, mutta se puuttuu H. pylorista. Sialyyliglykaanien ilmenemistä infektion eri vaiheissa Hb säätelee geenitasolla faasivaihtelun avulla (ON/OFF). Täten LPSn rakenteen säätelyllä voi olla merkitystä infektion zoonoottisuuden kannalta. Kolmannessa tutkimuksessa verrattiin erään gastriittipotilaan biopsianäytteistä eri aikoina eristettyjen H. bizzozeronii populaatioiden genomitason diversiteettiä ja erityisesti sitä, miten epäonnistunut antibioottiterapia vaikutti populaatioihin. Tutkimukset osoittivat, että potilaan kanta oli metronidatsoliresistentti. Metronidatsoli kuului yhtenä antibioottina käytettyyn terapiaan. Biopsianäytteitä oli käytettävissä kolme kuukautta ennen terapiaa (T0) sekä kuusi kuukautta terapian jälkeen (T1). Tulokset osoittivat, että H. bizzozeroniin genomissa oli enemmän diversiteettiä näytteissä, jotka oli otettu ennen terapiaa, kuin näytteissä terapian jälkeen. Krooninen kolonisoituminen ja adaptaatio edellyttävät genomilta sopeutumista, johon bakteeri vastaa lisäämällä genomin diversiteettiä. Terapia todennäköisesti aiheutti äkillisen populaatiokoon vähenemisen ja samalla valikoitumisen, jonka seurauksena tietty subpopulaatio pääsi lisääntymään ja tuloksena saatiin bakteeripopulaatio, jossa oli vähemmän diversiteettiä kuin ennen terapiaa, ja jossa tietyt mutaatiot olivat muuttuneet vallitseviksi. Neljännessä työssä selvitettiin H. bizzozeroniin metronidatsoliresistenssin syntymekanismia. Terapian jälkeen eristetyissä isolaateissa havaittiin mutaatio, joka johti NAD(P)H- nitroreduktaasigeenin (HBZC1_00960; homologinen H. pylorin RdxAn kanssa) lukuraamin muutokseen geenin konservoituneessa C-terminaaliosassa (IACLXALGK). Lukuraamin muutos aiheutui sytosiinin (C) toistojakson (homopolymeerinen jakso) muuttumisesta (C8 -> C9). Tämän homopolymeerisen jakson avulla H. bizzozeronii säätelee RdxAn ilmenemistä. Tutkimuksessa selvitettiin edelleen, miten tämä vaihtelu vaikutti bakteerin metronidatsoliresistenssiin. Havaittiin, että isolaattien metronidatsoli MIC oli samalla tavalla korkea sekä spontaaneissa mutanteissa että in vitro ΔrdxA mutantissa, joka osoitti että rdxA geeni liittyy metronidatsoliresistenssiin. Edelleen tulokset osoittivat, että metronidatsoliresistenssin hankkimisen mutaatiofrekvenssi oli korkea, sekä, että isolaattien siirrostaminen in vitro ilman selektiopainetta, edisti resistentin fenotyypin korvautumista herkällä fenotyypillä. Tämä tulokset osoittavat, että metronidatsoli ei sovi H. heilmannii s.l. ryhmän bakteerien aiheuttamien infektioden hoitoon. Yhteenvetona voidaan todeta, että väitöskirjatyön tutkimukset tuovat merkittävästi uutta tietoa eläinten mahalaukun helikobakteerien (non-H.pylori gastric Helicobacter spp.) geneettisistä taudinaiheuttamisominaisuuksista, jotka liittyvät ihmisten gastriiteihin. Tästä aiheesta on hyvin vähän aikaisempia tutkimuksia. Tutkimuksessa saatiin myös uutta tietoa genomitason mekanismeista, jotka auttavat ymmärtämään toisaalta mahalukussa kolonisoivien helikobakteerien isäntäspesifisyyttä ja toisaalta eräisiin lajeihin liittyvää zoonottisuutta. Myös metronidatsoliresistenssin liittyminen rdxA geenin sytosiinin toistojakson pituuden vaihteluun on uusi mekanismi, joka laajentaa käsitystä resistenssimekanismien variaatiosta saman suvun eri lajien välillä. Jatkotutkimukset selvittävät, mikä merkitys väitöskirjatyössä kuvatuilla tekijöillä, kuten polysakkaridilyaasilla ja sialyloityneella LPSllä, on gastriitin ja MALTin lymfooman patogeneesissä

Microevolution of a zoonotic Helicobacter population colonizing the stomach of a human host before and after failed treatment

To investigate the microevolution of Helicobacter bizzozeronii in the human stomach, comparative genomics of antrum-derived populations, obtained 3 months before (T0) and 6 months after (T1) an unsuccessful eradication treatment, was performed. For each time point, the DNA of bacterial mass, representing the population diversity in three biopsies, was mixed in equal amounts and sequenced using Illumina technology. Polymorphic sites (PSs) were detected by mapping the reads against an isogenic reference genome, derived from a corpus isolate obtained at T0. The total numbers of PSs detected in the H. bizzozeronii population at T0 and T1 were 128 and 223, affecting 81 and 134 coding sequences, respectively. At T0 in 91.4% of the PSs the mutation appeared at a frequency of 50% or less. On the contrary, in the majority of the PSs observed in T1 (71.3%) the mutation had a frequency >75%. Although only a minority of mutations were fixed in the antrum-derived population at T0, a certain level of allelic variability, compared with the corpus-derived reference genome, was present and most likely arose as consequence of the long-term colonization of the patient. The treatment probably induced a sudden decrease of population size, selecting a subpopulation, which acted as founder for the new population at T1 characterized by a higher number of fixed mutations. These data demonstrate that genome plasticity is an important common prerequisite among gastric Helicobacter species for adaptation to the stomach environment allowing the bacterium to evolve rapidly once a selective pressure is applied.Peer reviewe

Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths

Abstract Aims: Low-density lipoprotein (LDL) particles cause atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD) through their retention, modification, and accumulation within the arterial intima. High plasma concentrations of LDL drive this disease, but LDL quality may also contribute. Here, we focused on the intrinsic propensity of LDL to aggregate upon modification. We examined whether inter-individual differences in this quality are linked with LDL lipid composition and coronary artery disease (CAD) death, and basic mechanisms for plaque growth and destabilization. Methods and results: We developed a novel, reproducible method to assess the susceptibility of LDL particles to aggregate during lipolysis induced ex vivo by human recombinant secretory sphingomyelinase. Among patients with an established CAD, we found that the presence of aggregation-prone LDL was predictive of future cardiovascular deaths, independently of conventional risk factors. Aggregation-prone LDL contained more sphingolipids and less phosphatidylcholines than did aggregation-resistant LDL. Three interventions in animal models to rationally alter LDL composition lowered its susceptibility to aggregate and slowed atherosclerosis. Similar compositional changes induced in humans by PCSK9 inhibition or healthy diet also lowered LDL aggregation susceptibility. Aggregated LDL in vitro activated macrophages and T cells, two key cell types involved in plaque progression and rupture. Conclusion: Our results identify the susceptibility of LDL to aggregate as a novel measurable and modifiable factor in the progression of human ASCVD