Potassium phosphite increases tolerance to UV-B in potato

The use of biocompatible chemical compounds that enhance plant disease resistance through Induced Resistance (IR) is an innovative strategy to improve the yield and quality of crops. Phosphites (Phi), inorganic salts of phosphorous acid, are environment friendly, and have been described to induce disease control. Phi, similar to other plant inductors, are thought to be effective against different types of biotic and abiotic stress, and it is assumed that the underlying signaling pathways probably overlap and interact. The signaling pathways triggered by UV-B radiation, for instance, are known to crosstalk with other signaling routes that respond that biotic stress. In the present work, the effect of potassium phosphite (KPhi) pre-treatment on UV-B stress tolerance was evaluated in potato leaves. Plants were treated with KPhi and, after 3 days, exposed to 2 h/day of UV-B (1.5 Watt m(-2)) for 0, 3 and 6 days. KPhi pre-treatment had a beneficial effect on two photosynthetic parameters, specifically chlorophyll content and expression of the psbA gene. Oxidative stress caused by UV-B was also prevented by KPhi. A decrease in the accumulation of hydrogen peroxide (H2O2) in leaves and an increase in guaiacol peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) activities were also observed. In addition, the expression levels of a gene involved in flavonoid synthesis increased in UV-B-stressed plants only when pre-treated with KPhi. Finally, accumulation of glucanases and chitinases was induced by UV-B stress and markedly potentiated by KPhi pre-treatment. Altogether, this is the first report that shows a contribution of KPhi in UV-B stress tolerance in potato plants

Informe científico de Beca de Estudio: Oyarburo, Natalia Soledad (2013)

El objetivo general del estudio realizado en el transcurso de la presente beca fue evaluar la participación de compuestos relacionados con la vía del ácido salicílico (SA) en la respuesta de defensa inducida en papa por fosfitos (Phi) frente a estreses bióticos y abióticos, en particular, la infección por Streptomyces scabies y la radiación ultravioleta (UV-B), respectivamente. Durante este primer año, el estudio bioquímico- molecular se realizó en el sistema de estrés abiótico (UV-B), y se realizaron estudios fitopatologicos del efecto del Phi en el patosistema papa-Streptomyces scabies. Se determinó la expresión de genes marcadores de la vía del acido salícilico, y la activdad y contenido de enzimas relacionadas con dicha vía, en plantas tratadas y no con Phi y expuestas o no a UV-B. Para llevar a cabo los objetivos, trabajamos con plantas de papa de variedad industrial, las cuales se trataron por spray foliar con una solución 1% fosfito de potasio (KPhi) al inicio de la tuberización. Tres días después, se sometieron a radiación UVB por 2hs diarias durante 0, 3, 5 y 6 días. Como control se utilizaron plantas que fueron sometidas solo a radiación UV-B, tratadas con KPhi solamente y que no recibieron tratamiento. En cuanto al análisis fenotípico (objetivo 1), se midió de forma preliminar el índice de verdor de hojas de plantas sometidas a los distintos tratamientos utilizando la herramienta SPAD (medidor del contenido de clorofila). El índice de verdor es una medida de la capacidad fotosintética de la hoja. A partir de dicha medición, se observó a 9 y 40 días post exposición a la radiación UV-B que el tratamiento con KPhi evita la disminución del índice de verdor causada por la radiación UV-B. Actualmente estamos creciendo plantas para analizar otros parámetros fenotípicos como marchitamiento, tiempo a la senescencia, producción de tubérculos entre otros, y repetir la medición del índice de verdor. A su vez, se realizó la cuantificación de enzimas relacionadas con el estrés oxidativo mediante tinciones diferenciales en geles de poliacrilamida (objetivo 3 del plan de trabajo). Para ello, se realizaron extractos de proteínas solubles de hojas de plantas de papa, los cuales se separaron en geles de poliacrilamida y se tiñieron diferencialmente para determinar la actividad de Superóxido dismutasa (SOD), Guaiacol-peroxidasas (POD) y Ascorbato peroxidasas (APX). Observamos una expresión diferencial de SOD y POD, las cuales aumentaron en plantas pretratadas con KPhi y luego expuestas a UV-B, respecto al control o solo tratado con UV-B. Además, se observó un aumento de expresión de las mismas con el aumento de los días de exposición a la radiación UV-B. De forma preliminar, se realizó un Isoelectroenfoque en un amplio rango de pH para separar e identificar las isoformas de POD que se inducen diferencialmente. En el mismo, observamos la inducción de isoformas POD ácidas, obteniendo un resultado que concuerda con el observado en el gel de actividad de poliacrilamida. El isoelectroenfoque se repetirá acotando los pHs de la corrida hacia los pHs ácidos para lograr una separación mas precisa y una posterior identificación de las mismas. La actividad de APX se determinó en geles de poliacrilamida pero las 2 tinciones que realizamos no arrojaron un resultado positivo. Es decir, el gel se tiño del color correspondiente pero no se observó ninguna banda de actividad. También se intentó determinar la actividad de dicha enzima a partir de extractos crudos mediante una técnica espectrofotométrica pero los resultados tampoco fueron claros. En estos momentos estamos probando un protocolo de extracción específico para esta enzima los cuales repetiremos la cuantificación de actividad ya sea en geles de actividad o en tubo. Se cuantificó también el contenido de enzimas relacionadas con la patogénesis (PRPs), en particular β-1,3-glucanasas y quitinasas, mediante Western-blot. Se observó al igual que con las enzimas antioxidantes, un aumento en el contenido de ambas enzimas en plantas pretratadas con KPhi y expuestas a UV-B con respecto a los controles. Posteriormente, se determinó a nivel transcripcional la expresión del gen PR1, un marcador de la vía del ácido salicílico, mediante Real Time-PCR (objetivo 2). Para ello se realizó la extracción de RNA a partir de hojas de los distintos tratamientos con los cuales se realizó la síntesis de cDNA. Estos últimos se utilizaron como templados para las reacciones de Real Time-PCR utilizando primers específicos para dicho gen. Los resultados se encuentran aun en etapa de análisis, pero los mismos sugieren una inducción de PR1 inducida por KPhi. Las figuras correspondientes a los resultados aquí expuestos pueden verse en el anexo de “Manuscrito en preparación” Con respecto a los objetivos relacionados con el estrés biótico, se trabajó en la puesta a punto del sistema experimental. Trabajamos en primer lugar poniendo a punto la infección de rodajas de tubérculos de papa con diversas cepas de Streptomyces scabies las cuales poseen distinto grado de virulencia, y fijamos la cantidad óptima de inoculo con la cual infectar para obtener un resultado claro y preciso. Decidimos continuar trabajando con la cepa 9, la cual fue altamente virulenta y la infección era clara y bien diferenciable. Una vez determinada la cepa con la cual realizar las infecciones y la cantidad de inóculo a utilizar, realizamos infecciones de rodajas de tubérculos pretratadas por spray con una solución 1% KPhi. Se utilizaron rodajas de tubérculos rociadas con agua como control. Observamos una disminución del porcentaje de la infección en tubérculos pretratados con KPhi con respecto a los tubérculos control

Informe científico de Beca de Estudio: Oyarburo, Natalia Soledad (2014)

El objetivo general del estudio realizado en el transcurso de la presente beca fue evaluar la participación de compuestos relacionados con la vía del ácido salicílico (SA) en la respuesta de defensa inducida en papa por fosfitos (Phi) frente a estrés abióticos, en particular la radiación ultravioleta (UV-B). Durante este segundo año, se determinó la expresión de un gen marcador del estado del aparato fotosintético y de un gen marcador de la vía de señalización del ácido salicílico, y la determinación de la actividad de enzimas antioxidantes en plantas tratadas y no con Phi y expuestas o no a UV-B. Para llevar a cabo los objetivos, trabajamos con plantas de papa de variedad industrial, las cuales se trataron por spray foliar con una solución 1% fosfito de potasio (KPhi) 20 dias luego de la emergencia. Tres días después, se sometieron a radiación UV-B por 2hs diarias durante 0, 3, 5 y 6 días. Como control se utilizaron plantas que fueron sometidas solo a radiación UV-B, tratadas con KPhi solamente y que no recibieron tratamiento. Tal como se menciono en el pedido de prórroga, se observó una expresión diferencial de isoformas de Peroxidasas (POD, enzimas antioxidantes) relacionadas al tratamiento con radiación de UV-B o al tratamiento con KPhi. Para avanzar en la identificación de las mismas, se realizaron isoelectroenfoques, en primer lugar con un rango de pH amplio y luego con rangos de pH acotados a las zonas donde se vieron concentradas las bandas en el primer isoelectroenfoque. Se observó la inducción de isoformas de POD con pI=6,6, pI=7,2, pI=7,6 y pI=9,5 en todas las muestras analizadas, pero esta fue mayor en plantas tratadas con KPhi y expuestas a UV-B. Se repetirán estos ensayos acotando aun mas los rangos de pH y se obtendrán muestras para realizar una identificación por secuenciación de las mismas. En cuanto a la evaluación de parámetros fenotípicos relacionados con la tolerancia a la radiación UV-B en plantas tratadas con KPhi, se analizó la expresión del gen psbA mediante Real-time PCR. Este gen codifica para el polipéptido D1 del Fotosistema II, y se utiliza como marcador del estado de integridad del aparato fotosintético (Surplus et al., 1998). Para ello se realizó la extracción de RNA a partir de hojas de los distintos tratamientos con los cuales se realizó la síntesis de cDNA. Estos últimos se utilizaron como templados para las reacciones de Real-Time PCR utilizando primers específicos para dicho gen. Al igual que lo determinado para el Indice de verdor, se observó una disminución en la expresión del gen psbA debido al estrés por radiación UV-B con respecto a la condición control, la cual no se observa al realizar el tratamiento con KPhi y posterior exposición al estrés. Por último, mediante PCR semicuantitativa y Real-time PCR se determinó la expresión del gen PR1, el cual es utilizado como marcador de la vía de señalización del ácido salicílico. Se observó una inducción de la expresión de este gen por la radiación UV-B como se esperaba por bibliografía (Surplus et al., 1998) y una inducción aún mayor en plantas tratadas con KPhi y expuestas a UV-B. Por otra parte, se avanzó en la redacción de una publicación la cual esta próxima de ser enviada a una revista internacional la cual se encuentra adjuntada en el apartado 7.4. En este trabajo se encuentran resultados obtenidos durante el primer año de Beca de Estudio y algunos de los obtenidos durante este segundo año. Así mismo, participe en la redacción de una publicación con los resultados obtenidos durante la realización de la Tesis de Grado con la cual obtuve el título de Lic en Cs Biológicas, el cual también se encuentra adjunto en el apartado 7.4. Este trabajo no guarda relación con el tema de Tesis Doctoral propuesto y fue realizado bajo la dirección de la Dra Laura de la Canal y la Dra Luciana Pagnussat en el laboratorio de Biología Molecular perteneciente al mismo Instituto

On the role of a Lipid-Transfer Protein: Arabidopsis ltp3 mutant is compromised in germination and seedling growth

Plant Lipid-Transfer Proteins (LTPs) exhibit the ability to reversibly bind/transport lipids in vitro. LTPs have been involved in diverse physiological processes but conclusive evidence on their role has only been presented for a few members, none of them related to seed physiology. Arabidopsis seeds rely on storage oil breakdown to supply carbon skeletons and energy for seedling growth. Here, Arabidopsis ltp3 mutant was analysed for its ability to germinate and for seedling establishment. Ltp3 showed delayed germination and reduced germination frequency. Seedling growth appeared reduced in the mutant but this growth restriction was rescued by the addition of an exogenous carbon supply, suggesting a defective oil mobilization. Lipid breakdown analysis during seedling growth revealed a differential profile in the mutant compared to the wild type. The involvement of LTP3 in germination and seedling growth and its relationship with the lipid transfer ability of this protein is discussed.Fil: Pagnussat, Luciana Anabella. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Oyarburo, Natalia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Cimmino, Carlos. Advanta Semillas S.a.i.c. Centro de Biotecnologia Balcarce; ArgentinaFil: Pinedo, Marcela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: de la Canal, Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentin

The reinforcement of potato cell wall as part of the phosphite-induced tolerance to UV-B radiation

Phosphites (Phis), inorganic salts of phosphorous acid, have shown to be effective in protection of plants against biotic stress. Recently, we have described that potassium phosphite (KPhi) induces tolerance to UV-B radiation in potato. To counteract the harmful effect of UV radiation, plants accumulate UV-screening compounds, such as flavonoids, sinapate ester, and lignin. In previous work, we have shown an increase in guaiacol peroxidase (POD) activity in plants pretreated with KPhi and further exposed to UV-B radiation. In order to continue with this study, the expression of different enzymes and components involved in cell wall reinforcement were analyzed. An isoform of POD induced by KPhi was analyzed by isoelectric focusing and further identified as suberization-associated anionic peroxidase (POPA) by mass spectrometry. In addition, other enzymes participating in lignin biosynthesis, like caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT), determined by accumulation of transcripts, and laccase activity, visualized in zymogrames, were increased by KPhi treatment previous to UV-B exposure. Further, the accumulations of extensin (EXT) transcripts and of conjugated polyamines (PAs) were increased by KPhi treatment previous to UV-B exposure. All these results suggest cell wall reinforcement in leaves due to KPhi pretreatment followed by UV-B exposure.Fil: Machinandiarena, Milagros Florencia. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Oyarburo, Natalia Soledad. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Daleo, Gustavo Raul. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Andreu, Adriana Balbina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Olivieri, Florencia Pia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentin

On the role of a Lipid-Transfer Protein. Arabidopsis <i>ltp3</i> mutant is compromised in germination and seedling growth.

<p>Plant Lipid-Transfer Proteins (LTPs) exhibit the ability to reversibly bind/transport lipids <i>in vitro</i>. LTPs have been involved in diverse physiological processes but conclusive evidence on their role has only been presented for a few members, none of them related to seed physiology. Arabidopsis seeds rely on storage oil breakdown to supply carbon skeletons and energy for seedling growth. Here, Arabidopsis <i>ltp3</i> mutant was analyzed for its ability to germinate and for seedling establishment. <i>Ltp3</i> showed delayed germination and reduced germination frequency. Seedling growth appeared reduced in the mutant but this growth restriction was rescued by the addition of an exogenous carbon supply, suggesting a defective oil mobilization. Lipid breakdown analysis during seedling growth revealed a differential profile in the mutant compared to the wild type. The involvement of LTP3 in germination and seedling growth and its relationship with the lipid transfer ability of this protein is discussed.</p