Estudo da atividade citotóxica da proteína dermonecrótica do veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia) com enfase no efeito nefrotóxico

Orientador: Silvio Sanches VeigaCo-orientador: Waldemiro GremskiDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/02/2006Inclui bibliografiaOs acidentes envolvendo aranhas marrons (Loxosceles) tornaram-se um problema de saúde pública no Brasil e, por conseguinte, de grande relevância médica. O conjunto de sinais e sintomas observados em decorrência da picada de aranha marrom é denominado Loxoscelismo; o qual se caracteriza pelo desenvolvimento de lesão dermonecrótica e espalhamento gravitacional no local da picada (quadro local ou cutâneo) e, menos freqüentemente, distúrbios hematológicos e disfunção renal (quadro sistêmico ou cutâneo-visceral), maiores responsáveis pelos óbitos das vítimas. O conteúdo do veneno de Loxosceles e os mecanismos pelos quais induz tais alterações não está bem esclarecido e permanece sob investigação em seus vários segmentos. A presente dissertação tem intuito de aprofundar os conhecimentos quanto à ação citotóxica do veneno loxoscélico, destacando-se o efeito sobre a função renal. Alguns autores atribuem a falência renal como conseqüência das alterações da hemostase (principalmente, a anemia hemolítica) as quais têm sido descritas pelos dados clínicos como proteinúria, hematúria e hemoglobinúria. Além disso, a intensa reação inflamatória observada no local da picada, poderia também induzir a deposição de imunocomplexos que alterariam o fluxo de filtração glomerular e pelos túbulos renais, o que acarretaria na insuficiência renal aguda. Contudo, a literatura científica tem relatado que o veneno exerce ação direta sobre eritrócitos e plaquetas, induzindo hemólise intravascular, agregação plaquetária e coagulação intravascular disseminada; possui efeito inibitório sobre neutrófilos in vitro; além de efeitos citotóxicos em células endoteliais de cordão umbilical e de vasos sangüíneos de coelho. Tendo em vista todas essas informações, nós levantamos a hipótese de uma ação direta do veneno sobre as estruturas renais, visto que não existem evidências experimentais de que o veneno interaja com o tecido renal. Para tanto, utilizamos camundongos expostos ao veneno loxoscélico (modelo animal que não desenvolve a lesão dermonecrótica) e foi observada a indução de lesão renal. Biópsias renais destes animais em microscopia de luz evidenciaram alterações morfológicas contundentes que incluem acúmulo de material eosinofílico e eritrócitos extravasculares na cápsula de Bowman, colapso glomerular, citotoxicidade das células e deposição de material proteináceo no lúmen dos túbulos. Em microscopia eletrônica de transmissão, as alterações morfológicas incluem citotoxicidade de células epiteliais e endoteliais glomerulares e distúrbios na membrana basal renal, bem como alterações dos túbulos que apresentaram vacúolos na membrana citoplasmática, distúrbios mitocondriais, aumento do retículo liso, presença de autofagossomos. Nós observamos também que o veneno causa azotemia, com elevação do nível de uréia sangüíneo, embora não fora observada alteração dos níveis séricos de complemento C3 ou hemólise. Por meio de reações de imunofluorescência por microscopia confocal empregando anticorpos que reconhecem as proteínas do veneno, detectamos a ligação direta de toxinas loxoscélicas em estruturas renais. Ao se realizar dupla marcação de veneno, núcleo (por citoquímica com DAPI) e colágeno tipo IV e laminina, demostramos a deposição das toxinas em células epiteliais glomerulares e tubulares e em membrana basal, mas não houve marcação dos núcleos das células renais. Os dados da ligação direta da toxina ao rim foram reforçados pela constatação de que o veneno é rico em proteínas básicas e de baixa massa molecular em eletroforese bidimensional, o que explicaria o acesso (baixa massa) e a presença de toxinas loxoscélicas na membrana basal (aniônica). Em adição, houve a detecção de toxinas por "imunoblotting" na região de 30kDa de extrato de membrana de rins envenenados. Tais resultados corroboraram para a prospecção de uma possível ação citotóxica sobre linhagens celulares tumorais, as quais foram avaliadas quanto a morfologia celular, viabilidade e proliferação celular (pelos métodos de azul de Trypan e MTT, respectivamente), em concentrações e tempos crescentes. Todas as células assumiram uma forma arredondada e, em alguns casos, houve perda da adesividade ao substrato de cultura. No entanto, de modo geral, não foi observada alteração da viabilidade celular e a taxa de proliferação celular foi bastante variada entre as linhagens expostas ao veneno de Loxosceles. Por meio de técnicas de imunofluorescência por microscopia confocal e microscopia de luz com marcação de PAS, selecionamos uma das linhagens (MCF-7) com intuito de avaliar as alterações morfológicas desencadeadas pelo veneno. Os pontos de adesão focal e a organização dos filamentos de actina foram perturbados, bem como, observou-se a ligação das toxinas do veneno na superfície celular. Além disso, o tratamento com o veneno também degradou a matriz extracelular. Os resultados apontaram citotoxicidade do veneno de aranha marrom sobre a morfologia das células tumorais e, por conseguinte, possibilitam a utilização das toxinas do veneno como ferramentas viáveis para a pesquisa em Biologia Celular. A ação direta das toxinas do veneno de aranha marrom foi então novamente avaliada, desta vez utilizando uma proteína recombinante do veneno (LiRecDT), com ênfase no seu possível efeito nefrotóxico, como descrevemos para o veneno bruto. Nós postulamos que a toxina dermonecrótica (esfingomielinase- D), que é a proteína bioquímica e biologicamente melhor caracterizada do veneno de aranha marrom, poderia estar envolvida diretamente ao dano renal, pois suas características de carga e massa molecular são similares aos dados que obtivemos na detecção de proteínas do veneno bruto ligadas ao rim. Nesse ínterim, utilizando camundongos expostos a LiRecDT, nós evidenciamos a indução direta de injúria renal. Os achados histopatológicos de biópsias renais demonstraram alterações contundentes que incluem edema glomerular e necrose tubular. Houve deposição de material proteináceo no lúmen dos túbulos, vacuolização e lise de células epiteliais. Não foi visualizada infiltração de leucócitos em glomérulos e túbulos renais, bem como os vasos renais não evidenciaram sinais de resposta inflamatória. Na imunofluorescência por microscopia confocal foi demonstrada a ligação direta de LiRecDT no tecido renal. Por ensaio de "imunoblotting" de extrato de membrana renal de camundongo tratado com LiRecDT, que revelou a presença de um sinal positivo na região de 33-35 kDa, fato que fortalece a idéia de ação nefrotóxica direta da toxina dermonecrótica. A utilização de cultura de células epiteliais de rim canino (MDCK) permitiu novamente a observação da ligação de LiRecDT quando observadas por imunofluorescência em microscopia confocal. Similarmente, o tratamento de células MDCK com LiRecDT em cultura determinou alterações morfológicas de vacuolização citoplasmática, mudança do comportamento do perfil de espalhamento celular e adesão célula-célula. Em adição, a viabilidade celular foi avaliada pelo método de captação por endocitose de corante vital (Vermelho Neutro) e ensaio de XTT, sendo a redução dependente da concentração e tempo de exposição. Os presentes resultados corroboram para a idéia de que a toxina dermonecrótica, assim como o veneno bruto, denota em nefrotoxicidade direta sobre as células renais in vivo e in vitro. Os trabalhos decorrentes deste projeto contribuem para o entendimento dos mecanismos pelos quais os venenos de aranhas marrons desencadeiam um efeito citotóxico e, em especial, nefrotóxico observado no Loxoscelismo

A Novel Hyaluronidase from Brown Spider (Loxosceles intermedia) Venom (Dietrich's Hyaluronidase): From Cloning to Functional Characterization

Loxoscelism is the designation given to clinical symptoms evoked by Loxosceles spider's bites. Clinical manifestations include skin necrosis with gravitational spreading and systemic disturbs. the venom contains several enzymatic toxins. Herein, we describe the cloning, expression, refolding and biological evaluation of a novel brown spider protein characterized as a hyaluronidase. Employing a venom gland cDNA library, we cloned a hyaluronidase (1200 bp cDNA) that encodes for a signal peptide and a mature protein. Amino acid alignment revealed a structural relationship with members of hyaluronidase family, such as scorpion and snake species. Recombinant hyaluronidase was expressed as N-terminal His-tag fusion protein (similar to 45 kDa) in inclusion bodies and activity was achieved using refolding. Immunoblot analysis showed that antibodies that recognize the recombinant protein cross-reacted with hyaluronidase from whole venom as well as an anti-venom serum reacted with recombinant protein. Recombinant hyaluronidase was able to degrade purified hyaluronic acid (HA) and chondroitin sulfate (CS), while dermatan sulfate (DS) and heparan sulfate (HS) were not affected. Zymograph experiments resulted in similar to 45 kDa lytic zones in hyaluronic acid (HA) and chondroitin sulfate (CS) substrates. Through in vivo experiments of dermonecrosis using rabbit skin, the recombinant hyaluronidase was shown to increase the dermonecrotic effect produced by recombinant dermonecrotic toxin from L. intermedia venom (LiRecDT1). These data support the hypothesis that hyaluronidase is a spreading factor. Recombinant hyaluronidase provides a useful tool for biotechnological ends. We propose the name Dietrich's Hyaluronidase for this enzyme, in honor of Professor Carl Peter von Dietrich, who dedicated his life to studying proteoglycans and glycosaminoglycans.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundacao Araucaria-PR (FAP)Secretaria de Estado de Ciencia, Tecnologia e Ensino Superior do Parana (SETI)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Univ Fed Parana, Dept Cell Biol, BR-80060000 Curitiba, Parana, BrazilUniv Fed Parana, Clin Hosp, Dept Clin Pathol, BR-80060000 Curitiba, Parana, BrazilUniv Estadual Ponta Grossa, Dept Struct Mol Biol & Genet, Ponta Grossa, BrazilCatholic Univ Parana, Hlth & Biol Sci Inst, Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Phospholipase-D activity and inflammatory response induced by brown spider dermonecrotic toxin: Endothelial cell membrane phospholipids as targets for toxicity

Brown spider dermonecrotic toxins (phospholipases-D) are the most well-characterized biochemical constituents of Loxosceles spp. venom. Recombinant forms are capable of reproducing most cutaneous and systemic manifestations such as dermonecrotic lesions, hematological disorders, and renal failure. There is currently no direct confirmation for a relationship between dermonecrosis and inflammation induced by dermonecrotic toxins and their enzymatic activity. We modified a toxin isoform by site-directed mutagenesis to determine if phospholipase-D activity is directly related to these biological effects. the mutated toxin contains an alanine substitution for a histidine residue at position 12 (in the conserved catalytic domain of Loxosceles intermedia Recombinant Dermonecrotic Toxin - LiRecDT1). LiRecDT1H12A sphingomyelinase activity was drastically reduced, despite the fact that circular dichroism analysis demonstrated similar spectra for both toxin isoforms, confirming that the mutation did not change general secondary structures of the molecule or its stability. Antisera against whole venom and LiRecDT1 showed cross-reactivity to both recombinant toxins by ELISA and immunoblotting. Dermonecrosis was abolished by the mutation, and rabbit skin revealed a decreased inflammatory response to LiRecDT1H12A compared to LiRecDT1. Residual phospholipase activity was observed with increasing concentrations of LiRecDT1H12A by dermonecrosis and fluorometric measurement in vitro. Lipid arrays showed that the mutated toxin has an affinity for the same lipids LiRecDT1, and both toxins were detected on RAEC cell surfaces. Data from in vitro choline release and HPTLC analyses of LiRecDT1-treated purified phospholipids and RAEC membrane detergent-extracts corroborate with the morphological changes. These data suggest a phospholipase-D dependent mechanism of toxicity, which has no substrate specificity and thus utilizes a broad range of bioactive lipids. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.Secretaria de Estado de CienciaTecnologia e Ensino Superior (SETI) do ParanaFundacao Araucaria-PRFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Univ Fed Parana, Dept Cell Biol, BR-81531990 Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilUniv Estadual Ponta Grossa, Dept Struct Mol Biol & Genet, Ponta Grossa, BrazilCatholic Univ Parana, Hlth & Biol Sci Inst, Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biochem, São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Brown Spider (Loxosceles genus) Venom Toxins: Tools for Biological Purposes

Venomous animals use their venoms as tools for defense or predation. These venoms are complex mixtures, mainly enriched of proteic toxins or peptides with several, and different, biological activities. In general, spider venom is rich in biologically active molecules that are useful in experimental protocols for pharmacology, biochemistry, cell biology and immunology, as well as putative tools for biotechnology and industries. Spider venoms have recently garnered much attention from several research groups worldwide. Brown spider (Loxosceles genus) venom is enriched in low molecular mass proteins (5–40 kDa). Although their venom is produced in minute volumes (a few microliters), and contain only tens of micrograms of protein, the use of techniques based on molecular biology and proteomic analysis has afforded rational projects in the area and permitted the discovery and identification of a great number of novel toxins. The brown spider phospholipase-D family is undoubtedly the most investigated and characterized, although other important toxins, such as low molecular mass insecticidal peptides, metalloproteases and hyaluronidases have also been identified and featured in literature. The molecular pathways of the action of these toxins have been reported and brought new insights in the field of biotechnology. Herein, we shall see how recent reports describing discoveries in the area of brown spider venom have expanded biotechnological uses of molecules identified in these venoms, with special emphasis on the construction of a cDNA library for venom glands, transcriptome analysis, proteomic projects, recombinant expression of different proteic toxins, and finally structural descriptions based on crystallography of toxins

Mechanistic relationship between phospholipase activity and the toxic effects induced by the venom toxin dermonecrótica of brown spider (Loxosceles intermedia)

TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

Estudo da atividade citotóxica da proteína dermonecrótica do veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia) com enfase no efeito nefrotóxico

Orientador: Silvio Sanches VeigaCo-orientador: Waldemiro GremskiDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/02/2006Inclui bibliografiaOs acidentes envolvendo aranhas marrons (Loxosceles) tornaram-se um problema de saúde pública no Brasil e, por conseguinte, de grande relevância médica. O conjunto de sinais e sintomas observados em decorrência da picada de aranha marrom é denominado Loxoscelismo; o qual se caracteriza pelo desenvolvimento de lesão dermonecrótica e espalhamento gravitacional no local da picada (quadro local ou cutâneo) e, menos freqüentemente, distúrbios hematológicos e disfunção renal (quadro sistêmico ou cutâneo-visceral), maiores responsáveis pelos óbitos das vítimas. O conteúdo do veneno de Loxosceles e os mecanismos pelos quais induz tais alterações não está bem esclarecido e permanece sob investigação em seus vários segmentos. A presente dissertação tem intuito de aprofundar os conhecimentos quanto à ação citotóxica do veneno loxoscélico, destacando-se o efeito sobre a função renal. Alguns autores atribuem a falência renal como conseqüência das alterações da hemostase (principalmente, a anemia hemolítica) as quais têm sido descritas pelos dados clínicos como proteinúria, hematúria e hemoglobinúria. Além disso, a intensa reação inflamatória observada no local da picada, poderia também induzir a deposição de imunocomplexos que alterariam o fluxo de filtração glomerular e pelos túbulos renais, o que acarretaria na insuficiência renal aguda. Contudo, a literatura científica tem relatado que o veneno exerce ação direta sobre eritrócitos e plaquetas, induzindo hemólise intravascular, agregação plaquetária e coagulação intravascular disseminada; possui efeito inibitório sobre neutrófilos in vitro; além de efeitos citotóxicos em células endoteliais de cordão umbilical e de vasos sangüíneos de coelho. Tendo em vista todas essas informações, nós levantamos a hipótese de uma ação direta do veneno sobre as estruturas renais, visto que não existem evidências experimentais de que o veneno interaja com o tecido renal. Para tanto, utilizamos camundongos expostos ao veneno loxoscélico (modelo animal que não desenvolve a lesão dermonecrótica) e foi observada a indução de lesão renal. Biópsias renais destes animais em microscopia de luz evidenciaram alterações morfológicas contundentes que incluem acúmulo de material eosinofílico e eritrócitos extravasculares na cápsula de Bowman, colapso glomerular, citotoxicidade das células e deposição de material proteináceo no lúmen dos túbulos. Em microscopia eletrônica de transmissão, as alterações morfológicas incluem citotoxicidade de células epiteliais e endoteliais glomerulares e distúrbios na membrana basal renal, bem como alterações dos túbulos que apresentaram vacúolos na membrana citoplasmática, distúrbios mitocondriais, aumento do retículo liso, presença de autofagossomos. Nós observamos também que o veneno causa azotemia, com elevação do nível de uréia sangüíneo, embora não fora observada alteração dos níveis séricos de complemento C3 ou hemólise. Por meio de reações de imunofluorescência por microscopia confocal empregando anticorpos que reconhecem as proteínas do veneno, detectamos a ligação direta de toxinas loxoscélicas em estruturas renais. Ao se realizar dupla marcação de veneno, núcleo (por citoquímica com DAPI) e colágeno tipo IV e laminina, demostramos a deposição das toxinas em células epiteliais glomerulares e tubulares e em membrana basal, mas não houve marcação dos núcleos das células renais. Os dados da ligação direta da toxina ao rim foram reforçados pela constatação de que o veneno é rico em proteínas básicas e de baixa massa molecular em eletroforese bidimensional, o que explicaria o acesso (baixa massa) e a presença de toxinas loxoscélicas na membrana basal (aniônica). Em adição, houve a detecção de toxinas por "imunoblotting" na região de 30kDa de extrato de membrana de rins envenenados. Tais resultados corroboraram para a prospecção de uma possível ação citotóxica sobre linhagens celulares tumorais, as quais foram avaliadas quanto a morfologia celular, viabilidade e proliferação celular (pelos métodos de azul de Trypan e MTT, respectivamente), em concentrações e tempos crescentes. Todas as células assumiram uma forma arredondada e, em alguns casos, houve perda da adesividade ao substrato de cultura. No entanto, de modo geral, não foi observada alteração da viabilidade celular e a taxa de proliferação celular foi bastante variada entre as linhagens expostas ao veneno de Loxosceles. Por meio de técnicas de imunofluorescência por microscopia confocal e microscopia de luz com marcação de PAS, selecionamos uma das linhagens (MCF-7) com intuito de avaliar as alterações morfológicas desencadeadas pelo veneno. Os pontos de adesão focal e a organização dos filamentos de actina foram perturbados, bem como, observou-se a ligação das toxinas do veneno na superfície celular. Além disso, o tratamento com o veneno também degradou a matriz extracelular. Os resultados apontaram citotoxicidade do veneno de aranha marrom sobre a morfologia das células tumorais e, por conseguinte, possibilitam a utilização das toxinas do veneno como ferramentas viáveis para a pesquisa em Biologia Celular. A ação direta das toxinas do veneno de aranha marrom foi então novamente avaliada, desta vez utilizando uma proteína recombinante do veneno (LiRecDT), com ênfase no seu possível efeito nefrotóxico, como descrevemos para o veneno bruto. Nós postulamos que a toxina dermonecrótica (esfingomielinase- D), que é a proteína bioquímica e biologicamente melhor caracterizada do veneno de aranha marrom, poderia estar envolvida diretamente ao dano renal, pois suas características de carga e massa molecular são similares aos dados que obtivemos na detecção de proteínas do veneno bruto ligadas ao rim. Nesse ínterim, utilizando camundongos expostos a LiRecDT, nós evidenciamos a indução direta de injúria renal. Os achados histopatológicos de biópsias renais demonstraram alterações contundentes que incluem edema glomerular e necrose tubular. Houve deposição de material proteináceo no lúmen dos túbulos, vacuolização e lise de células epiteliais. Não foi visualizada infiltração de leucócitos em glomérulos e túbulos renais, bem como os vasos renais não evidenciaram sinais de resposta inflamatória. Na imunofluorescência por microscopia confocal foi demonstrada a ligação direta de LiRecDT no tecido renal. Por ensaio de "imunoblotting" de extrato de membrana renal de camundongo tratado com LiRecDT, que revelou a presença de um sinal positivo na região de 33-35 kDa, fato que fortalece a idéia de ação nefrotóxica direta da toxina dermonecrótica. A utilização de cultura de células epiteliais de rim canino (MDCK) permitiu novamente a observação da ligação de LiRecDT quando observadas por imunofluorescência em microscopia confocal. Similarmente, o tratamento de células MDCK com LiRecDT em cultura determinou alterações morfológicas de vacuolização citoplasmática, mudança do comportamento do perfil de espalhamento celular e adesão célula-célula. Em adição, a viabilidade celular foi avaliada pelo método de captação por endocitose de corante vital (Vermelho Neutro) e ensaio de XTT, sendo a redução dependente da concentração e tempo de exposição. Os presentes resultados corroboram para a idéia de que a toxina dermonecrótica, assim como o veneno bruto, denota em nefrotoxicidade direta sobre as células renais in vivo e in vitro. Os trabalhos decorrentes deste projeto contribuem para o entendimento dos mecanismos pelos quais os venenos de aranhas marrons desencadeiam um efeito citotóxico e, em especial, nefrotóxico observado no Loxoscelismo

Highlights in the knowledge of brown spider toxins

Abstract Brown spiders are venomous arthropods that use their venom for predation and defense. In humans, bites of these animals provoke injuries including dermonecrosis with gravitational spread of lesions, hematological abnormalities and impaired renal function. The signs and symptoms observed following a brown spider bite are called loxoscelism. Brown spider venom is a complex mixture of toxins enriched in low molecular mass proteins (4–40 kDa). Characterization of the venom confirmed the presence of three highly expressed protein classes: phospholipases D, metalloproteases (astacins) and insecticidal peptides (knottins). Recently, toxins with low levels of expression have also been found in Loxosceles venom, such as serine proteases, protease inhibitors (serpins), hyaluronidases, allergen-like toxins and histamine-releasing factors. The toxin belonging to the phospholipase-D family (also known as the dermonecrotic toxin) is the most studied class of brown spider toxins. This class of toxins single-handedly can induce inflammatory response, dermonecrosis, hemolysis, thrombocytopenia and renal failure. The functional role of the hyaluronidase toxin as a spreading factor in loxoscelism has also been demonstrated. However, the biological characterization of other toxins remains unclear and the mechanism by which Loxosceles toxins exert their noxious effects is yet to be fully elucidated. The aim of this review is to provide an insight into brown spider venom toxins and toxicology, including a description of historical data already available in the literature. In this review article, the identification processes of novel Loxosceles toxins by molecular biology and proteomic approaches, their biological characterization and structural description based on x-ray crystallography and putative biotechnological uses are described along with the future perspectives in this field

The effect of brown spider venom on endothelial cell morphology and adhesive structures

Spiders of the Loxosceles genus have been responsible for severe clinical cases of envenomation worldwide. Accidents involving brown spiders can cause dermonecrotic injury, hemorrhage, hemolysis, platelet aggregation and renal failure. Histological findings of animals treated by venom have shown subendothelial blebs, vacuoles and endothelial cell membrane degeneration of blood vessel walls, as well as fibrin and thrombus formation. the mechanisms by which the venom causes these disorders are poorly understood. in this work, with an endothelial cell line derived from rabbit aorta, we were able to demonstrate that venom binds to the cell surface and the extracellular matrix. Moreover, we observed that the venom also induced morphological alterations, such as cell retraction, homophilic disadhesion and an increasing in filopodia projections. We also demonstrated that toxins present in the venom disorganized focal adhesion points and actin microfilaments of endothelial cells. Nevertheless, endothelial cell viability showed no alterations compared to controls. Additionally, venom treatment changed the fibronectin matrix profile synthesized by these cells as well as cell adhesion to fibronectin. These results suggest that the deleterious effects of venom on blood vessel walls could be a consequence of the direct effect on the endothelial cell surface and adhesive structures involved in blood vessel stability. These effects indirectly lead to leukocyte and platelet activation, disseminated intravascular coagulation and an increase in vessel permeability. (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.Univ Fed Parana, Dept Cell Biol, BR-81531990 Curitiba, Parana, BrazilUNIFESP, Dept Med, Med Clin Discipline, São Paulo, BrazilCatholic Univ Parana, Hlth & Biol Sci Inst, Curitiba, Parana, BrazilUNIFESP, Dept Biochem, São Paulo, BrazilUNIFESP, Dept Med, Med Clin Discipline, São Paulo, BrazilUNIFESP, Dept Biochem, São Paulo, BrazilWeb of Scienc