Role of hypoxia and hypoxia inducible factors (HIFs) in cells of Ewing’s Sarcoma Family Tumors

Ewing’s Sarcoma Family Tumors (ESFT) sind die am zweithäufigsten auftretenden Knochen- und Weichteil-tumore bei Kindern und Jugendlichen. ESFT sind äußerst aggressive und stark metastasierende Tumore, welche durch chromosomale Translokationen zwischen dem EWSR1 Gen sowie Genen der Familie der ETS Transkriptions-Faktoren charakterisiert sind. Die am häufigsten auftretende Translokation t(11;22)(q24;q12) umfasst die Fusion des EWSR1 Gens mit dem Fli1 Gen und tritt in 80-85% der Fälle auf. Interessanterweise sind viele Eigenschaften der ESFT generell typisch für hypoxische Tumoren. Dazu zählt eine erhöhte Tumor-Aggressivität, die mit hohem Metastasierungspotential und einer damit verbundenen schlechten Prognose einhergeht. Viele solide Tumore sind hypoxisch und reagieren auf diese Bedingungen hauptsächlich mit der Regulation des hypoxia inducible factors-1α (HIF-1α). Da die Rolle von Hypoxie und im Speziellen von HIF-1α in der Bösartigkeit von Ewing Sarkomen noch weitestgehend unbekannt ist, wurde die Rolle der hypoxia inducible factors in ESFT Zelllinien untersucht. Um HIF-1α zu induzieren wurden die Zelllinien TC252 und SK-N-MC sowohl mit Cobalt Chlorid als auch mit Desferrioxamin behandelt, welche anerkannter Weise den Zustand der Hypoxie imitieren. Tatsächlich konnte HIF-1α, sowohl in einer Konzentrations- als auch in einer Zeit-abhängigen Art und Weise, nachgewiesen werden. Interessanterweise, wurde nicht nur HIF-1α, sondern auch EWS-Fli1 induziert. Da EWS-Fli1 als möglicher therapeutischer Angriffspunkt in ESFT gilt, wurde im Folgenden untersucht, ob der erhöhte EWS-Fli1 Level von HIF-1α abhängig oder unabhängig ist. Hierfür wurden einerseits sowohl Wildtyp HIF-1α als auch mutiertes HIF-1α, welches eine P564A und N803A Mutation in der (oxygen degradation domain) trägt, über- exprimiert, andererseits wurde HIF-1α durch Verwendung von shRNA gezielt ausgeschaltet. Beide Experimente zeigten, dass EWS-Fli1 Protein in einer HIF-1α abhängigen Art und Weise reguliert wurde, die EWS-Fli1-mRNA hingegen blieb unverändert. Um festzustellen, ob Hypoxie funktionelle Konsequenzen zur Folge hat, wurde sowohl Proliferation, Migration, als auch das Invasions-Potential von ESFT Zelllinien untersucht. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass das Invasions-Potential durch Hypoxie erhöht wurde, während keine Unterschiede im Proliferation- und Migration- Verhalten nachweisbar waren.Ewing’s Sarcoma Family Tumors (ESFT) are the second most common malignancy of children and young adults that affect mostly soft tissue and solid bone. ESFT are very aggressive and highly metastatic, and are characterized by chromosomal translocations involving the EWSR1 gene and several ETS transcription factor genes. The most frequently observed translocation, t(11;22)(q24;q12), results in the fusion of portions of the EWSR1 gene with the Fli1 (Friend leukemia integration site 1) transcription factor gene, and is observed in 80-85% of all cases. Interestingly, many attributes of ESFT are typically associated with hypoxia in many tumor entities and linked to high metastatic potential and bad prognosis. Solid tumors have been shown to respond to hypoxia mainly via hypoxia inducible factor- 1α (HIF-1α). Since the role of hypoxia and especially the contribution of HIF-1α to the aggressiveness of ESFT remain unknown, we aimed at clarifying the role of hypoxia inducible factors in ESFT cell lines. For that purpose, we first checked whether HIF-1α can be induced in the ESFT cell lines TC252 and SK-N-MC by using the canonical hypoxia mimetics cobalt chloride (CoCl2) and Desferrioxamine (DFX). We showed that HIF-1α was induced both in a dose- and time-dependent manner. Notably, increased HIF-1α protein levels were accompanied by elevated EWS-Fli1 levels, indicating that hypoxia might regulate EWS-Fli1 which is discussed as a possible therapeutic target in ESFT. To reveal, whether this finding was HIF-1α dependent or independent, we first over-expressed either a wild-type version of HIF-1α or a mutant version, baring the P564A and N803A mutations within the oxygen degradation domain. Secondly, we performed knockdown studies using shRNA targeting HIF-1α. Both experiments revealed that EWS-Fli1 protein is regulated in a HIF-1α dependent manner, whereas EWS-Fli1 mRNA levels remained unchanged. To analyse whether hypoxia has any functional consequence on ESFT cell lines in vitro we further performed proliferation, migration and invasion assays. The latter clearly showed that hypoxia enhances the invasive capability of ESFT cell lines whereas no significant effect on proliferation and migration was observed

Mechanisms of transcriptional repression by EWS-FLI1 in Ewing Sarcoma

Ewing Sarkome (ES), die am zweithäufigst auftretenden Tumore der Knochen und Weichteile bei Kindern und Jugendlichen, werden genetisch durch die Genfusion EWS-FLI1 als Folge einer chromosomalen Translokation charakterisiert. EWS-FLI1 kodiert für einen äusserst potenten Transkriptionsfaktor, welcher sowohl Gen aktivierende als auch Gen repremierende Eigenschaften besitzt. Obwohl EWS-FLI1 als transkriptioneller Hauptregulator in ES fungiert, ist dennoch nur sehr wenig über Mechanismen der Genregulation und im Speziellen, der transkriptionellen Repression bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Promotoren von EWS-FLI1 reprimierten Genen eine Anreicherung von Motiven für Bindung von Forkhead Box Transkriptionsfaktoren zeigen. Des Weiteren konnte FOXO1 als ein EWS-FLI1 reprimierter transkriptioneller Meisterregulator identifiziert werden, welcher signifikant zur repressiven transkriptionellen Signatur von EWS-FLI1 beiträgt. FOXO1 wird dabei einerseits direkt durch Bindung von EWS-FLI1 an dessen Promotor transkriptionell, aber auch post-transkriptionell über inhibitorische Phosphorylierung durch CDK2 und AKT unterdrückt, welche die sub-zelluläre Lokalisation und somit die transkriptionelle Aktivität von FOXO1 regulieren. Durch die funktionelle Re-Expression von nukleärem FOXO1 konnte eine signifikant reduzierte Proliferation, als auch Klonogenizität in ES Zelllinien in vitro gezeigt werden. Profile von Experimenten zur Genexpression konnten zeigen, dass es eine signifikante Überlappung zwischen EWS-FLI1 reprimierten und FOXO1 aktivierten Genen gibt. Eine Reaktivierung von endogenen FOXO1 durch Verwendung von Methylselen Säure (MSA), im Beisein von EWS-FLI1, konnte eine Zeit- und Konzentrations-Abhängigkeit sowie Induktion von Zelltod, welcher zumindest teilweise auf die Reaktivierung von FOXO1 zurückzuführen ist, in vitro bewirken. Durch Verwendung eines orthotopen Maus Xenograft Modells konnte gezeigt werden, dass MSA behandelte Mäuse ein signifikant verringertes Tumor Wachstum und gleichzeitig erhöhte FOXO1 Expression aufweisen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine EWS-FLI1 vermittelt repressive Sub-Signatur durch die Unterdrückung des Tumorsuppressors FOXO1 ausgelöst ist. Deshalb könnte die Reaktivierung von FOXO1 durch niedermolekulare Substanzen eine neue therapeutische Strategie zur Behandlung von ES Patienten darstellen.The EWS-FLI1 chimeric oncoprotein characterizing Ewing Sarcoma (ES) is a prototypic aberrant ETS transcription factor with activating and repressive gene regulatory functions. Mechanisms of transcriptional regulation, especially transcriptional repression by EWS-FLI1, are poorly understood. We report that EWS-FLI1 repressed promoters are enriched in forkhead box recognition motifs, and identify FOXO1 as a EWS-FLI1 suppressed master regulator responsible for a significant subset of EWS-FLI1 repressed genes. In addition to transcriptional FOXO1 regulation by direct promoter binding of EWS-FLI1, its subcellular localization and activity is regulated by CDK2 and AKT mediated phosphorylation downstream of EWS-FLI1. Functional restoration of nuclear FOXO1 expression in ES cells impaired proliferation and significantly reduced clonogenicity. Gene-expression profiling revealed a significant overlap between EWS-FLI1 repressed and FOXO1-activated genes. Treatment of ES cell lines with Methylseleninic acid (MSA) evoked reactivation of endogenous FOXO1 in the presence of EWS-FLI1 in a dose- and time-dependent manner and induced massive cell death which was found to be partially FOXO1-dependent. In an orthotopic xenograft mouse model, MSA increased FOXO1 expression in the tumor paralleled by a significant decrease in ES tumor growth. Together, these data suggest that a repressive sub-signature of EWS-FLI1 repressed genes precipitates suppression of FOXO1. FOXO1 re-activation by small molecules may therefore constitute a novel therapeutic strategy in the treatment of ES

Factors Affecting EWS-FLI1 Activity in Ewing's Sarcoma

Ewing's sarcoma family tumors (ESFT) are characterized by specific chromosomal translocations, which give rise to EWS-ETS chimeric proteins. These aberrant transcription factors are the main pathogenic drivers of ESFT. Elucidation of the factors influencing EWS-ETS expression and/or activity will guide the development of novel therapeutic agents against this fatal disease

The First European Interdisciplinary Ewing Sarcoma Research Summit

The European Network for Cancer Research in Children and Adolescents (ENCCA) provides an interaction platform for stakeholders in research and care of children with cancer. Among ENCCA objectives is the establishment of biology-based prioritization mechanisms for the selection of innovative targets, drugs, and prognostic markers for validation in clinical trials. Specifically for sarcomas, there is a burning need for novel treatment options, since current chemotherapeutic treatment protocols have met their limits. This is most obvious for metastatic Ewing sarcoma (ES), where long term survival rates are still below 20%. Despite significant progress in our understanding of ES biology, clinical translation of promising laboratory results has not yet taken place due to fragmentation of research and lack of an institutionalized discussion forum. To fill this gap, ENCCA assembled 30 European expert scientists and five North American opinion leaders in December 2011 to exchange thoughts and discuss the state of the art in ES research and latest results from the bench, and to propose biological studies and novel promising therapeutics for the upcoming European EWING2008 and EWING2012 clinical trials