Clinical Usefulness of Serum (1→3)-β-D-glucan Measurement in the Diagnosis of Fungemia

Background:Early recognition of fungemia is essential for successful treatment. However, methods to culture fungus specimen taken from fungemia patients are difficult and time consuming. To assess the clincal usefulness of β-D-glucan in the detection of fungemia, we compared serum (1→3)-β-D-glucan concentrations in fungemia, bacteremia, and healthy persons. Methods:From August 2001 to October 2002, serum (1→3)-β-D-glucan concentrations were measured by turbidometric assay in 16 fungemia patients, 13 bacteremia patients and 18 healthy persons. Differences in (1→3)-β-D-glucan concentrations between fungemia patients and other groups were compared by t-test. Results:Fungemia patients were composed of 10 male and 6 female patients, and mean age was 52.9±16.2 years. The cut-off value for a positive result was 11 pg/mL. thirteen out of 16 fungemia patients had concentrations above the cul-off value (range:11.5-863 pg/mL, sensitivity:81.3%, specificity:100%), and mean concentration in fungemia was 217.8±273.8 pg/mL. Mean concentration in bacteremia was 0.1±0.3 pg/mL, and all the patients with bacteremia had the concentrations below the cut-off value. Mean concentration in the healthy persons was 0 pg/mL and all healthy persons had concentration below the cut-off value. The concentration in fungemia was statistically significantly higher than those of the other two groups(p-value: respectively 0.006, 0.006) Conclusion:We concluded that serum (1→3)-β-D-glucan is useful for the diagnosis of fungemia. Further study on the usefullness of serum (1→3)-β-D-glucan for early detection of fungemia and therapeutic monitoring is warranted.ope

Stellenwert von (1-3)-β-D-Glucan zur Vorhersage einer invasiven Pilzinfektion und Assoziation mit dem Schweregrad der Organdysfunktion bei kritisch kranken Patienten mit und ohne Sepsis

Die Diagnostik invasiver fungaler Infektionen (IFI) bei Patienten auf Intensivstation ist schwierig. Wichtig ist aber eine frühzeitige Diagnose zur raschen Therapieeinleitung, um die Mortalität zu senken. Kulturelle Verfahren sind zeitaufwendig und besitzen eine niedrige Sensitivität. Nichtkulturelle Verfahren sind als alleiniges Diagnostikum noch nicht in der Praxis etabliert. Diese Arbeit analysiert prospektiv monozentrisch den Stellenwert von (1-3)-β-D-Glucan (BDG) für den Nachweis einer IFI und stellt Assoziationen mit dem Schweregrad der Organdysfunktion bei kritisch kranken Patienten her. In einem Dreijahres-Zeitraum wurde BDG im Serum von 57 Patienten mit schwerer Sepsis oder septischem Schock (Gruppe 1) und von 61 Patienten nach kardiochirurgischer Operation (Gruppe 2) über sieben Tage und dann wöchentlich bis Tag 28 bestimmt. Die Messung erfolgte kolorimetrisch (MARUHA®-Testkit, Firma WAKO). Die Ergebnisse wurden mit dem Goldstandard (kultureller Candida-Nachweis) verglichen. In Gruppe 1 lagen die BDG-Werte in der ersten Woche um den Cut-Off-Wert von 11 pg/ml, während Patienten der Gruppe 2 über fünf Tage signifikant höhere BDG-Werte aufwiesen, ohne dass jedoch eine IFI vorlag. Bei neun Patienten in der Gruppe 1 war eine IFI nachweisbar. Sensitivität und Spezifität von BDG für den IFI- Nachweis zum Einschlusszeitpunkt betrugen 67 bzw. 50 %, der positive und negative prädiktive Wert 24 bzw. 88 %. Folglich schließt ein negativer BDG-Wert eine IFI nahezu aus. Die BDG-Spiegel über 28 Tage zeigten weder die Schwere der Infektion noch das Outcome an. BDG-Werte von überlebenden und verstorbenen Patienten waren nicht signifikant unterschiedlich. Gesamt-SOFA-Score und Subscores korrelierten nur schwach mit den BDGSpiegeln (Korrelationskoeffizient 0,22). Der Blutkontakt zu Fremdoberflächen wie HLM kann zu falsch hohen BDG-Werten führen können

Urinary Excretion of (1-3)-Beta-D-Glucans.

(1→3)-β-D-Glucans are carbohydrate polymers that are present in the cell wall of various fungi and bacteria; they are pathogen associated molecular patterns that circulate during infection and modulate immunity. Our laboratory has previously established the pharmacokinetics of intravenously and orally administered glucans; the present studies investigated the renal excretion of (1→3)-β-D-glucans following intravenous and oral administration. Three fluorescently-labeled glucans were administered to adult male rats in the presence or absence of toxic challenge. Urine specimens were collected and analyzed by fluorescence spectroscopy, size-exclusion chromatography and GPC/MALLS. 71 ± 3% of fluorescence remained in the \u3e5K MWCO fraction; this fraction showed a minor peak with a molecular mass (171 ± 11K) corresponding to injected glucan (~150K). Most excreted glucans were of lower molecular mass (13 ± 8.5K), indicating most (1→3)-β-D-glucans are excreted by the kidneys as smaller polysaccharides. The presence of urinary glucans may be an important indicator of fungal infection

Utilidade clínica do (1->3) B-D-glucano como marcador laboratorial no diagnóstico de pneumonia por Pneumocystis jirovecii

A pneumonia por Pneumocystis jirovecii (PPc) é uma das principais causas de morte em doentes imunocomprometidos, revestindo-se assim de elevado interesse o diagnóstico precoce desta infecção, por forma a instaurar a terapêutica adequada. Actualmente, os meios laboratoriais de diagnóstico baseiam-se fundamentalmente na detecção directa deste microrganismo nas secreções pulmonares dos doentes, o que implica a realização de procedimentos invasivos. É nessa perspectiva que surge o doseamento do β-glucano no soro de doentes com presumível infecção, uma vez que, este composto é um dos principais componentes da parede dos quistos de P. jirovecii. Neste estudo procedeu-se ao doseamento do β-glucano em amostras de soro de 66 indivíduos e verificou-se que, nos 47 indivíduos que confirmaram o diagnóstico de PPc, a mediana de β-glucano obtida foi de 314,5 pg/mL, enquanto nos restantes 19 foi de 63,7 pg/mL. Estatisticamente obteve-se uma forte correlação entre níveis elevados de β-glucano no soro de doentes e a presença de infecção por P. jirovecii. Em relação ao diagnóstico clínico, os resultados obtidos demonstraram correlação entre um diagnóstico clinico sugestivo de PPc e níveis elevados de β-glucano no soro. Constatou-se ainda que, para a infecção por P. jirovecii o cut-off que apresentou melhores resultados para o teste Fungitell® situa-se nos 100 pg/mL, obtiveram-se resultados de sensibilidade de 89% e especificidade de 74%. Estudos preliminares apontaram para o facto de níveis elevados de β-glucano no soro corresponderem a níveis elevados de parasitémia e uma evolução clínica negativa da doença.Pneumocystis jirovecii pneumonia (PcP) is a leading cause of death in immunocompromised patients, covering thus of great interest for early diagnosis of this infection, in order to provide appropriate therapy. Currently, diagnostic laboratory are mainly based on direct detection of this microorganism in the pulmonary secretions of patients, which involves invasive procedures. In this perspective, there is the determination of β-glucan in the serum of patients with suspected infection, since this compound is a major component of the cyst wall of P. jirovecii. In this study proceeded to the determination of β-glucan in serum samples from 66 individuals and found that in 47 individuals who confirmed the diagnosis of PCP, the median β-glucan obtained was 314.5 pg / mL, while the remaining 19 was 63.7 pg / mL. Statistically it was found a strong correlation between high levels of β-glucan in the serum and the presence of infection by P. jirovecii. In relation to clinical diagnosis, the results showed a correlation between clinical diagnosis suggestive of PcP and high levels of β-glucan in the serum. It was further observed that for infection with P. jirovecii the cut-off showed better results for the test Fungitell ® is located at 100 pg / mL with the results of sensitivity of 89% and specificity of 74%. Preliminary studies pointed to the fact that high levels of β-glucan in serum correspond to high levels of parasitemia and a negative clinical course of disease

Fungal genomics in respiratory medicine: what, how and when?

Respiratory infections caused by fungal pathogens present a growing global healthconcern and are a major cause of death in immunocompromised patients. Worryingly,coronavirus disease-19 (COVID-19) resulting in acute respiratory distress syndrome,has been shown to predispose some patients to fungal co-infection and secondarypulmonary aspergillosis. Aspergillosis is most commonly caused by the fungalpathogen Aspergillus fumigatus and primarily treated using the triazole drug group,however in recent years, this fungus has been rapidly gaining resistance against theseantifungals. This is of serious clinical concern as multi-azole resistant forms ofaspergillosis have a higher risk of mortality when compared against azole-susceptibleinfections. With the increasing numbers of COVID-19 and other classes ofimmunocompromised patients, early diagnosis of fungal infections is critical to ensuringpatient survival. However, time-limited diagnosis is difficult to achieve with currentculture-based methods. Advances within fungal genomics have enabled moleculardiagnostic methods to become a fast, reproducible, and cost-effective alternative fordiagnosis of respiratory fungal pathogens and detection of antifungal resistance. Herewe describe what techniques are currently available within molecular diagnostics, howthey work and when they have been used

Crf2 - A novel antigen of Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitärer Schimmelpilz, der durch Inhalation seiner Sporen bei immunsupprimierten und immungeschwächten Patienten eine letale Invasive Aspergillose (IA) auslöst. Aus der mRNA eines klinischen Patientenisolats wurde die cDNA einer neuen, sequenzhomologen Variante der Glykosylhydrolase Crf1 isoliert, die als Crf2 bezeichnet wurde. Rekombinant hergestelltes Crf2 erwies sich in einer aktiven Immunisierung gegen die IA im Mausmodell als protektiv und die Mausseren wurden zur Kartierung der immunogenen Epitope von Crf2 und der sequenzhomologen Glykosylhydrolasen Crf1 und Asp f16 eingesetzt. In der Immunfluoreszenzmikroskopie wurden mit den Immunseren ausschließlich Bereiche aktiven Wachstums auf den Hyphen von A. fumigatus gefärbt und nicht seine ruhenden Sporen. Für die Generierung rekombinanter Crf2-spezifischer Antikörper wurde die Phagen-Display-Technologie eingesetzt. Die Antikörperselektion wurde mit der Antikörpergenbibliothek HAL4/7 und der neu generierten Makaken-Immunantikörpergenbibliothek MAYKI, mit jeweils zwei unterschiedlichen Selektionsstrategien, durchgeführt. Die Wahl der Selektionsmethode hatte für die isolierten Antikörper einen erheblichen Einfluss auf die Art der von ihnen erkannten Epitope. Es wurden gegen direkt immobilisiertes Crf2-Protein nur scFv-Fragmente gegen lineare Epitope und gegen das biotinylierte Antigen in Lösung nur Antikörperfragmente gegen konformationelle Epitope isoliert. Für Antikörperfragmente gegen lineare Epitope des Crf2-Proteins, wurde im capture-ELISA eine geringere Nachweisgrenze festgestellt und zudem eine intensivere Färbung der Hyphen in der Immunfluoreszenz. Die rekombinanten anti-Crf2 Antikörper zeigten ein ähnliches Färbemuster wie die anti-Crf2 Mausseren und wiesen keine Kreuzreaktionen mit anderen humanpathogenen Pilzen auf. Abschließend wurde die Affinität der isolierten Antikörper mittels Oberflächenplasmonresonanztechnologie bestimmt.Aspergillus fumigatus is an ubiquitous mould that causes a lethal invasive aspergillosis (IA) in immunosuppressed and immunocompromised persons via the inhalation of its spores. The cDNA of a new sequence homologue variant of the glycosylhydrolase crf1, called crf2, was isolated from the mRNA of a clinical isolate. The recombinant Crf2-protein was found to be protective in an active immunisation with mice against IA. The immunogenic epitopes of the Crf2-protein and its sequence homologues glycosylhydrolases Crf1 and Asp f16 were determined using these mice sera. Contrary to dormant spores, with these sera were in the immunofluorescence microscopy exclusevely areas of active growing, on hyphaes of A. fumigatus, stained. The phage-display-technology was used to generate recombinant anti-Crf2 antibodies. The antibody selection was performed with the antibody gene library HAL 4/7 and the new generated immune antibody gene library MAYKI, derived from a macaque, in two different selection stratagies. The choice of selection strategy had an enormous influence on the character of the bound epitopes. ScFvs against linear epitopes were only isolated on direct coated Crf2-protein and scFvs against conformational epitopes were isolated when the selection was performed with in vivo biotinylated protein in solution. The detection limit of soluble antigen in the Crf2-capture-ELISA was lower when using scFvs binding linear epitopes and additional showed these scFvs a more intensive staining of hyphae in the immunofluorescence. The recombinant anti-Crf2 antibodies had a similar staining pattern as the anti-Crf2 immune sera of Crf2-immunised mice and did not show any cross reaction with other humanpathogenic fungi. Finally, the affinity for some antibody fragments were determined via the surface plasmon resonance technolog

Crf2 - A novel antigen of Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitärer Schimmelpilz, der durch Inhalation seiner Sporen bei immunsupprimierten und immungeschwächten Patienten eine letale Invasive Aspergillose (IA) auslöst. Aus der mRNA eines klinischen Patientenisolats wurde die cDNA einer neuen, sequenzhomologen Variante der Glykosylhydrolase Crf1 isoliert, die als Crf2 bezeichnet wurde. Rekombinant hergestelltes Crf2 erwies sich in einer aktiven Immunisierung gegen die IA im Mausmodell als protektiv und die Mausseren wurden zur Kartierung der immunogenen Epitope von Crf2 und der sequenzhomologen Glykosylhydrolasen Crf1 und Asp f16 eingesetzt. In der Immunfluoreszenzmikroskopie wurden mit den Immunseren ausschließlich Bereiche aktiven Wachstums auf den Hyphen von A. fumigatus gefärbt und nicht seine ruhenden Sporen. Für die Generierung rekombinanter Crf2-spezifischer Antikörper wurde die Phagen-Display-Technologie eingesetzt. Die Antikörperselektion wurde mit der Antikörpergenbibliothek HAL4/7 und der neu generierten Makaken-Immunantikörpergenbibliothek MAYKI, mit jeweils zwei unterschiedlichen Selektionsstrategien, durchgeführt. Die Wahl der Selektionsmethode hatte für die isolierten Antikörper einen erheblichen Einfluss auf die Art der von ihnen erkannten Epitope. Es wurden gegen direkt immobilisiertes Crf2-Protein nur scFv-Fragmente gegen lineare Epitope und gegen das biotinylierte Antigen in Lösung nur Antikörperfragmente gegen konformationelle Epitope isoliert. Für Antikörperfragmente gegen lineare Epitope des Crf2-Proteins, wurde im capture-ELISA eine geringere Nachweisgrenze festgestellt und zudem eine intensivere Färbung der Hyphen in der Immunfluoreszenz. Die rekombinanten anti-Crf2 Antikörper zeigten ein ähnliches Färbemuster wie die anti-Crf2 Mausseren und wiesen keine Kreuzreaktionen mit anderen humanpathogenen Pilzen auf. Abschließend wurde die Affinität der isolierten Antikörper mittels Oberflächenplasmonresonanztechnologie bestimmt.Aspergillus fumigatus is an ubiquitous mould that causes a lethal invasive aspergillosis (IA) in immunosuppressed and immunocompromised persons via the inhalation of its spores. The cDNA of a new sequence homologue variant of the glycosylhydrolase crf1, called crf2, was isolated from the mRNA of a clinical isolate. The recombinant Crf2-protein was found to be protective in an active immunisation with mice against IA. The immunogenic epitopes of the Crf2-protein and its sequence homologues glycosylhydrolases Crf1 and Asp f16 were determined using these mice sera. Contrary to dormant spores, with these sera were in the immunofluorescence microscopy exclusevely areas of active growing, on hyphaes of A. fumigatus, stained. The phage-display-technology was used to generate recombinant anti-Crf2 antibodies. The antibody selection was performed with the antibody gene library HAL 4/7 and the new generated immune antibody gene library MAYKI, derived from a macaque, in two different selection stratagies. The choice of selection strategy had an enormous influence on the character of the bound epitopes. ScFvs against linear epitopes were only isolated on direct coated Crf2-protein and scFvs against conformational epitopes were isolated when the selection was performed with in vivo biotinylated protein in solution. The detection limit of soluble antigen in the Crf2-capture-ELISA was lower when using scFvs binding linear epitopes and additional showed these scFvs a more intensive staining of hyphae in the immunofluorescence. The recombinant anti-Crf2 antibodies had a similar staining pattern as the anti-Crf2 immune sera of Crf2-immunised mice and did not show any cross reaction with other humanpathogenic fungi. Finally, the affinity for some antibody fragments were determined via the surface plasmon resonance technolog

Terapia anticipada de Aspergilosis Invasora en pacientes oncohematológicos de alto riesgo mediante el uso de PCR para la detección precoz de Aspergillus. Estudio de los polimorfismos genéticos de la vía NFKB y su implicación en las Arpergilosis Invasora

[ES] La aspergilosis invasora (AI) es un problema fundamental en el manejo de muchos pacientes hematológicos, por lo que es esencial un diagnóstico precoz que permita instaurar un tratamiento adecuado lo antes posible con el fin de disminuir la morbimortalidad de esta complicación. Nuestra hipótesis es que la asociación del galactomanano con una técnica de detección del ADN de aspergillus, como es la PCR de aspergillus, podría reducir la incidencia de AI probable o probada según los criterios de la EORTC/MSG 2008. Para ello se pone en marcha el estudio TERAPIA ANTICIPADA DE ASPERGILOSIS INVASORA EN PACIENTES ONCOHEMATOLÓGICOS DE ALTO RIESGO MEDIANTE LA DETECCIÓN PRECOZ DE PCR DE ASPERGILLUS (PCRAGA). Se trata de un estudio multicéntrico, randomizado y prospectivo en 13 Servicios de Hematología y Hemoterapia en España llevado a cabo entre Febrero de 2011 y Julio de 2012. Se incluyeron 224 pacientes, que fueron randomizados en dos grupos; uno caracterizado por el seguimiento por PCR y Galactomanano, y otro cuyo seguimiento se realizó sólo con galactomanano. Se extraían 2 muestras semanales y, en el caso de positivizar alguna de ellas, se iniciaba un tratamiento antifúngico. 203 pacientes fueron válidos para el análisis. El numero de aspergilosis probables o probadas fue significativamente menor en el grupo de combinación de ambas técnicas; es decir, la estrategia de combinación de las dos técnicas consiguió una reducción global de aspergilosis invasoras probables o probadas de un 8,9%. El 69% de las aspergilosis del grupo de combinación de las dos técnicas fueron posibles, probablemente por un diagnóstico más precoz de la infección gracias a la PCR. Además el uso de tratamiento antifúngico empírico y, lo más importante, la necesidad de iniciar un tratamiento antifúngico dirigido, fue menor en el grupo de combinación de ambas técnicas. Aunque no se pudieron establecer diferencias significativas con respecto a la mortalidad, la mortalidad atribuible a aspergilosis invasora parece ser menor en el grupo de combinación de las dos técnicas. En una segunda parte del trabajo , se estudió si existían ciertos polimorfismos genéticos de la vía de señalización NFKB que podían aumentar o reducir el riesgo de desarrollar una aspergilosis invasora. La población de estudio estaba constituida por 822 pacientes de alto riesgo del consorcio aspBIOmics, población del estudio PCRAGA, muestras de los hospitales general del Valencia, Universitario de Salamanca y Universidad de Perugia (Italia). El genotipado de los SNPs seleccionados se realizó mediante técnicas basadas en PCR y de acuerdo a los protocolos establecidos por las respectivas casas comerciales. Se observó que la variante rs11574851 del gen NFKB2 aumenta por 2 el riesgo de desarrollar una aspergilosis invasora, la variante rs12203592 del gen IRF4 aumenta casi por 4 el riesgo de desarrollar una aspergilosis invasora. Por el contrario la variante rs2288918 parece ser un factor protector de aspergilosis invasora. Además, si seleccionamos una población de 173 pacientes sometidos a trasplante, observamos que la variante rs12203592 del gen IRF4 aumenta casi 6 veces el riesgo de desarrollar una aspergilosis invasora