Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitärer Schimmelpilz, der durch Inhalation seiner Sporen bei immunsupprimierten und immungeschwächten Patienten eine letale Invasive Aspergillose (IA) auslöst. Aus der mRNA eines klinischen Patientenisolats wurde die cDNA einer neuen, sequenzhomologen Variante der Glykosylhydrolase Crf1 isoliert, die als Crf2 bezeichnet wurde.
Rekombinant hergestelltes Crf2 erwies sich in einer aktiven Immunisierung gegen die IA im Mausmodell als protektiv und die Mausseren wurden zur Kartierung der immunogenen Epitope von Crf2 und der sequenzhomologen Glykosylhydrolasen Crf1 und Asp f16 eingesetzt. In der Immunfluoreszenzmikroskopie wurden mit den Immunseren ausschließlich Bereiche aktiven Wachstums auf den Hyphen von A. fumigatus gefärbt und nicht seine ruhenden Sporen. Für die Generierung rekombinanter Crf2-spezifischer Antikörper wurde die Phagen-Display-Technologie eingesetzt. Die Antikörperselektion wurde mit der Antikörpergenbibliothek HAL4/7 und der neu generierten Makaken-Immunantikörpergenbibliothek MAYKI, mit jeweils zwei unterschiedlichen Selektionsstrategien, durchgeführt. Die Wahl der Selektionsmethode hatte für die isolierten Antikörper einen erheblichen Einfluss auf die Art der von ihnen erkannten
Epitope. Es wurden gegen direkt immobilisiertes Crf2-Protein nur scFv-Fragmente gegen lineare Epitope und gegen das biotinylierte Antigen in Lösung nur Antikörperfragmente gegen konformationelle Epitope isoliert. Für Antikörperfragmente gegen lineare Epitope des Crf2-Proteins, wurde im capture-ELISA eine geringere Nachweisgrenze festgestellt und zudem eine intensivere Färbung der Hyphen in der Immunfluoreszenz. Die rekombinanten anti-Crf2 Antikörper zeigten ein ähnliches Färbemuster wie die anti-Crf2 Mausseren und wiesen keine Kreuzreaktionen mit anderen humanpathogenen Pilzen auf. Abschließend wurde die Affinität der isolierten Antikörper mittels Oberflächenplasmonresonanztechnologie bestimmt.Aspergillus fumigatus is an ubiquitous mould that causes a lethal invasive aspergillosis (IA) in
immunosuppressed and immunocompromised persons via the inhalation of its spores.
The cDNA of a new sequence homologue variant of the glycosylhydrolase crf1, called crf2, was
isolated from the mRNA of a clinical isolate. The recombinant Crf2-protein was found to be protective in an active immunisation with mice against IA. The immunogenic epitopes of the Crf2-protein and its sequence homologues glycosylhydrolases Crf1 and Asp f16 were determined using these mice sera. Contrary to dormant spores, with these sera were in the immunofluorescence microscopy exclusevely areas of active growing, on hyphaes of A. fumigatus, stained. The phage-display-technology was used to generate recombinant anti-Crf2 antibodies. The antibody selection was performed with the antibody gene library HAL 4/7 and the new generated immune antibody gene library MAYKI, derived from a macaque, in two different selection stratagies.
The choice of selection strategy had an enormous influence on the character of the bound epitopes. ScFvs against linear epitopes were only isolated on direct coated Crf2-protein and scFvs against conformational epitopes were isolated when the selection was performed with in vivo biotinylated protein in solution. The detection limit of soluble antigen in the Crf2-capture-ELISA was lower when using scFvs binding linear epitopes and additional showed these scFvs a more intensive staining of hyphae in the immunofluorescence. The recombinant anti-Crf2 antibodies had a similar staining pattern as the anti-Crf2 immune sera of Crf2-immunised mice and did not show any cross reaction with other humanpathogenic fungi. Finally, the affinity for some antibody fragments were determined via the surface plasmon resonance technolog
