Uusien geneettisten epilepsiaoireyhtymien tunnistaminen eksomisekvensoinnilla

Epilepsies are a heterogeneous group of central nervous system diseases characterised by recurrent epileptic seizures. They are one of the most common neurological diseases with a lifetime prevalence of ~4%. Epileptic seizures are also a common comorbidity of various neurobiological disorders where epilepsy is not the primary diagnosis. Most epilepsies have a genetic origin, either monogenic or polygenic, however, the causal genetic variants have remained unknown in a substantial proportion of individuals with epilepsies. Over the past decade, technological advances in DNA sequencing have allowed the characterisation of the genetic basis of human disorders rapidly and efficiently. One of the most widely used methods is whole-exome sequencing (WES) where genetic variants in the protein coding regions of the genome, the exome, are captured. Even though the exome constitutes only ~1.5% of the genome, the majority of disease-causing variants underlying severe, monogenic diseases are located in the protein coding regions. Here, we aimed to decipher the molecular genetic basis of severe epilepsy syndromes by utilising WES to identify disease-causing genetic variants in patients without a genetic diagnosis. We studied patients with progressive myoclonus epilepsy (PME, n=84) or severe infantile-onset epileptic syndromes (n=30), which are one of the most devastating forms of genetic syndromes with epilepsy and characterised by frequent, pharmacoresistant seizures and poor prognosis. Given that the patients had undergone genetic testing to varying extent prior to this study, we specifically aimed to establish novel genes and molecular biological mechanisms underlying these syndromes. We made substantial progress in understanding the genetic architecture and molecular basis of the studied syndromes. For PMEs, we established a new major genetic cause and also expanded the genotypic and phenotypic spectrum of previously established disease genes. For severe infantile-onset epileptic syndromes, we identified one new, definite causal gene and one that requires identification of additional patients to confirm the causal role. The three newly identified disease genes represent three different molecular functions that together give new insight on epileptogenic mechanisms. The new PME subtype is caused by a heterozygous missense variant c.959G>A (p.Arg320His) in KCNC1 that was identified in 11 unrelated patients (13%) in the PME exome sequencing cohort. We have subsequently identified six additional patients. The gene encodes a potassium ion channel KV3.1 that has an important role in generating action potentials in the central nervous system, with the mutation disrupting the ability to transport potassium ions across the cell membrane. This mutation occurs in most families de novo, that is, it is a newly arising mutation. Based on the estimated mutation rate, the recurrent KCNC1 mutation is a worldwide cause of PME with likely hundreds of affected individuals globally. In five families with altogether nine affected siblings, we identified compound heterozygous variants in UBA5 as the cause of an infantile-onset syndrome characterised initially by irritability, followed by epilepsy, dystonic movements, moderate to severe intellectual disability, microcephaly and stagnation of development. The gene encodes an activating enzyme for UFM1, which is a small ubiquitin-like protein that is conjugated to its target proteins. The function of the highly conserved UFM1 conjugation system is still largely unknown. Functional analysis of the UBA5 mutants suggest that the identified variants cause reduced enzymatic activity of UBA5. Symptoms of the UBA5 patients and our findings in the central nervous system specific knockout mice for Ufm1 together indicate that UFM1-cascade is essential for normal development and function of the central nervous system. Finally, we identified compound heterozygous variants in ADAM22 as the likely cause of the disease in a patient with an infantile-onset rapidly progressing encephalopathy with epilepsy and cortical atrophy. The gene encodes a postsynaptic protein that functions as a receptor for LGI1, and we show that the identified variants abolish the ability of ADAM22 to bind to LGI1. The LGI1-ADAM22 complex is an antiepileptogenic factor regulating synaptic transmission throughout life. Highlighting the important role of this complex, knockout of Adam22 and Lgi1 in mice causes lethal epilepsy. Autosomal dominant LGI1 variants also cause epilepsy in humans. Identification of a patient with loss-of-function variants in ADAM22 suggest that also this gene is linked to epilepsy in humans. This connection should be confirmed through identification of additional affected individuals with ADAM22 variants. Altogether, this thesis demonstrates the power of WES in identification of causal genetic variants even in phenotypically heterogeneous patient cohorts subjected to prior genetic screenings. The findings improve diagnostics of these syndromes, increase knowledge of the underlying molecular mechanisms and potentially aid in developing new therapeutic interventions. Finally, for these families, establishment of the genetic diagnosis ends years of uncertainty and frustration of not knowing the cause of the disease and prevents need for unnecessary diagnostic testing.Epilepsiat ovat heterogeeninen joukko keskushermostosairauksia, jotka ilmenevät toistuvina epileptisinä kohtauksina. Niiden elämänaikainen esiintyvyys on noin 4 % eli ne ovat yksiä yleisimmistä neurologisista sairauksista. Epileptisiä kohtauksia esiintyy myös osana muita keskushermoston sairauksia, joissa epilepsia ei ole päädiagnoosi. Useimmat epilepsiat ovat geneettisiä joko mono- tai polygeenisiä mutta tautia aiheuttavat geneettiset variantit jäävät tunnistamatta merkittävällä osalla epilepsiaa sairastavista. Viimeisen vuosikymmenen aikana teknologinen kehitys DNA-sekvensoinnissa on mahdollistanut ihmisen sairauksien geneettisen taustan selvittämisen nopeasti ja tehokkaasti. Yksi käytetyimmistä menetelmistä on eksomisekvensointi, jossa geneettiset variantit koko perimän proteiinia koodaavilla alueilla eli eksomissa pystytään tunnistamaan. Vaikka eksomi on vain noin 1,5 % koko perimästä, suurin osa vakavia monogeenisiä sairauksia aiheuttavista muutoksista sijaitsee proteiinia koodaavilla alueilla. Tässä väitöstutkimuksessa tavoitteenamme oli selvittää vakavien epileptisten oireyhtymien molekyyligeneettistä taustaa hyödyntämällä eksomisekvensointia tautia aiheuttavien varianttien tunnistamisessa potilailla, joilla ei ole geneettistä diagnoosia. Tutkimusaineistomme koostui potilaista, joilla on joko progressiivinen myoklonusepilepsia (PME, n=84) tai vakava imeväisikäisenä alkava epileptinen oireyhtymä (n=30). Nämä oireyhtymät kuuluvat vakavimpien epileptisten oireyhtymien joukkoon ja niihin liittyy toistuvia, lääkeresistenttejä kohtauksia ja niillä on huono ennuste. Koska aineiston potilaille oli tehty geneettisiä diagnostisia testejä ennen tutkimukseen osallistumista, ensisijaisena tavoitteenamme oli tunnistaa uusia tautigeenejä ja molekyylimekanismeja näiden oireyhtymien taustalla. Edistimme tutkimuksen avulla merkittävästi ymmärrystämme näiden oireyhtymien molekyyligeneettisestä taustasta. Tunnistimme uuden PME-alatyypin ja kaksi uutta autosomaalisesti peittyvästi periytyvää imeväisikäisten vakavaa enkefalopatiaa, joista toisen kohdalla vaaditaan vielä lisäpotilaiden tunnistamista varmistuaksemme havaitsemiemme varianttien patogeenisyydestä. Lisäksi laajensimme aiemmin tunnistettujen tautigeenien genotyyppi- ja fenotyyppikirjoa. Nämä kolme uutta tautigeeniä edustavat kolmea eri molekulaarista mekanismia, jotka yhdessä lisäävät tietoa epilepsioiden taustalla olevista tekijöistä. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä tunnistamamme uusi PME-alatyyppi aiheutuu heterotsygoottisesta missense-variantista c.959G>A (p.Arg320His) geenissä KCNC1. Tämä muutos on 11 potilaalla (13 %; eivät toisilleen sukua) PME-eksomisekvensointiaineistossa. Alkuperäisen löydöksen jälkeen olemme tunnistaneet kuusi lisäpotilasta. KCNC1 koodaa kaliumionikanavaa KV3.1, jolla on keskushermostossa tärkeä tehtävä aktiopotentiaalien muodostamisessa. Tunnistamamme mutaatio tässä geenissä vahingoittaa kanavan kykyä siirtää kaliumioneita solukalvon läpi. Mutaatio on niin kutsuttu de novo mutaatio eli se on uusi muutos, joka ei ole periytynyt vanhemmilta. Arvioimamme mutaatiotaajuuden perusteella tämä mutaatio KCNC1-geenissä aiheuttaa PME:n sadoilla potilailla maailmanlaajuisesti. Toisessa osatyössä tunnistimme viidessä perheessä yhteensä yhdeksällä potilaalla yhdistelmäheterotsygootit UBA5-geenin variantit, jotka aiheuttavat imeväisikäisenä ilmenevän oireyhtymän. Tämä oireyhtymä ilmenee aluksi ärtyvyytenä, ja muita myöhemmin esiintyviä oireita ovat epileptiset kohtaukset, dystoniset liikkeet, älyllinen kehitysvamma ja pienipäisyys. UBA5 on UFM1-proteiinia aktivoiva entsyymi. UFM1 on pieni ubikitiinin kaltainen proteiini, joka kiinnitetään sen kohdeproteiineihin entsyymien katalysoimien reaktioiden kautta. UFM1-kaskadin tehtävä soluissa on suurelta osin tuntematon. Funktionaaliset kokeemme viittaavat siihen, että tunnistamamme UBA5-variantit vähentävät UBA5:n entsymaattista aktiivisuutta. UBA5-potilaiden oireet ja löydökset tutkimallamme Ufm1-hiirimallilla osoittavat, että UFM1-kaskadi on välttämätön keskushermoston kehittymiselle ja toiminnalle. Kolmannessa osatyössä tunnistimme yhdistelmäheterotsygoottiset variantit ADAM22-geenissä todennäköisenä aiheuttajana potilaan imeväisikäisenä alkaneelle etenevälle enkefalopatialle, johon liittyy epileptisiä kohtauksia ja aivokuoren atrofiaa. ADAM22-proteiini toimii LGI1:n reseptorina ja osoitimme tutkimuksessa, että tunnistamamme variantit estävät ADAM22-proteiinin ja LGI1:n välisen interaktion. LGI1-ADAM22 kompleksi on antiepileptinen tekijä, joka säätelee synaptista transmissiota läpi elämän. Näiden proteiinien tärkeää tehtävää korostaa se, että Lgi1- ja Adam22-poistogeeniset hiiret kärsivät epileptisistä kohtauksista ja kuolevat 2-3 viikkoa syntymänsä jälkeen. Autosomaalisesti vallitsevasti periytyvät variantit LGI1-geenissä aiheuttavat epilepsiaa ihmisellä. Vakavasta epileptisestä oireyhtymästä kärsivällä potilaalla tunnistamamme proteiinin toiminnan estävät, peittyvästi periytyvät variantit ADAM22-geenissä viittaavat siihen, että myös ADAM22 kytkeytyy epilepsiaan ihmisellä. Tämän kytköksen vahvistaminen edellyttää lisäpotilaiden tunnistamista. Kokonaisuudessaan tämä väitöstutkimus osoittaa eksomisekvensoinnin tehokkuuden tautia aiheuttavien varianttien tunnistamisessa heterogeenisissä potilaskohorteissa, joille on tehty aiempia diagnostisia testejä. Löydöksemme edistävät näiden epileptisten oireyhtymien diagnostiikkaa, lisäävät tietoa niiden taustalla olevista molekyylimekanismeista ja mahdollisesti auttavat kehittämään uusia hoitokeinoja. Perheille diagnoosin saaminen merkitsee myös sairauden aiheuttajaan liittyneen epätietoisuuden ja turhautuneisuuden päättymistä ja tarpeettomien diagnostisten testien loppumista

Variants in ATP6V0A1 cause progressive myoclonus epilepsy and developmental and epileptic encephalopathy

Bott et al. here reports that de novo and biallelic variants in ATP6V0A1 gene affect the ability of the V-ATPase complex to translocate protons and acidify the endolysosomal compartment in neurons, causing a severe neurological phenotype ranging from developmental and epileptic encephalopathy to progressive myoclonus epilepsy. The vacuolar H+-ATPase is a large multi-subunit proton pump, composed of an integral membrane V0 domain, involved in proton translocation, and a peripheral V1 domain, catalysing ATP hydrolysis. This complex is widely distributed on the membrane of various subcellular organelles, such as endosomes and lysosomes, and plays a critical role in cellular processes ranging from autophagy to protein trafficking and endocytosis. Variants in ATP6V0A1, the brain-enriched isoform in the V0 domain, have been recently associated with developmental delay and epilepsy in four individuals. Here, we identified 17 individuals from 14 unrelated families with both with new and previously characterized variants in this gene, representing the largest cohort to date. Five affected subjects with biallelic variants in this gene presented with a phenotype of early-onset progressive myoclonus epilepsy with ataxia, while 12 individuals carried de novo missense variants and showed severe developmental and epileptic encephalopathy. The R740Q mutation, which alone accounts for almost 50% of the mutations identified among our cases, leads to failure of lysosomal hydrolysis by directly impairing acidification of the endolysosomal compartment, causing autophagic dysfunction and severe developmental defect in Caenorhabditis elegans. Altogether, our findings further expand the neurological phenotype associated with variants in this gene and provide a direct link with endolysosomal acidification in the pathophysiology of ATP6V0A1-related conditions.Peer reviewe

A patient with pontocerebellar hypoplasia type 6 : Novel RARS2 mutations, comparison to previously published patients and clinical distinction from PEHO syndrome

Pontocerebellar hypoplasia type 6 (PCH6) is a rare infantile-onset progressive encephalopathy caused by biallelic mutations in RARS2 that encodes the mitochondrial arginine-tRNA synthetase enzyme (mtArgRS). The clinical presentation overlaps that of PEHO syndrome (Progressive Encephalopathy with edema, Hypsarrhythmia and Optic atrophy). The proband presented with severe intellectual disability, epilepsy with varying seizure types, optic atrophy, axial hypotonia, acquired microcephaly, dysmorphic features and progressive cerebral and cerebellar atrophy and delayed myelination on MRI. The presentation had resemblance to PEHO syndrome but sequencing of ZNHIT3 did not identify pathogenic variants. Subsequent whole genome sequencing revealed novel compound heterozygous variants in RARS2, a missense variant affecting a highly conserved amino acid and a frameshift variant with consequent degradation of the transcript resulting in decreased mtArgRS protein level confirming the diagnosis of PCH6. Features distinguishing the proband's phenotype from PEHO syndrome were later appearance of hypotonia and elevated lactate levels in blood and cerebrospinal fluid. On MRI the proband presented with more severe supratentorial atrophy and lesser degree of abnormal myelination than PEHO syndrome patients. The study highlights the challenges in clinical diagnosis of patients with neonatal and early infantile encephalopathies with overlapping clinical features and brain MRI findings.Peer reviewe

Kovakuoriaisten maakuntaluettelo 2015

201

GRINL1A Complex Transcription Unit Containing GCOM1, MYZAP, and POLR2M Genes Associates with Fully Penetrant Recessive Dilated Cardiomyopathy

Background: Familial dilated cardiomyopathy (DCM) is a monogenic disorder typically inherited in an autosomal dominant pattern. We have identified two Finnish families with familial cardiomyopathy that is not explained by a variant in any previously known cardiomyopathy gene. We describe the cardiac phenotype related to homozygous truncating GCOM1 variants.Methods and Results: This study included two probands and their relatives. All the participants are of Finnish ethnicity. Whole-exome sequencing was used to test the probands; bi-directional Sanger sequencing was used to identify the GCOM1 variants in probands' family members. Clinical evaluation was performed, medical records and death certificates were obtained. Immunohistochemical analysis of myocardial samples was conducted. A homozygous GCOM1 variant was identified altogether in six individuals, all considered to be affected. None of the nine heterozygous family members fulfilled any cardiomyopathy criteria. Heart failure was the leading clinical feature, and the patients may have had a tendency for atrial arrhythmias.Conclusions: This study demonstrates the significance of GCOM1 variants as a cause of human cardiomyopathy and highlights the importance of searching for new candidate genes when targeted gene panels do not yield a positive outcome.Peer reviewe

Progressive Myoclonus Epilepsy Caused by a Homozygous Splicing Variant of SLC7A6OS

Exome sequencing was performed in 2 unrelated families with progressive myoclonus epilepsy. Affected individuals from both families shared a rare, homozygous c.191A > G variant affecting a splice site in SLC7A6OS. Analysis of cDNA from lymphoblastoid cells demonstrated partial splice site abolition and the creation of an abnormal isoform. Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blot showed a marked reduction of protein expression. Haplotype analysis identified a similar to 0.85cM shared genomic region on chromosome 16q encompassing the c.191A > G variant, consistent with a distant ancestor common to both families. Our results suggest that biallelic loss-of-function variants in SLC7A6OS are a novel genetic cause of progressive myoclonus epilepsy. ANN NEUROL 2020Peer reviewe

Työkoneiden kustannustehokkaat päästövähennyskeinot

Liikkuvien työkoneiden energiankulutusta ja päästöjä halutaan alentaa. Työkoneita käytetään monimuotoisissa ympäristöissä ja käyttökohteissa. Niiden osuus Suomen hiilidioksidipäästöistä on noin neljä prosenttia ja vallitseva käyttövoima on polttoöljy. Uudet käyttövoimat ovat jo osittain yhteensopivia nykypäivän työkoneisiin, mutta osa edellyttää kaluston uusimista sekä uuden infrastruktuurin rakentamista. Jakeluvelvoite ja sen korottaminen on tehokas keino työkoneiden CO2-päästöjen vähentämiseksi lyhyellä aikavälillä, mutta samalla sekoitepolttoöljyn hinta nousee ja syntyy epävarmuutta hintakehityksestä. Biokaasun sisällyttämisestä jakeluvelvoitteeseen ei nähty työkonesektorilla olevan hyötyä. Työkoneiden CO2-regulaatio puuttuu tällä hetkellä kokonaan, mikä ei suosi vaihtoehtoisten käyttövoimien kehitystä. Ohjaavan säännöstön kehittämiseen kannattaa panostaa EU-tasolla. Vaihtoehtoisten käyttövoimien ratkaisuilla on potentiaalia kehittyä kilpailukykyisiksi tuotteiksi vuosikymmenen aikana. Tämä edellyttää kokonaisvaltaisen ohjauskeinovalikoiman käyttöönottoa: tuotekehitys ja sen rahoitus, kokeiluhankkeet, hankinta- ja infratuet vaihtoehtoisille käyttövoimille, kokonaisverotuksen kehittäminen, tiedon kerääminen ja jakaminen. Työkoneiden tiedonkeruussa ja tilastoinnissa tunnistettiin selkeitä puutteita, joiden poistaminen edesauttaa konekannan uudistumista ja päästöjen alentamista.Tämä julkaisu on toteutettu osana valtioneuvoston selvitys- ja tutkimussuunnitelman toimeenpanoa.(tietokayttoon.fi) Julkaisun sisällöstä vastaavat tiedon tuottajat, eikä tekstisisältö välttämättä edusta valtioneuvoston näkemystä

An arylthiazyne derivative is a potent inhibitor of lipid peroxidation and ferroptosis providing neuroprotection in vitro and in vivo

Lipid peroxidation-initiated ferroptosis is an iron-dependent mechanism of programmed cell death taking place in neurological diseases. Here we show that a condensed benzo[b]thiazine derivative small molecule with an arylthiazine backbone (ADA-409-052) inhibits tert-Butyl hydroperoxide (TBHP)-induced lipid peroxidation (LP) and protects against ferroptotic cell death triggered by glutathione (GSH) depletion or glutathione peroxidase 4 (GPx4) inhibition in neuronal cell lines. In addition, ADA-409-052 suppresses pro-inflammatory activation of BV2 microglia and protects N2a neuronal cells from cell death induced by pro-inflammatory RAW 264.7 macrophages. Moreover, ADA-409-052 efficiently reduces infarct volume, edema and expression of pro-inflammatory genes in a mouse model of thromboembolic stroke. Targeting ferroptosis may be a promising therapeutic strategy in neurological diseases involving severe neuronal death and neuroinflammation.Peer reviewe