Estudo de hidrolases glicosídicas bacterianas para aplicações biotecnológicas : bioprospecção, produção e imobilização

Orientadores: Hélia Harumi Sato, Roberto RullerTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A biomassa lignocelulósica é um importante recurso renovável que está prontamente disponível, sendo uma fonte de matéria-prima com alto potencial biotecnológico. Os polissacarídeos complexos que compõem lignocelulose podem ser convertidos em monossacarídeos fermentescíveis, com grande aplicabilidade em diversos bioprocessos industriais. A degradação dos materiais lignocelulósicos pode ser realizada por uma diversidade de vias enzimáticas complexas, onde é requerido um número considerável de enzimas ativas sobre carboidratos. Entre elas, as famílias das celulases e hemicelulases, além de atuarem na hidrólise dos materiais lignocelulósicos, possuem um uso versátil em setores industriais, tais como, nas áreas alimentícia, bebidas e de biocombustíveis. A tese teve como principais objetivos o delineamento de estratégias para a produção de enzimas e coquetéis enzimáticos eficientes para o uso na hidrólise da biomassa vegetal e, a aplicação de técnicas de imobilização para ampliar a utilização de enzimas em escala comercial. Inicialmente, a bioprospecção de novos micro-organismos secretores de enzimas atuantes na biomassa lignocelulósica foi realizada, e dentre as oitenta linhagens de Streptomyces testadas, duas linhagens (F1 e F7) se destacaram por apresentarem elevadas atividades celulolíticas e hemicelulolíticas. Uma abordagem genômica dessas linhagens possibilitou a identificação de 85 hidrolases glicosídicas (GHs) distribuídas em 33 famílias diferentes na linhagem F1, e 100 GHs dispostas em 44 famílias na linhagem F7. Além disso, os dados genômicos das linhagens F1 e F7 também indicaram a presença de genes relacionados à degradação da lignina. Ferramentas estatísticas também foram aplicadas e possibilitaram a ampliação da produção de GHs pela linhagem F1. Com a otimização, elevadas concentrações de GHs foram alcançadas com meio nutriente adicionado de 16,4 g L-1 de farelo de trigo e 10,0 g L-1 de caseína, onde se obteve 9,27 U mL -1 de xilanase e 0,22 U mL -1 de celulase. Para confirmar a diversidade de GHs expressas pela linhagem F1, uma análise por espectrometria de massa foi realizada e observou-se que quanto maior a complexidade da fonte de carbono utilizada, maior foi a gama de proteínas expressas, incluindo vários tipos de celulases e hemicelulases. A eficiência do extrato enzimático produzido pela linhagem F1 foi estudada para a sacarificação da biomassa vegetal e possibilitou um aumento significativo na liberação de açúcares quando adicionado ao extrato celulolítico comercial, indicando que as enzimas secretadas pela Streptomyces sp. F1 podem ser aplicadas para o melhoramento dos atuais coquetéis comerciais. Foi estudada também a criação de métodos de imobilização de enzimas em condições neutras de pH. Os novos suportes produzidos com a agarose foram utilizados para a imobilização de enzimas monoméricas e multiméricas de grande importância biotecnológica. Um estudo mais detalhado explorando os novos suportes e o uso de técnicas de pós-imobilização foi também proposto. O processo desenvolvido aplicando o polímero polietilenimina (PEI) possibilitou a formação de um excelente sistema para imobilizar e estabilizar a ?-glicosidase obtida de Exiguobacterium antarcticum. A ?-glicosidase imobilizada apresentou uma melhora em suas características, incluindo estabilidade térmica e de armazenamento. Além disso, a ?-glicosidase manteve sua atividade elevada mesmo após vários ciclos de hidrólise com celobiose como substratoAbstract: Lignocellulosic biomass is an important renewable resource that is readily available, being a source of raw material with high biotechnological potential. The complex polysaccharides that compose lignocellulose can be converted into fermentable monosaccharides, with great applicability in several industrial bioprocesses. The degradation of lignocellulosic materials can be accomplished by a variety of complex enzymatic pathways, where a considerable number of carbohydrate active enzymes are required. Among them, the families of cellulases and hemicellulases, besides acting in the hydrolysis of lignocellulosic materials, have a versatile use in industrial sectors, such as in food, beverages and biofuels. The main aims of this thesis were the design of efficient strategies for the production of enzymes and enzymatic cocktails for use in plant biomass hydrolysis and the application of immobilization techniques to increase the use of enzymes in a commercial scale. Initially, bioprospection of new enzyme secreting microorganisms active in lignocellulosic biomass was performed, and among the eighty Streptomyces strains tested, two strains (F1 and F7) were distinguished by their high cellulolytic and hemicellulolytic activities. A genomic approach of these strains allowed the identification of 85 glycoside hydrolases (GHs) distributed in 33 different families the strain F1, and 100 GHs arranged in 44 families the strain F7. In addition, the genomic data from strains F1 and F7 also indicated the presence of genes related to lignin degradation. Statistical tools were also applied and allowed the increase in GH production by strain F1. With the optimization, high concentrations of GHs were achieved with a nutrient medium containing 16.4 g L-1 of wheat bran and 10.0 g L-1 of casein, where 9.27 U mL-1 of xylanase and 0.22 U mL-1 of cellulase were obtained. To confirm the diversity of GHs expressed by the strain F1, an analysis using mass spectrometry technique was performed and it was observed that the greater the complexity of the carbon source used, the greater the range of proteins secreted, including several types of cellulases and hemicellulases. The efficiency of the enzymatic extract produced with strain F1 was studied for the saccharification of plant biomass and allowed a significant increase in sugar release when added to the commercial cellulolytic extract, indicating that the enzymes expressed by Streptomyces sp. F1 can be applied for the improvement of the current commercial cocktails. The creation of enzyme immobilization methods under neutral conditions of pH was also study. The new agarose supports were used for the immobilization of monomeric and multimeric enzymes of great industrial and biotechnological importance. A more detailed study exploring the new supports and the use of post-immobilization techniques with polymers and small molecules was also proposed. The process developed by applying the polymer polyethyleneimine (PEI) enabled the formation of an excellent system to stabilize the glucose-tolerant tetrameric ?-glycosidase obtained from Exiguobacterium antarcticum. The immobilized ?-glycosidase showed an improvement in its characteristics, with an increased activity, including thermal and storage stability. In addition, the ?-glycosidase maintained a high activity even after several cycles of hydrolysis applying cellobiose as substrateDoutoradoCiência de AlimentosDoutor em Ciência de Alimentos140610/2014-6CNP

Production and biochemical characterization of a new microbial transglutaminase

Orientador: Hélia Harumi SatoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Transglutaminase é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações cruzadas intra- e intermoleculares entre proteínas, peptídeos e aminas primárias por meio de ligações covalentes entre resíduos de lisina e glutamina. Desta forma, transglutaminase pode ser utilizada em diversos setores industriais para o desenvolvimento de novos produtos ou para a modificação de suas características. A linhagem B6 isolada de amostra de solo coletada na região do Estado de Minas Gerais foi identificada como tendo características morfológicas típicas de actinomicetos e pela análise da região 16S rRNA há colocou na subclasse Streptomyces próximo a linhagem Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. A fim de aumentar a produção de transglutaminase (2,75 U/mL) pela linhagem Streptomyces sp. B6, o meio de fermentação foi submetido a processos de otimização. Como primeiro passo da otimização, o crescimento do micro-organismo e a produção da enzima foram estudados através de uma pré-seleção de fontes de carbono, nitrogênio e sais no meio de produção. Após as análises das diferentes fontes, um delineamento experimental do tipo Plackett-Burman foi utilizado para a seleção dos componentes do meio de cultivo que afetam a produção de transglutaminase. Os resultados do delineamento experimental indicaram que a produção de transglutaminase foi influenciada negativamente pela peptona bacteriológica e MgSO4.7H2O, positivamente pelo amido de batata, glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O e não foi influenciada pelo farelo de soja, considerando um nível de confiança de 95%. A concentração de amido de batata foi fixada no maior nível testado no planejamento Plackett-Burman devido à gelificação do meio de fermentação em concentrações maiores. Assim, os três fatores que influenciaram a produção de transglutaminase (glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O) foram otimizados para obter o máximo de produção da enzima utilizando delineamento composto central. Sob a condição otimizada, a qual continha 25 g/L de farinha de soja, 35 g/L de amido de batata, 5 g/L de glicose, 24,5 g/L de peptona de caseína e 8 g/L de KH2PO4.7H2O, a atividade enzimática atingiu 6,13 U/mL, apresentando 125% à mais de atividade em relação á obtida no meio antes da otimização. A transglutaminase microbiana produzida pela linhagem Streptomyces sp. B6 exibiu atividade ótima em 45°C e em pH de 6,5 e 11,0. A enzima manteve-se estável na faixa de pH 3,0-11,0 durante 60 minutos à 40°C durante 3 horas. A transglutaminase não foi inibida por Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cisteína e glutationa na concentração de 5 mM, mas foi inibida na presença de Hg2+, Cu2+, Zn2+ e Fe2+ na concentração de 5mM. A linhagem Streptomyces sp. B6 é uma nova fonte de transglutaminase com características interessantes para aplicações biotecnológicasAbstract: Transglutaminase is an enzyme capable of catalyzing the forming intra-and intermolecular cross-linking between proteins, peptides and primary amines by covalent bonds between lysine and glutamine residues. Thus, transglutaminase can be used in food processing industries to develop new products and modify their characteristics. The B6 strain was isolated from soil sample collected in the region state of Minas Gerais was identified as having morphological characteristics typical of the actinomycetes, and the 16S rRNA analysis placed it in the Streptomyces subclade, closely related to Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. In order to increase the transglutaminase production (2.75 U/mL) from Streptomyces sp. B6 strain, the fermentation medium was subjected to optimization processes. In the first step of optimization, the micro-organism growth and enzyme production were studied through a pre-selection of carbon, nitrogen and salts sources in the culture medium. After analysis of different sources, the Plackett¿Burman experimental design was used for screening the components of the culture medium that affect the transglutaminase production. Results of the experiment indicated that production of transglutaminase was negatively influenced by bacteriological peptone and MgSO4.7H2O, positively influenced by potato starch, glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O and was not influenced by soybean meal, considering 95% of confidence level. The potato starch concentration was fixed at the highest level tested in Plackett¿Burman design due to gelation of the fermentation medium in higher concentrations. Thus, the three factors that influence the transglutaminase production (glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O concentrations) were optimized to obtain the maximum transglutaminase production using central composite design. Under the proposed optimized condition, which contained 25 g/L soybean meal, 35 g/L potato starch, 5 g/L glucose, 24.5 g/L casein peptone and 8 g/L KH2PO4.7H2O, the enzyme activity reached 6.13 U/mL, which was 125% more than the activity in relative obtained medium before optimization. The microbial transglutaminase produced by Streptomyces sp. B6 strain exhibited optimal activity at 45 oC and at pH 6.5 and 11.0. The enzyme remained stable in the pH range from 3.0 - 11.0 for 60 minutes and at 40 oC temperature for 3 hours. The transglutaminase was not inhibited by Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cysteine and glutathione in concentration 5 mM, but was inhibited in the presence of Hg2+, Cu2+, Zn2+ and Fe2+ in concentration 5 mM. In conclusion, Streptomyces sp. B6 strain is a new source of transglutaminase with interesting features for biotechnological applicationsMestradoCiência de AlimentosMestre em Ciência de Alimento

Health promotion, participation in collective actions and situation of violence among users of Primary Health Care.

Este artigo visa a analisar a rela??o entre a promo??o de sa?de, mensurada por meio da participa??o em a??es coletivas, e a viol?ncia entre usu?rios das unidades de sa?de da aten??o prim?ria, no munic?pio de Ribeir?o das Neves (MG). Trata-se de estudo de abordagem quantitativa, cuja metodologia consiste de entrevistas semiestruturadas com usu?rios da aten??o prim?ria do munic?pio de Ribeir?o das Neves (MG). A an?lise estat?stica foi baseada em tabelas de frequ?ncias absolutas e percentuais para as distribui??es uni e bivariada, destacando-se o perfil sociodemogr?fico. As associa??es e suas signific?ncias estat?sticas foram avaliadas por meio do teste Qui-quadrado e da an?lise de correspond?ncia. Foram entrevistados 628 usu?rios de 58 Unidades B?sicas de Sa?de; as viol?ncias mais frequentes foram: verbal, psicol?gica e tentativa de suic?dio. A participa??o em a??es coletivas est? predominantemente ligada a cultos religiosos. O desenvolvimento de a??es de preven??o ? viol?ncia na aten??o primaria ? baixo. Na an?lise de correspond?ncia, a baixa frequ?ncia de a??es coletivas se associou fortemente ? presen?a de viol?ncia e ? tentativa de suic?dio. A presen?a de a??es ligadas a atividades esportivas/ art?sticas se associa ? aus?ncia de viol?ncia verbal e sexual; a participa??o em associa??es/ sindicatos se associa ? aus?ncia de viol?ncia psicol?gica, f?sica e tentativa de suic?dio; por fim, a??es de trabalho volunt?rio se associam ? aus?ncia de viol?ncia sexual, ter parente assassinado e conhecer algu?m que foi assassinado. Concluiu-se que a participa??o e a n?o participa??o em a??es coletivas se associam, respectivamente, com menor e maior preval?ncia de viol?ncia.This article aims to analyze the relationship between health promotion, measured by means of participation in collective actions, and violence among users of primary health units, in the municipality of Ribeir?o das Neves (MG). This is a quantitative approach study, whose methodology consists of semi-structured interviews with users of primary care of the municipality of Ribeir?o das Neves (MG). The statistical analysis was based on absolute and frequency tables for univariate and bivariate distributions, highlighting the sociodemographic profile. The associations and their statistical significance were evaluated through Chi-square test and correspondence analysis. A total of 628 users from 58 Basic Health Units were interviewed; the most frequent violences were:verbal, psychological and attempted suicide. Participation in collective actions is predominantly linked to religious services. The development of actions to prevent violence in primary care is low. In the correspondence analysis, the low frequency of collective action was strongly associated to the presence of violence and suicide attempt. The presence of actions related to sports/art activities is associated with the absence of verbal and sexual violence; participation in associations/unions is associated with absence of psychological, physical and attempted suicide; finally, voluntary work actions are associated with lack of sexual violence, having a relative murdered and knowing someone who was murdered. It was concluded that participation and non-participation in collective actions are associated, respectively, with lower and higher prevalence of violence

Teledermatology: diagnostic correlation in a primary care service

FUNDAMENTOS: O termo telemedicina faz referência ao uso de tecnologias de comunicação para a transmissão a distância de informações relacionadas à saúde. Esse recurso é utilizado em várias especialidades médicas, principalmente naquelas em que a interpretação de imagens representa uma etapa fundamental na formulação diagnóstica. OBJETIVO: Avaliar a concordância entre o diagnóstico presencial e o diagnóstico a distância de lesões cutâneas, utilizando a teledermatologia, em pacientes atendidos em uma unidade básica de saúde. MÉTODOS: Foi realizado um estudo prospectivo envolvendo pacientes atendidos no serviço de dermatologia da clínica FTC em Salvador - BA. Participaram do estudo um dermatologista responsável pela consulta presencial e dois dermatologistas responsáveis pela consulta a distância. Os diagnósticos obtidos através da teleconsulta foram avaliados quanto à concordância e comparados com os diagnósticos da consulta presencial. RESULTADOS: Foram incluídos neste estudo 60 pacientes. Observou-se um grau de concordância total variando de 86,6% a 91,6% com índice Kappa de 0,62. CONCLUSÃO: A teledermatologia é uma forma de assistência com um grande potencial de uso na dermatologia, podendo representar uma ferramenta útil principalmente em casos clínicos de baixa complexidade, oriundos de unidades básicas de saúde.BACKGROUND: Telemedicine can be defined as the use of telecommunication technologies for the transmission of health data. It has been described in different medical specialties, especially those in which interpretation of images represents a fundamental key in formulating diagnosis. OBJECTIVE: To evaluate the role of teledermatology in primary care system. METHODS: A prospective analysis included 60 patients seen in a primary care unit. All patients were seen by a dermatologist as regular outpatient dermatology consultation. A medical student obtained digital images and a brief clinical history of all patients. Using a Telemedicine system these data were reviewed by two dermatologists for distance diagnosis. Agreement between the diagnoses was assessed. RESULTS: Good agreement, ranging from 86.6% to 91.6%, was achieved between direct observation and teleconsultation. Good agreement was also achieved between two telemedicine diagnosis (Kappa = 0.62). CONCLUSION: Teledermatology is a form of care with great potential for use in dermatology, and could represent a useful tool in cases of low complexity from primary health units

First record of the Pyrrhura lucianii Deville, 1851 (Psittaciformes, Psittacidae) in Acre, Brazil, with notes on the consumption of salt

The Brazilian endemic species Pyrrhura lucianii Deville, 1851, was found on private property in the municipality of Senador Guiomard in Acre State, Brazil. This is the first record of this parakeet species in the state, expanding its distribution in 219 km to the south of Pauini, the nearest location. The species was observed consuming salt, used as a cattle feed supplement

Hereditary gingival fibromatosis: clinical and ultrastructural features of a new family

Objective: This article describes the diagnosis, clinical and microscopic (histopathology and ultrastructural) features and treatment of a new family with hereditary gingival fibromatosis (HGF) and highlights the importance of this genetic condition. Study Design: To characterize the pattern of inheritance and the clinical features, members of a new family with HGF were examined. The pedigree was reliably constructed including the four latest generations of family. Hematoxylin and eosin staining and ultrastructural analysis were performed with the gingival tissue. Results: Examination of the family pedigree revealed that the patient III-2 represent the index patient of this family (initial patient with a mutation), which was transmitted to her daughter through an autosomal dominant mode of inheritance. The affected patients showed a generalized gingival overgrowth. The patient was treated with surgical procedures of gingivectomy and gingivoplasty. The diagnosis was confirmed by histopathology examination that showed a well-structured epithelium with elongated and thin papillae inserted in fibrous connective tissue with increased amount of collagen. The ultrastructural aspects of the tissue show collagen fibrils exhibiting their typically repeating banding pattern with some fibrils displaying loops at their end. Moreover, it was possible to seen in some regions fibrillar component presenting tortuous aspects and loss of the alignment among them. Conclusions: This HGF frequently resulted in both esthetic and functional problems. The genetic pattern of this Brazilian family suggested a new mutation, which was later transmitted by an autosomal dominant trait

DEFICIÊNCIA DE GH POR TERATOGENICIDADE: UM RELATO DE CASO

O uso de antiepiléticos durante a gestação está estreitamente associado a um conjunto de malformações em recém-nascidos, levando a um quadro clínico que pode confundir com diversas síndromes genéticas. O presente artigo relata o caso de uma criança do sexo masculino que nasceu com anomalias congênitas e cuja mãe utilizou fenobarbital durante toda a gestação. Dentre suas queixas estava o retardo do crescimento por deficiência de hormônio do crescimento, exigindo conduta terapêutica e acompanhamento, que foi realizado até os 4 anos e 7 meses com resultados satisfatórios. O paciente revela um conjunto de alterações congênitas que se aproximam de sua linha média, muitas delas semelhantes às encontradas em algumas síndromes conhecidas. Ressalta-se aqui a dificuldade em conduzir este diagnóstico de exclusão pelos diversos diagnósticos diferenciais, possibilitando melhor aconselhamento genético para o paciente e seus familiares

Preservation of bovine preantral follicle viability and ultra-structure after cooling and freezing of ovarian tissue

Bovine preantral follicles within ovarian fragments were exposed and cryopreserved in absence or presence of 1.5 M glycerol (GLY), ethylene glycol (EG), propanediol (PROH) or dimethyl sulfoxide (DMSO), undergoing a previous cooling at 20 °C for 1 h (protocol 1) or at 4 °C for 24 h (protocol 2) in 0.9% saline solution. At the end of each treatment, preantral follicles were classified as non-viable/viable when they were stained/not stained with trypan blue, respectively. To confirm viability staining, ultra-structure of the follicles was evaluated by transmission electronic microscopy (TEM). Data were compared by Chi-square test (P < 0.05). The storage of the ovaries at 20 °C for 1 h (78%) and 4 °C for 24 h (80%) did not reduce significantly the percentage of viable preantral follicles when compared to the control (75%). Similar results were obtained when ovarian fragments, respectively, for protocols 1 and 2, were exposed to MEM (78 and 77%), 1.5 M EG (78 and 71%), as well as frozen in 1.5 M EG (74 and 77%). Percentages of viable follicles in control were similar to those observed after exposure (75%) and freezing (76%) in presence of 1.5 M DMSO only when protocol 1 was used. The increase of the concentration from 1.5 to 3.0 M, for all cryoprotectants, reduced significantly the percentage of viable preantral follicles after freezing. Ultra-structural analysis has confirmed trypan blue results, showing that not only basement membrane, but also organelles, were intact in viable preantral follicles. In conclusion, ovarian tissue cooling at 4 °C for 24 h before cryopreservation (protocol 2) does not affect the viability of bovine preantral follicles when 1.5 M EG is present in the cryopreservation medium