Note: Tormenta: An open source Python-powered control software for camera based optical microscopy

Until recently, PC control and synchronization of scientific instruments was only possible through closed-source expensive frameworks like National Instruments' LabVIEW. Nowadays, efficient cost-free alternatives are available in the context of a continuously growing community of open-source software developers. Here, we report on Tormenta, a modular open-source software for the control of camera-based optical microscopes. Tormenta is built on Python, works on multiple operating systems, and includes some key features for fluorescence nanoscopy based on single molecule localization.Fil: Barabas, Federico Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias ; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias ; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Stefani, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias ; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentin

Multiphoton single-molecule localization by sequential excitation with light minima

Using sequential excitation with a minimum of light to localize single fluorescent molecules represented a breakthrough because it delivers 1–2 nm precision with moderate photon counts, enabling tracking and super-resolution imaging with true molecular resolution. Expanding this concept to multi-photon regimes may be a useful complement to reach even higher localization precision and get deeper into biological specimens.Fil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Stefani, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentin

A common framework for single-molecule localization using sequential structured illumination

Localization of single fluorescent molecules is key for physicochemical and biophysical measurements, such as single-molecule tracking and super-resolution imaging by single-molecule localization microscopy. Over the last two decades, several methods have been developed in which the position of a single emitter is interrogated with a sequence of spatially modulated patterns of light. Among them, the recent MINFLUX technique outstands for achieving a ∼10-fold improvement compared with wide-field camera-based single-molecule localization, reaching ∼1–2 nm localization precision at moderate photon counts. Here, we present a common framework for this type of measurement. Using the Cramér-Rao bound as a limit for the achievable localization precision, we benchmark reported methods, including recent developments, such as MINFLUX and MINSTED, and long-established methods, such as orbital tracking. In addition, we characterize two new proposed schemes, orbital tracking and raster scanning, with a minimum of intensity. Overall, we found that approaches using an intensity minimum have a similar performance in the central region of the excitation pattern, independent of the geometry of the excitation pattern, and that they outperform methods featuring an intensity maximum.Fil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Lopez, Lucía Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Stefani, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentin

An alternative to MINFLUX that enables nanometer resolution in a confocal microscope

Localization of single fluorescent emitters is key for physicochemical and biophysical measurements at the nanoscale and beyond ensemble averaging. Examples include single-molecule tracking and super-resolution imaging by single-molecule localization microscopy. Among the numerous localization methods available, MINFLUX outstands for achieving a ~10-fold improvement in resolution over wide-field camera-based approaches, reaching the molecular scale at moderate photon counts. Widespread application of MINFLUX and related methods has been hindered by the technical complexity of the setups. Here, we present RASTMIN, a single-molecule localization method based on raster scanning a light pattern comprising a minimum of intensity. RASTMIN delivers ~1–2 nm localization precision with usual fluorophores and is easily implementable on a standard confocal microscope with few modifications. We demonstrate the performance of RASTMIN in localization of single molecules and super-resolution imaging of DNA origami structures.Fil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Szalai, Alan Marcelo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Lopez, Lucía Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Pilo Pais, Mauricio. Universite de Fribourg;Fil: Acuna, Guillermo P.. Universite de Fribourg;Fil: Stefani, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentin

Pulsed Interleaved MINFLUX

We introduce p-MINFLUX, a new implementation of the highly photon-efficient single-molecule localization method with a simplified experimental setup and additional fluorescence lifetime information. In contrast to the original MINFLUX implementation, p-MINFLUX uses interleaved laser pulses to deliver the doughnut-shaped excitation foci at a maximum repetition rate. Using both static and dynamic DNA origami model systems, we demonstrate the performance of p-MINFLUX for single-molecule localization nanoscopy and tracking, respectively. p-MINFLUX delivers 1-2 nm localization precision with 2000-1000 photon counts. In addition, p-MINFLUX gives access to the fluorescence lifetime enabling multiplexing and super-resolved lifetime imaging. p-MINFLUX should help to unlock the full potential of innovative single-molecule localization schemes.Fil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Steiner, Florian. Ludwig Maximilians Universitat; AlemaniaFil: Zähringer, Jonas. Ludwig Maximilians Universitat; AlemaniaFil: Lopez, Lucía Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Bohlen, Johann. Ludwig Maximilians Universitat; AlemaniaFil: Richter, Lars. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Cole, Fiona. Ludwig Maximilians Universitat; AlemaniaFil: Tinnefeld, Philip. Ludwig Maximilians Universitat; AlemaniaFil: Stefani, Fernando Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentin

Remodeling of the Actin/Spectrin Membrane-associated Periodic Skeleton, Growth Cone Collapse and F-Actin Decrease during Axonal Degeneration

Axonal degeneration occurs in the developing nervous system for the appropriate establishment of mature circuits, and is also a hallmark of diverse neurodegenerative diseases. Despite recent interest in the field, little is known about the changes (and possible role) of the cytoskeleton during axonal degeneration. We studied the actin cytoskeleton in an in vitro model of developmental pruning induced by trophic factor withdrawal (TFW). We found that F-actin decrease and growth cone collapse (GCC) occur early after TFW; however, treatments that prevent axonal fragmentation failed to prevent GCC, suggesting independent pathways. Using super-resolution (STED) microscopy we found that the axonal actin/spectrin membrane-associated periodic skeleton (MPS) abundance and organization drop shortly after deprivation, remaining low until fragmentation. Fragmented axons lack MPS (while maintaining microtubules) and acute pharmacological treatments that stabilize actin filaments prevent MPS loss and protect from axonal fragmentation, suggesting that MPS destruction is required for axon fragmentation to proceed.Fil: Unsain, Nicolas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Bordenave, Martín Diego. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Martinez, Gaby F.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Jalil, Sami. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Von Bilderling, Catalina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Barabas, Federico Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Johnstone, Aaron D.. McGill University; CanadáFil: Barker, Philip A.. University of British Columbia; CanadáFil: Bisbal, Mariano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Stefani, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Caceres, Alfredo Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Instituto Universitario de Ciencias Biomédicas de Córdoba; Argentin

Fibronectin rescues estrogen receptor α from lysosomal degradation in breast cancer cells

Estrogen receptor α (ERα) is expressed in tissues as diverse as brains and mammary glands. In breast cancer, ERα is a key regulator of tumor progression. Therefore, understanding what activates ERα is critical for cancer treatment in particular and cell biology in general. Using biochemical approaches and superresolution microscopy, we show that estrogen drives membrane ERα into endosomes in breast cancer cells and that its fate is determined by the presence of fibronectin (FN) in the extracellular matrix; it is trafficked to lysosomes in the absence of FN and avoids the lysosomal compartment in its presence. In this context, FN prolongs ERα half-life and strengthens its transcriptional activity. We show that ERα is associated with β1-integrin at the membrane, and this integrin follows the same endocytosis and subcellular trafficking pathway triggered by estrogen. Moreover, ERα+ vesicles are present within human breast tissues, and colocalization with β1-integrin is detected primarily in tumors. Our work unravels a key, clinically relevant mechanism of microenvironmental regulation of ERα signaling.Fil: Sampayo, Rocío Guadalupe. Universidad Nacional de San Martin. Instituto de Nanosistemas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Toscani, Andrés Martin. Universidad Nacional de Luján; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Rubashkin, Matthew G.. University of California; Estados UnidosFil: Thi, Kate. Lawrence Berkeley National Laboratory; Estados UnidosFil: Masullo, Luciano Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Violi, Ianina Lucila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; ArgentinaFil: Lakins, Jonathon N.. University of California; Estados UnidosFil: Caceres, Alfredo Oscar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; ArgentinaFil: Hines, William C.. Lawrence Berkeley National Laboratory; Estados UnidosFil: Coluccio Leskow, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad Nacional de Luján; ArgentinaFil: Stefani, Fernando Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Chialvo, Dante Renato. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología. Centro Internacional de Estudios Avanzados; ArgentinaFil: Bissell, Mina J.. Lawrence Berkeley National Laboratory; Estados UnidosFil: Weaver, Valerie M.. University of California; Estados UnidosFil: Simian, Marina. Universidad Nacional de San Martin. Instituto de Nanosistemas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Oncología "Ángel H. Roffo"; Argentin

Photon-efficient fluorescence nanoscopy by scanning light intensity minima

La microscopía de superresolución, o más exactamente las técnicas de nanoscopía de fluorescencia, han revolucionado la obtención de imágenes basadas en la fluorescencia alcanzando resoluciones en el rango nanométrico, mucho más allá del límite de difracción de la luz. El concepto clave es la conmutación de los fluoróforos entre un estado fluorescente y otro no fluorescente. Esta "conmutación on-off" permite la localización secuencial de un subconjunto de fluoróforos en la muestra con una precisión que supera el límite de difracción. La primera generación de nanoscopía de fluorescencia estaba compuesta por dos familias de técnicas: métodos dirigidos por coordenadas y métodos de localización estocástica. En los métodos dirigidos por coordenadas, como el Stimulated Emission Depletion (STED) o el REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT), el proceso de desconexión es inducido por la luz y la imagen superresuelta se obtiene mediante el barrido de un campo óptico espacialmente modulado que controla la depleción de los fluoróforos en posiciones predefinidas de la muestra. En cambio, los métodos de localización estocástica, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) o la microscopía de localización fotoactivada (PALM), utilizan una iluminación uniforme. En este caso, se obtienen imágenes de fluoróforos individuales y bien separados que se encienden y apagan estocásticamente en la muestra. La imagen superresuelta se reconstruye utilizando las posiciones de cada fluoróforo medido, que se obtienen a partir de los ajustes de sus imágenes individuales a la función de dispersión de puntos del microscopio. Estas técnicas están ahora bien establecidas con microscopios comerciales de varias empresas disponibles en el mercado. Aunque no existe un límite fundamental para la resolución espacial de estos métodos, en la práctica alcanzan entre 20 y 30 nm de resolución lateral debido al limitado número de fotones de fluorescencia detectables, impuesto principalmente por la fotodegradación de los fluoróforos. Naturalmente, es interesante alcanzar resoluciones más altas para acceder a la escala entre 1 y 20 nm. Especialmente interesante sería alcanzar el régimen de sub-10 nm, ya que ese es el tamaño típico de las proteínas estructurales. Por lo tanto, estos métodos permitirían estudiar las estructuras proteicas supramoleculares con resolución molecular en condiciones biológicamente compatibles. Por lo tanto, es interesante investigar las vías para conseguir métodos de nanoscopía de fluorescencia más eficientes con respecto a los fotones detectados. Recientemente, la técnica Maximally INFormative LUminescence eXcitation (MINFLUX) ha puesto en marcha una nueva generación de métodos de nanoscopía de fluorescencia que combina las ventajas de los métodos dirigidos por coordenadas y métodos de localización estocástica, para extraer la máxima información posicional de una única molécula utilizando un número mínimo de fotones. MINFLUX utiliza campos de excitación que comprenden un mínimo de intensidad para interrogar la posición de moléculas individuales y puede ofrecer de forma rutinaria una precisión de localización de ~ 1 nm. En esta Tesis, se presentan nuevos métodos eficientes en uso de fotones para localizar moléculas individuales con luz estructurada con un mínimo de intensidad. El Capítulo 1 describe los fundamentos de la microscopía de fluorescencia y la nanoscopía de fluorescencia. Se presentan los principios comunes subyacentes. Se revisan los diferentes tipos de técnicas de nanoscopía, incluidos los desarrollos más recientes, y se resume el estado de la técnica en este campo. En el Capítulo 2 se presenta el desarrollo de una versión paralelizada de la nanoscopía RESOLFT dirigida por coordenadas. Este microscopio utiliza una combinación de dos patrones de luz de campo amplio: una matriz de mínimos de luz y un patrón de focos múltiples. Este novedoso esquema de iluminación consigue una mayor sensibilidad al mejorar la detección de fotones y el rechazo del fondo, proporcionando la mejor combinación de campo de visión y resolución espacio-temporal reportada en microscopía de células vivas en el momento de escribir esta Tesis: 50 nm resolución lateral y tiempos de adquisición de 1 s para la obtención de imágenes de células enteras. El Capítulo 3 describe la localización de moléculas fluorescentes individuales mediante una secuencia de exposiciones a patrones de luz estructurada. Se discuten los trabajos anteriores en este campo y se desarrolla y describe un marco matemático común que utiliza la teoría de la Estimación de Máxima Verosimilitud (MLE). Este marco matemático sirve para comparar diferentes métodos y también facilita el diseño de nuevos esquemas experimentales. Como ejemplo, se proponen dos nuevos métodos de localización que combinan los puntos fuertes de los esquemas existentes. En el Capítulo 4 se presenta una implementación novedosa y simplificada del concepto de localización MINFLUX. A diferencia de la implementación original, p-MINFLUX utiliza pulsos láser intercalados para suministrar los focos de excitación de forma toroidal a una velocidad de repetición máxima, generando así un barrido efectivo a escala de nanosegundos de los mínimos de luz. Utilizando sistemas modelo de origami de ADN tanto estáticos como dinámicos, demostramos su efectividad para la nanoscopía de localización de moléculas individuales y el tracking o seguimiento, respectivamente. La precisión de la localización de 1 − 2 nm se consigue con 2000 − 1000 fotones. Además, p-MINFLUX proporciona acceso al tiempo de vida de la fluorescencia. Hemos aplicado esta información para adquirir señales multiplexadas discernidas por el tiempo de vida y para realizar microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) con una resolución de 3 − 4 nm (precisión de localización de 1 − 2 nm), que es una resolución al menos un orden de magnitud mejor que la reportada previamente en imágenes de tiempo de vida. En el Capítulo 5 se describe el desarrollo de un nuevo método de localización de moléculas individuales utilizando mínimos de luz. Al escanear un haz de luz que presenta un mínimo de intensidad (idealmente un cero) sobre una molécula individual fluorescente, la posición del emisor puede estimarse con precisiones equivalentes a MINFLUX o mejores. A diferencia del MINFLUX, que requiere montajes de gran complejidad técnica, este enfoque de escaneo rasterizado del mínimo de excitación puede implementarse directamente en cualquier microscopio de escaneo láser simplemente introduciendo un elemento óptico pasivo, como una placa de fase vortical, para obtener un foco en forma de toroide. Caracterizamos el rendimiento de este nuevo método mediante cálculos teóricos, simulaciones numéricas y experimentos de nanoscopía. Por último, las conclusiones de esta Tesis y las perspectivas a futuro se desarrollan en el Capítulo 6.Super-resolution microscopy, or more accurately fluorescence nanoscopy techniques have revolutionized fluorescence-based imaging reaching resolutions in the nanometer range, well beyond the diffraction limit of light. The key enabling concept is the switching of fluorophores between a fluorescent and a non-fluorescent state. This "on-off switching" enables the sequential localization of a subset of fluorophores on the sample with a precision beyond the diffraction limit. The first generation of fluorescence nanoscopy was composed of two families of techniques: coordinate targeted and coordinate stochastic methods. In coordinate targeted methods, such as Stimulated Emission Depletion (STED) or REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT), the off-switching process is light-induced and the super-resolved image is obtained by scanning a spatially modulated optical field that controls the off-switching of fluorophores on predefined positions of the sample. In contrast, coordinate stochastic methods such as Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) or Photo-activated localization microscopy (PALM), use uniform illumination. In this case, individual and well-separated fluorophores are imaged as they switch on and off stochastically over the sample. The super-resolved image is reconstructed using the positions of each measured fluorophore, which are obtained from fits of their individual images to the point spread function of the microscope. These techniques are now well established with commercial microscopes available in the market from several companies. Although there is no fundamental limit to the spatial resolution of these methods, in practice they hardly reach 20 to 30 nm of lateral resolution due to the limited number of detectable fluorescence photons, imposed mainly by the photo-degradation of fluorophores. Naturally, it is of interest to achieve higher resolutions in order to access to the scale between 1 and 20 nm. Particularly interesting would be to reach the sub-10 nm regime because that is the typical size of structural proteins. Therefore, such methods would enable the study of supramolecular protein structures with molecular resolution under biologically compatible conditions. It is therefore of interest to investigate routes for more photon-efficient methods of fluorescence nanoscopy. Recently, the technique Maximally INFormative LUminescence eXcitation (MINFLUX) has launched a new generation of fluorescence nanoscopy methods that combines the advantages of coordinate-stochastic and coordinate-targeted methods, to extract maximum positional information of a single molecule using minimal photon counts. MINFLUX uses excitation fields comprising an intensity minimum to interrogate the position of single molecules and can routinely deliver a localization precision of ~ 1 nm. In this Thesis, new photon-efficient methods to localize single molecules with structured light featuring a minimum of intensity are presented. Chapter 1 describes the fundamentals of fluorescence microscopy and fluorescence nanoscopy. The common underlying principles are presented. The different types of nanoscopy techniques, including the most recent developments, are reviewed and the state of the art of the field is summarized. In Chapter 2 the development of a parallelized version of the coordinate-targeted RESOLFT nanoscopy is presented. This microscope uses a combination of two widefield light patterns: an array of light minima and a multi-foci pattern. This novel illumination scheme achieves higher sensitivity by enhancing photon collection and background rejection, delivering the best reported combination of field of view and spatiotemporal resolution in live-cell microscopy at the time of writing this thesis: 50 nm lateral resolution and 1 s acquisition times for whole cell imaging. Chapter 3 describes the localization of single fluorescent molecules by using a sequence of exposures to structured light patterns. Previous work on the field is discussed and a common mathematical framework using Maximum Likelihood Estimation (MLE) theory is developed and described. This mathematical framework serves as a way to benchmark different methods and also facilitates the design of new experimental schemes. As an example, two new localization methods which combine the strengths of existing schemes are proposed. A novel and simplified implementation of the MINFLUX localization concept is presented in Chapter 4. In contrast to the original implementation, p-MINFLUX uses interleaved laser pulses to deliver the doughnut-shaped excitation foci at a maximum repetition rate thus generating an effective nanosecond-scale scan of the light minima. Using both static and dynamic DNA origami model systems, we demonstrate its performance for single-molecule localization nanoscopy and tracking, respectively. Localization precision of 1−2 nm is achieved with 2000 − 1000 photon counts. In addition, p-MINFLUX provides access to the fluorescence lifetime. We have applied this information to acquire multiplexed signals discerned by lifetime and to perform fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) with 3-4 nm resolution (1-2 nm localization precision), that it is a resolution at least one order of magnitude better than previously reported in lifetime imaging. In Chapter 5 the development of a new single-molecule localization method using light minima is described. By scanning a beam of light featuring an intensity minimum (ideally a zero) over a single fluorescent molecule, the position of the emitter can be estimated with precisions equivalent to MINFLUX or better. In contrast to MINFLUX, which requires set-ups of high technical complexity, this approach of raster scanning the excitation minimum can be directly implemented in any laser-scanning microscope simply introducing a passive optical element, such as a vortex phase plate, to obtain a doughnut-shaped focus. We characterize the performance of this new method through theoretical calculations, numerical simulations and nanoscopy experiments. Finally, the conclusions of this Thesis and future perspectives are unfolded in Chapter 6.Fil: Masullo, Luciano Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina