Regulation Of Plasma Von Willebrand Factor (Vwf) By Modifier Genes

Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/106136/1/jth01723.pd

Modifier genes for disorders of thrombosis and hemostasis

Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/72106/1/j.1538-7836.2009.03362.x.pd

Cloning, expression and functional characterization of the full-length murine ADAMTS13

Functional deficiency or absence of the human von Willebrand factor (VWF)-cleaving protease (VWF-cp), recently termed ADAMTS13, has been shown to cause acquired and congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), respectively. As a first step towards developing a small animal model of TTP, we have cloned the complete (non-truncated) murine Adamts13 gene from BALB/c mice liver poly A + mRNA. Murine ADAMTS13 is a 1426-amino-acid protein with a high homology and similar structural organization to the human ortholog. Transient expression of the murine Adamts13 cDNA in HEK 293 cells yielded a protein with a molecular weight of approximately 180 kDa which degraded recombinant murine VWF (rVWF) in a dose-dependent manner. The cleavage products of murine rVWF had the expected size of 140 and 170 kDa. Murine ADAMTS13 was inhibited by EDTA and the plasma from a TTP patient.Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/73592/1/j.1538-7836.2005.01246.x.pd

Development of Bicyclo[3.1.0]hexane-based A3 receptor ligands: closing the gaps in the structure–affinity relationships

The adenosine A3 receptor is a promising target for treating and diagnosing inflammation and cancer. In this paper, a series of bicyclo[3.1.0]hexane-based nucleosides was synthesized and evaluated for their P1 receptor affinities in radioligand binding studies. The study focused on modifications at 1-, 2-, and 6-positions of the purine ring and variations of the 5'-position at the bicyclo[3.1.0]hexane moiety, closing existing gaps in the structure-affinity relationships. The most potent derivative 30 displayed moderate A3AR affinity (Ki of 0.38 μM) and high A3R selectivity. A subset of compounds varied at 5'-position was further evaluated in functional P2Y1R assays, displaying no off-target activity.Medicinal Chemistr

Genetic regulation of plasma von Willebrand factor levels: quantitative trait loci analysis in a mouse model

Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/72680/1/j.1538-7836.2007.02325.x.pd

Selection on cis-Regulatory Variation at B4galnt2 and Its Influence on von Willebrand Factor in House Mice

The RIIIS/J inbred mouse strain is a model for type 1 von Willebrand disease (VWD), a common human bleeding disorder. Low von Willebrand factor (VWF) levels in RIIIS/J are due to a regulatory mutation, Mvwf1, which directs a tissue-specific switch in expression of a glycosyltransferase, B4GALNT2, from intestine to blood vessel. We recently found that Mvwf1 lies on a founder allele common among laboratory mouse strains. To investigate the evolutionary forces operating at B4galnt2, we conducted a survey of DNA sequence polymorphism and microsatellite variation spanning the B4galnt2 gene region in natural Mus musculus domesticus populations. Two divergent haplotypes segregate in these natural populations, one of which corresponds to the RIIIS/J sequence. Different local populations display dramatic differences in the frequency of these haplotypes, and reduced microsatellite variability near B4galnt2 within the RIIIS/J haplotype is consistent with the recent action of natural selection. The level and pattern of DNA sequence polymorphism in the 5′ flanking region of the gene significantly deviates from the neutral expectation and suggests that variation in B4galnt2 expression may be under balancing selection and/or arose from a recently introgressed allele that subsequently increased in frequency due to natural selection. However, coalescent simulations indicate that the heterogeneity in divergence between haplotypes is greater than expected under an introgression model. Analysis of a population where the RIIIS/J haplotype is in high frequency reveals an association between this haplotype, the B4galnt2 tissue-specific switch, and a significant decrease in plasma VWF levels. Given these observations, we propose that low VWF levels may represent a fitness cost that is offset by a yet unknown benefit of the B4galnt2 tissue-specific switch. Similar mechanisms may account for the variability in VWF levels and high prevalence of VWD in other mammals, including humans

Darstellung von neuartigen Pt(II)- und Au(I)-Komplexen sowie Glucoseacetalverbindungen und ihre Testung hinsichtlich der Hemmung von Selen-abhängigen Redoxenzymen, Zytotoxizität bzw. Wechselwirkungen mit DNA

Ein neuer vielversprechender Ansatz, die Resistenz von Tumorzellen gegen Zytostatika zu umgehen, stellte die Hemmung von selenhaltigen Redoxenzymen, Glutathionperoxidase (GPx) und Thioredoxinreduktase (TrxR), dar. Das Ziel dieser Arbeit war, neuartige GPx-Inhibitoren zu entdecken und zu entwickeln. Der erste Ansatz war die Synthese und biologische Testung einer Zuckeracetal-Struktur, die als GPx-1-Inhibitor postuliert wurde. Synthetische Abwandlungen ergaben vier Acetale aus Glucosederivaten und Benzaldehyden. Jedoch zeigten diese ersten hergestellten Verbindungen keinerlei Hemmwirkung auf die bovine GPx-1. Der zweite Ansatz war, bereits bekannte, schwach aktive Leitstrukturen durch Koordinierung von Pt(II) an den Heterozyklus (2-Methylimidazol, Imidazol oder Pyrazol) zu stärkeren Hemmstoffen der GPx abzuwandeln, wobei das Platin(II)-atom an das Selen des Enzyms koordiniert und dies irreversibel hemmt. Es wurde eine Substanzbibliothek aus 15 heterozyklischen Liganden synthetisiert, welche anschließend mit Cis- oder Transplatin zu den cis- bzw. trans-Monochlorido-Platin(II)-Komplexen umgesetzt wurden. So wurden 28 Platinverbindungen in guter Reinheit erhalten und verschiedenen biologischen Testungen unterzogen. Diese Testungen umfassten Versuche zur Hemmung der bovinen GPx-1, wobei jedoch festgestellt wurde, dass dieses Enzym nicht gehemmt wurde. Weiterhin wurde untersucht, ob die TrxR, ein weiteres Selen-abhängiges Redoxenzym, durch diese Verbindungen inhibiert wird, was teilweise der Fall war, auch wenn keine eindeutigen Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgestellt werden konnten. Die Pt(II) enthaltenden Substanzen wurden auch auf ihre Fähigkeit, die Proliferation von humanen Krebszelllinien zu hemmen, getestet. Es wurde festgestellt, dass einige der Verbindungen in der Lage sind, die Zellteilung mit IC50-Werten unterhalb 1 µM zu unterbinden. Dabei handelte es sich meist um cis-konfigurierte Platin(II)-Verbindungen, aber auch manche trans-Pt-Komplexe waren aktiv. Auch konnte gezeigt werden, dass der Zelluntergang durch Apoptose herbeigeführt wird Diese ermutigenden Ergebnisse belegen, dass ein Platinkomplex nicht zwangsläufig bifunktionell sein muss, um das Zellwachstum effektiv zu hemmen. Weiterhin wurde eine starke Kreuzresistenz zu Cisplatin nur bei ein paar Substanzen beobachtet, manche Verbindungen konnten die Kreuzresistenz sogar vollständig umgehen. Ein paar Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnten beschrieben werden. Zwei cis-trans-Paare der Platin(II)-Komplexe wurden dann für weitergehende Bindungsstudien an DNA ausgewählt. Hierzu wurde die Bindung an Kalbsthymus-DNA untersucht, ebenso wie die Bindung an zelluläre DNA, das Aufwinden von supercoiled DNA, die Veränderung des DNA-Schmelzverhaltens und des Circulardichroismus (CD) von DNA durch Bindung der Platinkomplexe, sowie die Veränderung der Ethidiumbromid-Fluoreszenz durch Hinzugabe der Verbindungen. Es stellte sich heraus, dass die strukturell ähnlichen Verbindungen sehr unterschiedliche Einflüsse auf die DNA haben, was auch in Zusammenhang mit ihrem hydrolytischen Zerfall während der Assays stehen könnte. Da Stabilitätsprobleme bemerkt wurden, wurden die hergestellten Verbindungen mittels HPLC und UV/Vis-Spektroskopie genauer untersucht um ihre Stabilität in wässrigen Medien beurteilen zu können. Es wurde festgestellt, dass die verwendeten Hydrazone in wässrigen Medien zu Benzaldehyden bzw. Acetophenonen und wahrscheinlich zu den korrespondierenden Hydraziden zerfallen. Die Stabilität der Verbindungen könnte starke Einflüsse auf die Ergebnisse der biologischen Testungen haben, sodass dies immer mit berücksichtigt werden sollte, wenn die Ergebnisse interpretiert werden. Es kann nicht aus-geschlossen werden, dass (i) die dargestellten Ergebnisse in Wirklichkeit die Ergebnisse der Zerfallsprodukte sind, und dass (ii) es einen gemeinsamen Grund für den Zerfall und die Auswirkungen im DNA- und Zellmodell gibt. Trotzdem oder auch deswegen handelt es sich um eine vielversprechende Substanzklasse, bei der sich eine nähere Untersuchung hinsichtlich Aufnahme in die Zelle, DNA-Bindung und -Reparatur lohnt, um zu ergründen, ob Resistenzen umgangen werden können. Auch die Zerfallsprodukte sollten hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität untersucht werden. Eine weitere Verbindungsklasse, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, waren N-heterozyklische Carben (NHC)-Au(I)-Komplexe. Sie basierten hauptsächlich ebenfalls wie die Platinverbindungen auf Hydrazonen, auch hier sollte durch die Koordinierung des Metallatoms an den Heterozyklus Imidazol eine Wirkungssteigerung erreicht werden. Die untersuchten Verbindungen zeigten eine starke Inhibition der GPx, der Glutathionreduktase (GR) sowie der TrxR. Eine Selektivität für ein bestimmtes Redoxenzym ist somit mit diesen Verbindungen nicht gegeben, weshalb sie keine guten Kandidaten für weitere Wirkstoffentwicklungen darstellen.A promising new approach to circumvent resistance of cancer cells to anti-cancer drugs is the inhibition of the selenium containing redox enzymes glutathione peroxidase (GPx) and thioredoxin reductase (TrxR), which protect cancer cells from oxidative stress caused by chemotherapy. The goal of this project was to discover and develop new inhibitors of GPx. The first approach was the synthesis and testing of a sugar acetalic compound that was identified earlier as a potential inhibitor of bovine GPx-1. Structural modification produced four acetals from glucose derivatives and various benzaldehydes. However, these compounds did not inhibit the bovine GPx-1 in the least. The second approach was to modify already known but weakly active compounds by coordinating Pt(II) to their heterocycles (2-methylimidazole, imidazole or pyrazole) to act as more potent inhibitors of glutathione peroxidases; it was envisioned that the Pt(II) ion might coordinate strongly with the selenium atom of the active-site selenocysteine and inhibit the enyzme irreversibly. A compound library of 15 heterocyclic ligands was prepared, which were then reacted with cisplatin or transplatin to yield the corresponding cis- or trans- monochlorido platinum(II) complexes. In this way, 28 Pt(II) compounds were generated in sufficient purity and tested in several biological assays. While the compounds were initially designed as inhibitors of bovine GPx-1, it was soon realized that none of the Pt(II) complexes could inhibit this enzyme. Furthermore it was investigated if the TrxR, another selenium-dependent redox enzyme, might be inhibited; this was partly the case but no structure activity relationship could be established. Moreover, the Pt(II) complexes were tested regarding their ability to inhibit the proliferation of human cancer cell lines. It was found that some of the Pt(II) complexes can inhibit cell proliferation with IC50 values below 1 µM. For the most part, these were the cis-configured Pt(II) compounds but some trans-complexes were also active. Also it could be shown that cell death occurred by apoptosis. These encouraging findings indicate that platinum complexes don’t necessarily have to be bifunctional to inhibit cell proliferation effectively. Moreover, many of the compounds revealed no strong cross resistance to cisplatin, and some even circumvented cross resistance completely. Some distinct structure activity relationships were described. Two pairs of cis-trans isomers of the Pt(II) complexes were selected for further DNA binding studies. The binding of the compounds on isolated calf thymus DNA was investigated, as well as binding to cellular DNA, the unwinding of supercoiled DNA, the change of the melting temperature, circular dichroism and ethidium bromide quenching of DNA incubated with them. It turned out that these substances that bear only minor structural differences interact very differently with DNA, which might coincide with their hydrolytic degradation during the assays. Since stability problems were noticed, most synthesized compounds were further examined by HPLC and UV/Vis spectroscopy to assess their aqueous stability. It turned out that the hydrazones, which were a part of the molecules, decompose in aqueous media to benzaldehydes or ketones, respectively, and supposedly to the corresponding hydrazides. The compound stability could have influenced the results of the biological assays, which should be considered when interpreting them. It can’t be excluded that (i) the generated results are actually the results of the degradation products and that (ii) there is a common root cause for degradation and effects in the cellular and DNA assays. The synthesized substances can be considered as a promising substance class, where further investigations concerning cellular uptake, DNA binding and DNA repair are worthwhile to examine if resistances can be avoided. Also the degradation products should be tested for biological activity. A third compound class which was investigated for this thesis were N-heterocyclic carben Au(I) complexes. Like the Pt(II) complexes they are also based on hydrazone ligands, and also the coordination occurred through an imidazole ring to the metal atom. The generated compounds inhibited strongly GPx, TrxR and glutathione reductase. However, there was no selectivity for a particular redox enzyme, making these complexes not very good candidates for further drug development

Development of Bicyclo[3.1.0]hexane-Based A3 Receptor Ligands: Closing the Gaps in the Structure–Affinity Relationships

The adenosine A3 receptor is a promising target for treating and diagnosing inflammation and cancer. In this paper, a series of bicyclo[3.1.0]hexane-based nucleosides was synthesized and evaluated for their P1 receptor affinities in radioligand binding studies. The study focused on modifications at 1-, 2-, and 6-positions of the purine ring and variations of the 5′-position at the bicyclo[3.1.0]hexane moiety, closing existing gaps in the structure–affinity relationships. The most potent derivative 30 displayed moderate A3AR affinity (Ki of 0.38 μM) and high A3R selectivity. A subset of compounds varied at 5′-position was further evaluated in functional P2Y1R assays, displaying no off-target activity

Synthese und Untersuchung von N-modifizierten Derivaten des Analgetikums Flupirtin

Einleitung: Ausgangspunkt dieser Dissertation war das hepatotoxische Analgetikum Flupirtin, dessen Wirkung auf einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit neuronaler KV7-Kaliumkanäle beruht. Ein Vergleich mit dem ebenfalls hepatotoxischen Arzneistoff Paracetamol warf die Frage auf, ob sich dessen Toxizitäts-Mechanismus, der auf der Bildung des aktiven Metaboliten NAPQI, welcher durch oxidativen Metabolismus entsteht, auf Flupirtin übertragen lässt. Durch Synthese von Flupirtin-Analoga mit veränderten oxidativen Eigenschaften sollten neue Erkenntnisse bezüglich der Oxidierbarkeit, Wirksamkeit und Toxizität des Arzneistoffs erhalten werden. Als zusätzliche Leitstruktur wurde die mit Flupirtin verwandte, wirksame Verbindung ICA-027243 verwendet. Synthesen: Im Fokus der Derivatisierungen standen die N-Atome von Flupirtin, da diese bei der Oxidation eine entscheidende Rolle spielen. So gelang es vor allem durch gezielte Neusynthese, alle drei N-Atome um den Pyridin-Ring unabhängig voneinander einzeln oder in Kombination zu alkylieren. Ausgangspunkt des hierfür benötigten Fluorbenzylamin-Bausteins war der entsprechende Benzaldehyd, welcher durch reduktive Aminierung umgesetzt wurde. Als Pyridin-Baustein wurde 2,6-Dichlorpyridin verwendet, an welchem nach der Nitrierung ein Chloratom durch Ammoniak oder Dimethylamin substituiert werden konnte. Nach der Kondensation beider Bausteine erfolgte die Reduktion der Nitrogruppe mit anschließender Acylierung zum entsprechenden Flupirtin-Derivat. Die Alkylierung des Carbamat-NH folgte gegebenenfalls als letzter Reaktionsschritt. Weitere Verbindungen wurden auf mehr oder weniger abgewandelten Syntheserouten hergestellt. Dabei wurde Flupirtin teilweise in Richtung ICA-027243 abgewandelt und Desamino-Flupirtin-Derivate hergestellt. Variiert wurde unter anderem die Position des Pyridin-N-Atoms und die Methylenamino-Brücke zwischen den aromatischen Ringen wurde teilweise durch eine Amid-Brücke ersetzt. Neben weiteren Derivaten wurden auch bizyklische Flupirtin-Derivate durch Pyrolyse von Flupirtin und Retigabin synthetisiert. Testungen: Getestet wurden die synthetisierten Verbindungen auf ihre Oxidierbarkeit mit Cyclovoltammetrie und einer Peroxidase, auf ihre Wirksamkeit mit einem kommerziellen Thallium-Flux-Assay (durchgeführt von der Firma ChanTest, USA) und auf ihre Toxizität mit einer Mäuseleber-Zelllinie (TAMH) in einem MTT-Assay. Im Rahmen einer Masterarbeit in Kooperation mit der Firma Hoffmann-La Roche in Basel sind einige Derivate weitergehend in vitro auf ihre Toxizität untersucht worden. Das zentrale Ergebnis der Testungen war, dass es eine Korrelation zwischen der Oxidierbarkeit der Verbindungen und ihrer Fähigkeit, eine bestimmte Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kaliumkanäle zu erhöhen (Thallium-Flux-Assay), zu geben schien. Hingegen konnte kein entsprechender Zusammenhang zwischen Wirksamkeit der getesteten Verbindungen und ihrer Toxizität im MTT-Assay festgestellt werden.Introduction: The motivation for this thesis was the hepatotoxic analgesic flupirtine, the pharmacological activity of which is based on an increase of the opening probability of neuronal KV7 potassium channels. A comparison of the structure of flupirtine with that of the similarly hepatotoxic analgesic paracetamol (acetaminophen) led to the working hypothesis that the mechanisms of toxicity of the two drugs could be similar. With regards to paracetamol it is now known that the active metabolite NAPQI, formed through oxidative enzymatic processes, is responsible for drug-induced liver injury. By synthesizing flupirtine analogs with altered oxidative properties, it was envisioned that new insights into the toxicity and efficacy of the drug might be gained. The flupirtine-related, active drug ICA-027243 served as additional lead. Chemistry: Structure modification focused on the N-atoms of flupirtine because they appeared to play a crucial role in the oxidation process. All three N-atoms around the pyridine ring were specifically alkylated, either separately or in various combinations. The starting point for the required fluorobenzylamino building block was the respective benzaldehyde, which was subjected to reductive amination. For the pyridine building block 2,6-dichloropyridine was used, which was nitrated prior to the substitution of one of the chlorines for ammonia or dimethylamine, respectively. After condensation of both building blocks, the nitro group was reduced by hydrogenation and the resulting amino group was directly acylated to give the flupirtine derivative. Optionally, the alkylation of the carbamate-NH was performed as an additional reaction step. Additional compounds were synthesized in more or less analogous synthetic routes. Additionally, the flupirtine structure was modified to resemble ICA-027243 and thus deamino flupirtine derivatives were obtained. The alterations included among others a shifting of the pyridine-N-atom or the replacement of the methyleneamino-bridge between the aromatic rings by an amido-bridge. Further flupirtine derivatives synthesized in this thesis were also bicyclic flupirtine derivatives and analogs, obtained through cyclisation of flupirtine and retigabine, respectively. Analytical investigations: The synthesized compounds were tested to assess their oxidation potential by means of cyclic voltammetry and a peroxidase assay. Evaluation of the pharmacological activity relied on a commercially available Thallium-Flux-Assay, carried out in contract with the firm ChanTest (USA). The hepatotoxicity was investigated in vitro with a mouse liver cell line (TAMH) by using an MTT-assay. In cooperation with Hoffmann-La Roche in Basel further investigations on the in vitro hepatotoxicity of a series of the synthesized compounds were initiated in the course of a master thesis. The most important outcomes of these experiments were the unexpected findings that there would appear to be a significant correlation between the oxidizability of compounds and the ability of the compounds to open neuronal KV7 potassium channels, as determined by the Thallium-Flux-Assay. However there is no apparent correlation between oxidation potential, as determined by cyclovoltammetry and hepatotoxicity, as measured by the MTT-Assay

A multi-sensor microsystem for autonomous data gathering.

This dissertation describes the development of an integrated microsystem, 0.5cc in volume, which can autonomously acquire and store data from multiple sensors on and off the system platform. This work is motivated by the desire to gather environmental and biological data using systems that offer substantial reconfigurability and performance and yet are extremely compact. To overcome obstacles to microsystem miniaturization, advances have been made in microsystem packaging and interconnect, sensor-readout circuitry, and microsystem architecture. These advances are demonstrated in a microsystem that incorporates a commercial microcontroller (2 MIPS with 16-bit on-chip ADC), a 16-megabit flash memory, and a custom sensor-interface chip. The interface chip includes a 0.4--3.2mV/fF capacitive-readout circuit, a 1.5mV/ohm resistive-readout circuit, and four low-noise biopotential amplifiers with 100x gain. Serial communication from the microcontroller configures this chip and instructs circuit blocks to be powered only during sampling. Although designed for a flexible sensor population, the microsystem has been configured with on-board capacitive pressure/temperature/humidity sensors as well as off-board neural/EMG electrodes. The microsystem components are integrated into 9.5mm x 7.6mm x 2.0mm (0.16cc) (0.5cc including the battery) using a silicon platform fabricated with microelectromechanical systems (MEMS) technology. The double-sided platform implements air-isolated through-wafer interconnect structures with 25ohms series resistance and 850fF parasitic capacitance, deep-etched cavities for mounting and wire-bonding chips within the platform profile, and a reconfigurable microconnection approach that uses automatic proximity detection to initiate localized solder bonding between off-board sensor leads and thermally-isolated substrate pads with 50--400 micron pitch. Microsystem testing has demonstrated acquisition and storage of 14-bit capacitive sensor data with 0.1--1000s measurement intervals and 8-bit neural-recording data up to 11kHz. Operating under stored-program control, the microsystem performs automatic capacitive sensor calibration using a binary search algorithm and the programmable 40pF 10-bit reference capacitor. It also uses threshold-based spike detection software to accomplish neural data compression, gaining an eightfold increase in recording time and a 67% power savings. With system-level power management and flexible sleep modes, the system can operate from two silver-oxide coin cells for periods of 30 minutes to over one year, consuming an average of 3--20mW for 1--10kHz neural recording and 0.05mW for environmental measurements below 10Hz.Ph.D.Applied SciencesBiomedical engineeringElectrical engineeringUniversity of Michigan, Horace H. Rackham School of Graduate Studieshttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/125139/2/3186684.pd