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Molekulare Mechanismen des serotonergen Systems: Rolle bei neuronalem Wachstum und Rezeptoroligomerisierung
Rolle des 5-HT7/G12 Signalwegs bei der Morpho- und Synaptogenese. Der Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin oder 5-HT) moduliert, zusĂ€tzlich zu seiner Funktion als Neurotransmitter, verschiedene Aspekte der frĂŒhen neuronalen Differenzierung, einschlieĂlich des Neuritenwachstums und der Synaptogenese. Diese Arbeit zeigt, dass die Aktivierung des 5-HT7 Serotoninrezeptors dendritische Verzweigungen, die Formation neuer Synapsen und die spontane synaptische AktivitĂ€t fördert. Die durch die Stimulation des 5-HT7 Rezeptors ausgelösten morphologischen VerĂ€nderungen wurden ausschliesslich durch das G12 Protein vermittelt, was die wichtige Rolle des 5-HT7/G12 Signalswegs fĂŒr die Formation von dendritischen Filopodien und der Synaptogenese unterstreicht. Die Analyse von organotypischen PrĂ€parationen des Hippokampus juveniler MĂ€use zeigte, dass die Aktivierung des 5-HT7/G12 Signalwegs die Formation von dendritischen Spines und die basale neuronale Erregbarkeit erhöhen und zu robusten VerĂ€nderungen der Long Term Potentiation fĂŒhren. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass die Expression des 5-HT7 Rezeptors sowie des G12 Proteins wĂ€hrend der Entwicklung signifikant abnahm. Demzufolge waren die durch den 5-HT7/G12 Signalwegs ausgelösten VerĂ€nderungen in adulten MĂ€usen aufgehoben. Somit kann die regulierte Expression des 5-HT7 Rezeptors und des G12 Proteins einen molekularen Mechanismus darstellen bei dem Serotonin die Formation grundlegender neuronaler Verbindungen wĂ€hrend der frĂŒhen postnatalen Entwicklung spezifisch moduliert. Oligomerisation des 5-HT1A Rezeptors. Die vorliegende Studie analysiert den Oligomerisationszustand des 5-HT1A Rezeptors und untersucht die Oligomerisationsdynamik in lebenden Zellen. Gleichzeitig wurde der Einfluss der Rezeptorpalmitoylierung auf diesen Prozess untersucht. Biochemische Analysen die in Neuroblastomazellen, N1E-115, durchgefĂŒhrt wurden zeigten, dass beide, palmitoylierte und nicht-palmitoylierte 5-HT1A Rezeptoren, Homo-Oligomere bilden und, dass die vorherrschende Rezeptorspezies an der Plasmamembran Dimere sind. Eine Kombination von Akzeptor-Photobleaching FRET mit Fluoreszens Lifetime Messungen verifizierte die Interaktion von CFP- und YFP gelabelten Wildtyp sowie Acylation-defizienten 5-HT1A Rezeptoren an der Plasmamembran lebender Zellen. Durch die Nutzung einer neuen FRET Technik, die auf spektraler Analyse beruht, konnte die spezifische Natur der Rezeptoroligomerisierung bestĂ€tigt werden. Die Analyse der Oligomerisationdynamik zeigte, dass die apparente FRET Effizienz die bei Wildtyp Oligomeren in Reaktion auf Agoniststimulation gemessen wurde, signifikant erniedrigt war. Die kombinierten Ergebnisse lassen darauf schliessen, dass diese Erniedrigung durch Akkumulation von FRET negativen Komplexen und nicht durch die Dissoziation von Oligomeren zu Monomeren vermittelt werden. Im Kontrast dazu, war der Agonist vermittelte RĂŒckgang des FRET Signals bei Oligomeren aus nicht-palmitoylierten Rezeptor Mutatanten komplett aufgehoben, was auf die Bedeutung der Palmitoylierung bei der Modulation der Struktur der Oligomere hinweist
Quantitative Measurement of cAMP Concentration Using an Exchange Protein Directly Activated by a cAMP-Based FRET-Sensor
Förster resonance energy transfer (FRET)-based biosensors for the quantitative analysis of intracellular signaling, including sensors for monitoring cyclic adenosine monophosphate (cAMP), are of increasing interest. The measurement of the donor/acceptor emission ratio in tandem biosensors excited at the donor excitation wavelength is a commonly used technique. A general problem, however, is that this ratio varies not only with the changes in cAMP concentration but also with the changes of the ionic environment or other factors affecting the folding probability of the fluorophores. Here, we use a spectral FRET analysis on the basis of two excitation wavelengths to obtain a reliable measure of the absolute cAMP concentrations with high temporal and spatial resolution by using an âexchange protein directly activated by cAMPâ. In this approach, FRET analysis is simplified and does not require additional calibration routines. The change in FRET efficiency (E) of the biosensor caused by [cAMP] changes was determined as ÎE = 15%, whereas E varies between 35% at low and 20% at high [cAMP], allowing quantitative measurement of cAMP concentration in the range from 150 nM to 15 ÎŒM. The method described is also suitable for other FRET-based biosensors with a 1:1 donor/acceptor stoichiometry. As a proof of principle, we measured the specially resolved cAMP concentration within living cells and determined the dynamic changes of cAMP levels after stimulation of the Gs-coupled serotonin receptor subtype 7 (5-HT7)
Regulation of rat heme oxygenase-1 expression by interleukin-6 via the Jak/STAT pathway in hepatocytes
SORAVE: A phase I trial to evaluate safety and efficacy of combination therapy with everolimus and sorafenib.
Computational insights into O-glycosylation in a CTLA4 Fc-fusion protein linker and its impact on protein quality attributes
Separation of Paraffin-Cycloparaffin Portion of Naphtha into Normal, Branched, and Cycloparaffins
Sorafenib and everolimus in patients with advanced solid tumors and KRAS-mutated NSCLC: A phase I trial with early pharmacodynamic FDG-PET assessment
Background Treatment of patients with solid tumors and KRAS mutations remains disappointing. One option is the combined inhibition of pathways involved in RAF-MEK-ERK and PI3K-AKT-mTOR. Methods Patients with relapsed solid tumors were treated with escalating doses of everolimus (E) 2.5-10.0 mg/d in a 14-day run-in phase followed by combination therapy with sorafenib (S) 800 mg/d from day 15. KRAS mutational status was assessed retrospectively in the escalation phase. Extension phase included KRAS-mutated non-small-cell lung cancer (NSCLC) only. Pharmacokinetic analyses were accompanied by pharmacodynamics assessment of E by FDG-PET. Efficacy was assessed by CT scans every 6 weeks of combination. Results Of 31 evaluable patients, 15 had KRAS mutation, 4 patients were negative for KRAS mutation, and the KRAS status remained unknown in 12 patients. Dose-limiting toxicity (DLT) was not reached. The maximum tolerated dose (MTD) was defined as 7.5 mg/d E + 800 mg/d S due to toxicities at previous dose level (10 mg/d E + 800 mg/d S) including leucopenia/thrombopenia III degrees and pneumonia III degrees occurring after the DLT interval. The metabolic response rate in FDG-PET was 17% on day 5 and 20% on day 14. No patient reached partial response in CT scan. Median progression free survival (PFS) and overall survival (OS) were 3.25 and 5.85 months, respectively. Conclusions Treatment of patients with relapsed solid tumors with 7.5 mg/d E and 800 mg/d S is safe and feasible. Early metabolic response in FDG-PET was not confirmed in CT scan several weeks later. The combination of S and E is obviously not sufficient to induce durable responses in patients with KRAS-mutant solid tumors