Estudio del reconocimiento del antígeno Tn por anticuerpos/lecitinas para el desarrollo de vacunas y nuevas herramientas de diagnóstico frente al cáncer

Los resultados que se muestran en esta tesis doctoral recogen el estudio de las bases moleculares de la interacción que se produce entre el la lectina SBA, que reconoce el azúcar GalNAc selectivamente, y también con el anticuerpo 1SM3, que reconoce la secuencia APDT*RP, glicosilada en treonina, de MUC1. Un primer artículo recoge la interacción de la lectina SBA con el glicopéptido del antígeno Tn. El objetivo de este artículo pretende elucidar las bases moleculares de la interacción lectina-glicopéptidos del tipo Tn, derivados del esqueleto aminoacídico de MUC1. Este artículo se publicó en 2014, en la revista ACS CHEMICAL BIOLOGY (DOI: 10.1021/cb500855x).El primer paso de este artículo consistió en la purificación de la lectina SBA, para posteriormente poder realizar una serie de ensayos de afinidad con distintos glicopéptidos y obtener su estructura cristalina para analizar su interacción.Se recibió la lectina SBA liofilizada comercial, pero fue necesario un paso de purificación por una columna de exclusión molecular para evitarnos los posibles agregados que hayan podido surgir al rehidratarla. De este modo conseguimos obtener la lectina en solución para su uso en los ensayos posteriores. Todos los glicopéptidos que se muestran en esta tesis, han sido sintetizados en la Universidad de la Rioja por el grupo de Francisco Corzana. Para los ensayos de afinidad, dinámica molecular, RMN y cristalización se utilizaron una versión de glicopéptidos cortos. También se utilizaron unos derivados más largos, compuestos por la secuencia completa de MUC1 y glicosilados cada uno en una treonina distinta de las secciones del péptido, que se sintetizaron para estudiar como afectaban el resto de aminoácidos en el reconocimiento. Los ensayos de calorimetría de titulación isoterma (ITC), muestran como el glicopéptido 4 (APDT*R) presenta una mayor afinidad, frente a una baja afinidad por el glicopéptido 5 (APGST*AP) y prácticamente nula con el glicopéptido 3 (AHGVT*SA) por el cálculo de la constante de disociación. Se obtuvieron los mismos resultados de afinidad obtenidos por ensayos ELLA. En cuanto a sus parámetros termodinámicos de unión, los dos glicopéptidos que se pudo calcular sus Kds están favorecidos entálpicamente.Tras obtener estos resultados, se planteó la duda de si un glicopéptido más largo podría afectar a las interacciones en solución, en complejo con la lectina. Para resolverla se utilizaron los antes mencionados derivados más largos. Los resultados que se obtuvieron con los péptidos largos fueron equivalentes a los obtenidos con los péptidos cortos.Solo se obtuvo la estructura cristalina de la lectina SBA con el glicopéptido 4. Por rayos X presentaba dos modos de unión diferentes, también observadas en solución (DM y RMN). La densidad electrónica de la alanina no se observa en ninguna estructura, lo que sugiere que queda expuesto al solvente y posee una gran flexibilidad frente al resto de interacciones con lectina. Los modos de unión A y B difieren en la geometría del enlace glucosídico (asociado a Thr4), en A Thr4 adopta una conformación plegada y extendida en B.Si analizamos la superficie de potencial electrostático de la lectina, se puede observar como el glicopéptido 4 se posiciona en su superficie, interaccionando el azúcar y la cadena lateral del aminoácido de la arginina con dos zonas de potencial electrostático negativo de la lectina.A nivel de interacción entre aminoácidos podemos ver como se forman algunos puentes de H representados con flechas verdes y rojas. En el modo de unión A, se observa como los OH de GalNAc interaccionan con la lectina. El O3 forma puentes de H con Asp88 y Asn130, O4 también forma puente de H con Asp88 y con Leu214. El grupo carbonilo del N-acetilo de GalNAc interacciona con el amino (NH) de Gly106. Este enlace explica porque SBA une con gran afinidad a GalNAc frente a Galactosa. También se forma una interacción CH-pi entre la cara alfa del azúcar y Phe128. El grupo metilo de Thr4 también está involucrado con Phe128. Esta interacción puede ser responsable de la gran afinidad de SBA hacia el antígeno Tn cuando el aminoácido implicado es una treonina.Además de las interacciones que se formaban con el azúcar, se observó que la Arg5 participa en un puente iónico con Glu113 y un puente de H con el OH de Tyr107. Asp3 forma un puente de H con las cadenas laterales de Asn130 y Ser 131.En el modo de unión B, la interacción del glicopéptido con Ser 131 y Tyr107 son prácticamente nulas.En ambos modelos, Asp3 participa en un pte H con el grupo NH de GalNAc y otro con Thr4.Para demostrar la importancia de ambos aminoácidos en la unión a la lectina, se diseñó un glicopéptido 4 sustituyendo Asp3 y Arg5 por Ala. Este nuevo glicopéptido no fue reconocido por SBA, lo que corrobora la importancia de Asp3 y Arg5 en el proceso de reconocimiento.Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes.• Se ha logrado cristalizar la lectina SBA con distintos antígenos derivados de MUC1• Se han observado dos modos de unión diferenciados por la conformación del enlace glucosídico• Los residuos de Asp y Arg en la secuencia PDTR parecen fijar la conformación tanto del péptido como del carbohidrato para maximizar las interacciones con las lectinasEl objetivo del segundo artículo pretende caracterizar las bases moleculares de cómo el antígeno 1SM3-ScFv reconoce a los antígenos que contengan serina o treonina. Este artículo se publicó en 2015, en la revista ANGEWANTE COMMUNICATIONS (PMID: 26118689).El primer paso de este artículo consistió en la elección de un fragmento del anticuerpo adecuado y funcional derivado de 1SM3, para proceder a su expresión y purificación, posteriormente poder realizar una serie de ensayos de afinidad con distintos glicopéptidos y obtener su estructura cristalina para analizar su interacción.Los anticuerpos son modulares y se pueden extraer sus dominios por separado. Nosotros elegimos usar una proteína de fusión o fragmento variable de cadena sencilla, formada por los módulos terminales del brazo Fab del anticuerpo, cada uno de una cadena, ligera y pesada. Este método resulta más fácil de expresar y menos costoso económicamente. Una vez seleccionado el fragmento, lo clonamos, expresamos y purificamos. El clonaje se llevó a cabo en primer lugar en bacterias, y aunque se consiguió expresar, la purificación no era óptima por lo que se optó por el uso de levaduras. El plásmido clonado que contenía la construcción se transfectó por electoporación en Pichia Pastoris, cepa X33. Una vez seleccionada la colonia que expresaba la proteína de fusión, se expresó en gran cantidad y purificó mediante una columna de afinidad a níquel, ya que la construcción poseía una cola de histidinas, seguida de una cromatografía de exclusión molecular para eliminar impurezas. Para los ensayos de asociación se utilizaron estos 4 péptidos largos, tanto desnudos como glicosilados. Sin embargo, para obtener las estructuras cristalográficas se utilizaron modelos simplificados de los mismos, siendo estos el menor epítopo reconocido por el anticuerpo anti- MUC1.Primero se analizó la influencia de GalNAc en la unión al anticuerpo por Interferometría de biocapa (BLI). Se observó una afinidad tres veces mayor para el glicopéptido de treonina frente al péptido de treonina sin glicosilar para el fragmento purificado de 1SM3. Los péptidos y glicopéptidos con serina muestran una afinidad muy inferior en comparación con la Thr. Estos resultados han sido corroborados por ensayos ELISA obteniendo los mismos resultados para el anticuerpo comercial, lo que corrobora que el fragmento se posee la misma afinidad que el anticuerpo completo.Se obtuvieron tres estructuras cristalinas del fragmento del anticuerpo con tres glicopéptidos distintos. Todos muestran una buena unión del péptido independientemente de la presencia del azúcar. La conformación también es prácticamente idéntica para los 3 (1, 1* y 2*).La presencia de GalNAc apenas afecta a la conformación del esqueleto peptídico unido al anticuerpo 1SM3. Los contactos estabilizantes están formados por puentes de H, algunos de ellos formados por moléculas de agua y las que se describen a continuación.Se forman interacciones CH-pi de la Pro2 con Trp91L, Trp96L y Tyr32L.Las cadenas laterales de Asp3 y Arg5 interaccionan con puentes de H con el Trp33H y Tyr32H respectivamente.También para 1* y 2* se forman los siguientes enlaces. La amina de Ala1 y el grupo carbonilo de Thr4/Ser4 forman puentes de H con Tyr32L y Gln97H, respectivamente.La presentación de la cadena lateral de Arg5 en el glicopéptido 2* difiere significativamente de sus análogos. No forma puente de H entre la cadena lateral (Arg5) y el grupo carbonilo de Asn31H. Esta interacción, además de otros factores, pueden ser la causa de la baja afinidad de 1SM3 con 2*.La mayor diferencia entre la unión de 1SM3 con los glicopéptidos 1* y 2* reside en la geometría del enlace glucosídico.1SM3:1* adopta una conformación exo-anomerica/syn esperada, con valores de fi y psi en torno a 63º y 91º, respectivamente. Esta conformación es la que se observó en la unión del glicopéptido ajeno a MUC1 con 237-mAb y entre SBA y 1* (Artículo I). Esta geometría permite la formación de un puente de H intermolecular entre el grupo hidroximetilo de GalNAc (O6) y la cadena lateral de Tyr32L de 1SM3. El grupo N-acetilo del azúcar interacciona con el anillo aromático de Trp33H que proporciona la selectividad de 1SM3 para los antígenos que contienen GalNAc.Sin embargo, GalNAc en el compuesto 2* no establece contactos estabilizadores con el anticuerpo. El enlace glucosídico muestra una conformación de alta energía. Esta conformación es más común para O-alfa-GalNAc-Ser en solución, observada por RMN y MD experimental.Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes.• Se ha conseguido expresar en suficiente cantidad el 1SM3_ScFv usando Pichia pastoris como sistema de expresión.• Se ha demostrado que el fragmento ScFv se comporta de manera muy similar al anticuerpo completo• Se ha logrado cristalizar el anticuerpo 1SM3_ScFv con diferentes péptidos. • Se ha observado una mejor afinidad de 1SM3 con Thr glicosilada frente a Thr sin glicosilar. • Se ha observado una mejor afinidad del anticuerpo 1SM3 con el péptido que contiene Thr glicosilada frente a Ser glicosilada. El objetivo del tercer artículo se centra en el diseño racional de nuevos antígenos Tn en los que el oxígeno del hidroxilo de treonina y serina es reemplazado por azufre y que además contengan “linkers” entre el aminoácido y el carbohidrato para la obtención de mejores vacunas. Este artículo se publicó en 2016, en la revista THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY (DOI:10.1021/acs.joc.6b00833).La glicosilación de GalNAc ha mostrado en serina y treonina que fuerza conformaciones extendidas (en solución), debido a que se forman interacciones estabilizantes entre el azúcar y el péptido. Por ello se han desarrollado glicopéptidos con linkers más largos además de la presencia de un átomo de azufre uniendo al azúcar. Las interacciones en solución que muestran estos glicopéptidos entre el azúcar y la cadena péptidica son insignificantes, ya que muestran un enlace S-glucosídico más flexible y una cadena lateral que también lo es. Además, el linker se localiza perpendicularmente al esqueleto peptídico.Solo se consiguió la estructura cristalina de la proteína de fusión con en glicopéptido 22 del artículo y se analizó su estructura cristalina con SM3.Los puentes de H y los contactos hidrofóbicos de los glicopéptidos naturales (APDT*RP) se mantienen con 22.El aminoácido de prolina se une a Trp91L, Trp96 y Tyr32L. Las cadenas laterales de Asp3 y Arg5 forman uniones hidrófobas con Tyr33H y Tyr32H, respectivamente. El grupo amino (NH) de Ala1 y el grupo carbonilo de Thr4 forman puentes de H con Tyr32L y Gln97H, respectivamente. También se forma un puente de H entre la cadena lateral de Arg5 y el grupo carbonilo de Asn31H.La conformación del fragmento del péptido 22 unido al anticuerpo es idéntica a la observada con los glicopéptidos naturales, indicando que el menor impacto del linker sobre la conformación del péptido en estado sólido. La estructura del linker y GalNAc no pudo ser resuelta por densidad electrónica debido al elevado grado de flexibilidad del “linker”.Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes.• Se ha cristalizado el fragmento 1SM3_ScFv conjuntamente con derivados del antígeno Tn que poseen “linkers” de distintas longitudes que unen el azúcar (GalNAc) al péptido a través de un átomo de azufre.• La presencia de estos “linkers” entre la cadena principal del péptido y el azúcar impide las interacciones intramoleculares, lo que favorece potencialmente la presentación del azúcar para los eventos de reconocimiento molecular.El objetivo del cuarto artículo trata la modificación de la prolina del APDT*RP para mejorar su reconocimiento por parte de los anticuerpos anti-Tn con el fin de usarlos para el diagnóstico de cánceres asociados al antígeno Tn. Este artículo se publicó en 2017, en la revista JACS (DOI: 10.1021/jacs.8b04801).La prolina posee un rol central en la estabilización del complejo antígeno anticuerpo uniéndose a Trp91L, Trp96L y Tyr32L. Esto explica la importancia de esa posición de Pro para la unión a varios anticuerpos anti-MUC1. Estudios recientes han mostrado como los enlaces CH/pi pueden ser potenciados por un aumento de polarización de CH.Se pretende sustituir prolina por derivados de prolina como (4S)-4-fluoro-L-Prolina o 4,4- difluoro-L-prolina para potenciar la afinidad antígeno anticuerpo.Por BLI, se analizó el impacto de la sustitución de H -> F en la asociación con la proteína de fusión de 1SM3.El glicopéptido natural muestra una mejor afinidad que el péptido natural sin glicosilar. El glicopéptido sustituido por un flúor (fP*) presenta una interacción ligeramente mejor que el glicopéptido sustituido por dos flúor (2fP*) y ambos mejor que P*. A su vez mejores estos glicopéptidos presentan mejor afinidad que los mismos péptidos sin glicosilar.Por la técnica de microarrays, con varios anticuerpos comerciales (1SM3 y VU-3C6), se ha obtenido el mismo resultado que por BLI, lo que indica que se produce un modo de unión equivalente en el reconocimiento del antígeno.Para su cristalización se utilizaron variantes simplificadas de fP* (GVTSAfPDT*RPAP)=fP*’La conformación que se observa en la estructura cristalina es idéntica al artículo II o el péptido APDT*RP, sugiere que el flúor no modifica significativamente la estructura del péptido en el estado sólido.Las interacciones entre el esqueleto peptídico con el fragmento del anticuerpo son idénticas a los anteriores, lo que indica que GalNAc glicosilada no influye en el acomodamiento del residuo clave Pro.La distancia del centro del anillo (4S)-4-Fluoro-L-prolina y el Trp91L era significativamente más pequeña que la observada en Pro-Trp de otros complejos. Esto da peso a la premisa inicial que mejora la estabilidad de los complejos que se forman frente a los antígenos no naturales con flúor.También se analizaron por MD los antígenos de 2fP*’ y fP*’. Se obtuvo una distancia de 4.1 y 4.0 respectivamente frente a los 4.7 del glicopéptido natural P*’.Los datos experimentales y teóricos validan y muestran que al mejorar la interacción Pro/Trp a través de sustituciones simples de H -> F representan una forma sencilla de estabilizar el complejo con el anticuerpo.Estos resultados insinúan que los glicopéptidos de MUC1 con colas de flúor pueden ser empleados como antígenos potenciales para la eficiente detección de anticuerpos anti-MUC1.Para probarlo, se realizó un ensayo indirecto ELISA usando P* y 2fP* como antígenos de recubrimiento para detectar anticuerpos anti MUC1 del suero de pacientes con tumores de próstata tanto benignos como malignos.La señal detectada con los antígenos 2fP* resultó más elevada que para la prolina glicosilada en los casos de adenocarcinoma e hiperplasia benigna. También se muestra una mayor concentración de anticuerpos antiMUC1 en tumores malignos, de acuerdo con otros ensayos de cáncer de mama.A la vista de estos resultados podemos concluir, el antígeno de 2fP* presenta una aplicación potencial como biomarcador para la detección mejorada de anticuerpos antiMUC1 circulantes en el suero de pacientes.Las conclusiones que se recogieron de este artículo son las siguientes.• Fragmento 1SM3_ScFv cristalizado conjuntamente con un derivado del antígeno Tn que contiene fluoroprolina• La sustitución H → F mejora la interacción clave CH-π, que es crucial para mejorar la unión del antígeno al anticuerpo• Los antígenos generados en este artículo mejoran la detección de anticuerpos anti-MUC1 en muestras de suero de pacientes con cáncer de próstataEl objetivo del sexto y último artículo el diseño racional de nuevos antígenos Tn en los que el oxígeno del hidroxilo de Ser/Thr es reemplazado por S/Se con el fin de obtener mejores anticuerpos anti-Tn. Este artículo se publicó en 2019, en la revista JACS (DOI: 10.1021/jacs.8b13503).Se diseñaron glicopéptidos que se diferenciaban del natural en la sustitución del átomo de O del enlace glucosídico por S y Se. Una distancia mayor entre el azúcar y el péptido va a alterar la flexibilidad y la conformación del enlace glucosídico al más óptimo para el anticuerpo.Se realizaron ensayos conformacionales por MD y RMN demostraron que tenían distinta geometría en sus enlaces glicosídicos relativos al original que excluye una interacción efectiva entre el esqueleto peptídico y el azúcar. Respecto al esqueleto peptídico, 2* y 3* muestran estructuras plegadas a al Thr4 (S/Se). Esto difiere de 1* que muestra una estructura de lámina beta extendida en solución debido a los puentes de H entre el esqueleto y el azúcar.Así, la energía conformacional requerida asociada al cambio conformacional desde extendido en solución a plegado en el estado sólido se espera que sea mínima.El estudio conformacional detallado muestra como la estructura de 2* y 3* esta preorganizada previamente (en solución) para la unión, a diferencia de 1*. Para confirmar este hecho, se calcularon las constantes de disociación por SPR. Las mejores afinidades se mostraron para 2* y 3* frente a 1* a 25º C. La variación de afinidad del péptido 1* con la temperatura es mayor que los glicopéptidos no naturales. Esto parece indicar que existe alguna penalización entrópica asociada a la unión con 1* y ensalza el comportamiento inherente de 2* y 3*, como se vio en RMN y MD.La estructura cristalina revela que la conformación de unión a 1SM3 es prácticamente idéntica a 1* (en estado sólido). Esto demuestra que el anticuerpo reconoce la conformación bien definida del epítopo, independientemente de la naturaleza del aminoácido glicosilado. Al igual que ocurre en 1*, 2* y 3 también se estabilizan por puentes de H mediados por H2O o intermoleculares.El glicopéptido 2* presenta dos modos de unión con 1SM3 que difieren en la geometría del enlace glucosídico por eso la densidad electrónica no pudo ser calculada y ajustada. Lo mismo ocurre en el caso del glicopéptido 3*.A la vista de los resultados obtenidos, se planteó la posibilidad de probarlo en una vacuna. Para ello, el glicopéptido que se diseñó contenía el tándem completo de la secuencia de MUC1 añadiendo SThr glicosilada, lo cual mejora la preorganización de la estructura del epítopo (mejora entrópica). También se incluye la sustitución de prolina por fluoroprolina que produce una mejora de la unión del antígeno con el anticuerpo, (por suponer una mejora entálpica).Para su administración, se conjugaron a nanopartículas de oro recubiertas de polietilenglicol (PEG). Estas nanopartículas ya habían sido probadas y suponían una serie de ventajas para su administración. No necesitan adyuvante y son el transportador del antígeno, poseen una baja toxicidad y producen una elevada respuesta inmunogénica. La vacuna se administró en un grupo de 5 ratones en una primera dosis con 3 de refuerzo en intervalos de 21 días. Se mantuvo un grupo de control al que se administraba PBS. El análisis del antisuero mostró que se había producido una respuesta significativa de anticuerpos IgG antiMUC1, siendo IgG1 el isotípo predominante, lo que sugiere que las respuestas inmunes Th2 fueron las predominantes inducidas por las nanopartículas de oro con el glicopéptido.También se observó un aumento de IgMs, lo que sugiere un cambio recombiante de clase incluso sin el uso del epítopo universal de CD4-T que suele utilizarse en el desarrollo de estas vacunas.Para confirmar que los anticuerpos generados eran capaces de reconocer el antígeno MUC1 original en células de tumor, se usaron dos líneas celulares humanas (MCF-7 y T47D) y HEK293T para incubar con los anticuerpos y fueron analizarlos por citometría de flujo. Este gráfico muestra como los anticuerpos reaccionaron frente ambas líneas celulares tumorales y nada frente a HEK293T.Por microscopía confocal y con un anticuerpo secundario marcado con una sonda fluorescente se muestra la presencia de MUC1 en la superficie de ambas líneas celulares. Por último, se comparó la muestra de una biopsia de un paciente de cáncer de mama, con un paciente sano, mostrando el mismo resultado. MUC1 se visualiza únicamente en la s

Molecular Recognition of GalNAc in Mucin-Type O-Glycosylation

N-Acetylgalactosamine (GalNAc)-type O-glycosylation is an essential posttranslational modification (PTM) that plays fundamental roles in biology. Malfunction of this PTM is exemplified by the presence of truncated O-glycans in cancer. For instance, the glycoprotein MUC1 is overexpressed in many tumor tissues and tends to carry simple oligosaccharides that allow for the presentation of different tumor-associated antigens, such as the Tn or sTn antigens (GalNAc-α-1-O-Thr/Ser and Neu5Acα2-6GalNAcα1-O-Ser/Thr, respectively). In other cases, such as tumoral calcinosis associated with O-glycosylation of the fibroblast growth factor 23, O-glycans are absent or less abundant. Significant progress has been made in determining the three-dimensional structures of biomolecules that recognize GalNAc, such as antibodies, lectins, mucinases, GalNAc-transferases, and other glycosyltransferases. Analysis of the complexes between these entities and GalNAc-containing glycopeptides, in most cases derived from crystallographic or NMR analysis, provides an understanding of the key structural elements that control molecular recognition of these glycopeptides. Here, we describe and compare the binding sites of these proteins in detail, focusing on how the GalNAc moieties interact selectively with them. We also summarize the differences and similarities in GalNAc recognition. In general, the recognition of GalNAc-containing glycopeptides is determined by hydrogen bonds between hydroxyl groups and the N-acetyl group of GalNAc with proteins, as well as CH-π contacts in which the hydrophobic α-face of the sugar and the methyl group of NHAc can be involved. The latter interaction usually provides the basis for selectivity. It is worth noting that binding of these glycopeptides depends primarily on recognition of the sugar moiety, with some exceptions such as a few anti-MUC1 antibodies that primarily recognize the peptide backbone and use the sugar to facilitate shape complementarity or to establish a limited number of interactions with the protein. Focusing specifically on the GalNAc moiety, we can observe that there is some degeneracy of interactions within the same protein families, likely due to substrate flexibility. However, when all studied proteins are considered together, despite the commonalities within each protein family, no pattern can be discerned between the different families, apart from the presence of common residues such as Tyr, His, or Asp, which are responsible for hydrogen bonds. The lack of a pattern can be anticipated, given the diverse functions of mucinases, glycosyltransferases, antibodies, and lectins. Finally, it is important to point out that the conformational differences observed in solution in glycopeptides bearing GalNAc-α-1-O-Ser or GalNAc-α-1-O-Thr also can be found in the bound state. This unique characteristic is exploited, for instance, by the enzyme C1GalT1 to broadly glycosylate both acceptor substrates. The findings summarized in this review may contribute to the rational structure-guided development of therapeutic vaccines, novel diagnostic tools for early cancer detection, and new cancer treatments for cancer with tailored anti-Tn or anti-STn antibodies or new drugs to inhibit GalNAc-T isoenzymes

Structural Insights into the Mechanism of Protein O-Fucosylation

Protein O-fucosylation is an essential post-translational modification, involved in the folding of target proteins and in the role of these target proteins during embryonic development and adult tissue homeostasis, among other things. Two different enzymes are responsible for this modification, Protein O-fucosyltransferase 1 and 2 (POFUT1 and POFUT2, respectively). Both proteins have been characterised biologically and enzymatically but nothing is known at the molecular or structural level. Here we describe the first crystal structure of a catalytically functional POFUT1 in an apo-form and in complex with GDP-fucose and GDP. The enzyme belongs to the GT-B family and is not dependent on manganese for activity. GDP-fucose/GDP is localised in a conserved cavity connected to a large solvent exposed pocket, which we show is the binding site of epidermal growth factor (EGF) repeats in the extracellular domain of the Notch Receptor. Through both mutational and kinetic studies we have identified which residues are involved in binding and catalysis and have determined that the Arg240 residue is a key catalytic residue. We also propose a novel SN1-like catalytic mechanism with formation of an intimate ion pair, in which the glycosidic bond is cleaved before the nucleophilic attack; and theoretical calculations at a DFT (B3LYP/6-31+G(d,p) support this mechanism. Thus, the crystal structure together with our mutagenesis studies explain the molecular mechanism of POFUT1 and provide a new starting point for the design of functional inhibitors to this critical enzyme in the future

Inhibitors against Fungal Cell Wall Remodeling Enzymes

Fungal β-1,3-glucan glucanosyltransferases are glucan-remodeling enzymes that play important roles in cell wall integrity, and are essential for the viability of pathogenic fungi and yeasts. As such, they are considered possible drug targets, although inhibitors of this class of enzymes have not yet been reported. Herein we report a multidisciplinary approach based on a structure-guided design using a highly conserved transglycosylase from Sacharomyces cerevisiae, that leads to carbohydrate derivatives with high affinity for Aspergillus fumigatus Gel4. We demonstrate by X-ray crystallography that the compounds bind in the active site of Gas2/Gel4 and interact with the catalytic machinery. The topological analysis of noncovalent interactions demonstrates that the combination of a triazole with positively charged aromatic moieties are important for optimal interactions with Gas2/Gel4 through unusual pyridinium cation–π and face-to-face π–π interactions. The lead compound is capable of inhibiting AfGel4 with an IC value of 42 μm.This work was supported by Spanish MINECO Contracts (CTQ2016‐76155‐R to P.M., and BFU2016‐75633‐P to R.H.‐G.), and an MRC Programme Grant (M004139) to D.M.F.v.A. We also acknowledge the Government of Aragón (Spain) (Bioorganic Chemistry group E‐10 and Protein Targets group B‐89) for financial support. The European Commission is gratefully acknowledged (BioStruct‐X grant agreement no. 283570 and BIOSTRUCTX_5186).Peer Reviewe

Structural and mechanistic insights into the cleavage of clustered O-glycan patches-containing glycoproteins by mucinases of the human gut

Mucinases of human gut bacteria cleave peptide bonds in mucins strictly depending on the presence of neighboring O-glycans. The Akkermansia muciniphila AM0627 mucinase cleaves specifically in between contiguous (bis) O-glycans of defined truncated structures, suggesting that this enzyme may recognize clustered O-glycan patches. Here, we report the structure and molecular mechanism of AM0627 in complex with a glycopeptide containing a bis-T (Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr) O-glycan, revealing that AM0627 recognizes both the sugar moieties and the peptide sequence. AM0627 exhibits preference for bis-T over bis-Tn (GalNAcα1-O-Ser/Thr) O-glycopeptide substrates, with the first GalNAc residue being essential for cleavage. AM0627 follows a mechanism relying on a nucleophilic water molecule and a catalytic base Glu residue. Structural comparison among mucinases identifies a conserved Tyr engaged in sugar-π interactions in both AM0627 and the Bacteroides thetaiotaomicron BT4244 mucinase as responsible for the common activity of these two mucinases with bis-T/Tn substrates. Our work illustrates how mucinases through tremendous flexibility adapt to the diversity in distribution and patterns of O-glycans on mucins

Evidence for substrate assisted catalysis in <i>N</i>-acetylphosphoglucosamine mutase

11 pags, 4 figs, 2 tabs . -- Supplementary data is available at the Publisher's web pageN-acetylphosphoglucosamine mutase (AGM1) is a key component of the hexosamine biosynthetic pathway that produces UDP-GlcNAc, an essential precursor for a wide range of glycans in eukaryotes. AGM belongs to the α-D-phosphohexomutase metalloenzyme superfamily and catalyzes the interconversion of N-acetylglucosamine-6-phosphate (GlcNAc-6P) to N-acetylglucosamine-1-phosphate (GlcNAc-1P) through N-acetylglucosa-mine-1,6-bisphosphate (GlcNAc-1,6-bisP) as the catalytic intermediate. Although there is an understanding of the phosphoserine-dependent catalytic mechanism at enzymatic and structural level, the identity of the requisite catalytic base in AGM1/phosphoglucomu-tases is as yet unknown. Here, we present crystal structures of a Michaelis complex of AGM1 with GlcNAc-6P and Mg, and a complex of the inactive Ser69Ala mutant together with glucose-1,6-bisphosphate (Glc-1,6-bisP) that represents key snapshots along the reaction co-ordinate. Together with mutagenesis, these structures reveal that the phosphate group of the hexose-1,6-bisP intermediate may act as the catalytic base.This work was funded by the MRC Programme Grant M004139

Structural basis for arginine glycosylation of host substrates by bacterial effector proteins

The bacterial effector proteins SseK and NleB glycosylate host proteins on arginine residues, leading to reduced NF-κB-dependent responses to infection. Salmonella SseK1 and SseK2 are E. coli NleB1 orthologs that behave as NleB1-like GTs, although they differ in protein substrate specificity. Here we report that these enzymes are retaining glycosyltransferases composed of a helix-loop-helix (HLH) domain, a lid domain, and a catalytic domain. A conserved HEN motif (His-Glu-Asn) in the active site is important for enzyme catalysis and bacterial virulence. We observe differences between SseK1 and SseK2 in interactions with substrates and identify substrate residues that are critical for enzyme recognition. Long Molecular Dynamics simulations suggest that the HLH domain determines substrate specificity and the lid-domain regulates the opening of the active site. Overall, our data suggest a front-face SNi mechanism, explain differences in activities among these effectors, and have implications for future drug development against enteric pathogens

Atomic and Specificity Details of Mucin 1 O-Glycosylation Process by Multiple Polypeptide GalNAc-Transferase Isoforms Unveiled by NMR and Molecular Modeling

IF/00780/2015 PTDC/BIA-MIB/31028/2017 UIDP/04378/2020 UIDB/04378/2020 LA/P/0140/2020 SFRH/BD/140394/2018 PD/BD/142847/2018 PD00065/2013 DL 57/2016 ROTEIRO/0031/2013-PINFRA/22161/2016 BFU2016-75633-P PID2019-105451GB-I00 E34_R17 LMP58_18 to R.H-G RTI2018-099592-B-C21 ITN, GA-642157 COST Action GLYCONanoProbes (CA18132) ERC-2017-AdG, project number 788143-RECGLYCANMR RTI218-094751-B-C21) DNRF107The large family of polypeptide GalNAc-transferases (GalNAc-Ts) controls with precision how GalNAc O-glycans are added in the tandem repeat regions of mucins (e.g., MUC1). However, the structural features behind the creation of well-defined and clustered patterns of O-glycans in mucins are poorly understood. In this context, herein, we disclose the full process of MUC1 O-glycosylation by GalNAc-T2/T3/T4 isoforms by NMR spectroscopy assisted by molecular modeling protocols. By using MUC1, with four tandem repeat domains as a substrate, we confirmed the glycosylation preferences of different GalNAc-Ts isoforms and highlighted the importance of the lectin domain in the glycosylation site selection after the addition of the first GalNAc residue. In a glycosylated substrate, with yet multiple acceptor sites, the lectin domain contributes to orientate acceptor sites to the catalytic domain. Our experiments suggest that during this process, neighboring tandem repeats are critical for further glycosylation of acceptor sites by GalNAc-T2/T4 in a lectin-assisted manner. Our studies also show local conformational changes in the peptide backbone during incorporation of GalNAc residues, which might explain GalNAc-T2/T3/T4 fine specificities toward the MUC1 substrate. Interestingly, we postulate that a specific salt-bridge and the inverse γ-turn conformation of the PDTRP sequence in MUC1 are the main structural motifs behind the GalNAc-T4 specificity toward this region. In addition, in-cell analysis shows that the GalNAc-T4 isoform is the only isoform glycosylating the Thr of the immunogenic epitope PDTRP in vivo, which highlights the relevance of GalNAc-T4 in the glycosylation of this epitope. Finally, the NMR methodology established herein can be extended to other glycosyltransferases, such as C1GalT1 and ST6GalNAc-I, to determine the specificity toward complex mucin acceptor substrates.publishersversionepub_ahead_of_prin

Self-acetylation at the active site of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1) controls enzyme activity

Acetylation is known to regulate the activity of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1), a key enzyme in gluconeogenesis, by promoting the reverse reaction of the enzyme (converting phosphoenolpyruvate to oxaloacetate). It is also known that the histone acetyltransferase p300 can induce PCK1 acetylation in cells, but whether that is a direct or indirect function was not known. Here we initially set out to determine whether p300 can acetylate directly PCK1 in vitro. We report that p300 weakly acetylates PCK1, but surprisingly, using several techniques including protein crystallization, mass spectrometry, isothermal titration calorimetry, saturation-transfer difference nuclear magnetic resonance and molecular docking, we found that PCK1 is also able to acetylate itself using acetyl-CoA independently of p300. This reaction yielded an acetylated recombinant PCK1 with a 3-fold decrease in kcat without changes in Km for all substrates. Acetylation stoichiometry was determined for 14 residues, including residues lining the active site. Structural and kinetic analyses determined that site-directed acetylation of K244, located inside the active site, altered this site and rendered the enzyme inactive. In addition, we found that acetyl-CoA binding to the active site is specific and metal dependent. Our findings provide direct evidence for acetyl-CoA binding and chemical reaction with the active site of PCK1 and suggest a newly discovered regulatory mechanism of PCK1 during metabolic stress