Survey of the ciliary motility machinery of Drosophila sperm and ciliated mechanosensory neurons reveals unexpected cell-type specific variations: a model for motile ciliopathies

The motile cilium/flagellum is an ancient eukaryotic organelle. The molecular machinery of ciliary motility comprises a variety of cilium-specific dynein motor complexes along with other complexes that regulate their activity. Assembling the motors requires the function of dedicated “assembly factors” and transport processes. In humans, mutation of any one of at least 40 different genes encoding components of the motility apparatus causes Primary Ciliary Dyskinesia (PCD), a disease of defective ciliary motility. Recently, Drosophila has emerged as a model for motile cilia biology and motile ciliopathies. This is somewhat surprising as most Drosophila cells lack cilia, and motile cilia are confined to just two specialized cell types: the sperm flagellum with a 9+2 axoneme and the ciliated dendrite of auditory/proprioceptive (chordotonal, Ch) neurons with a 9+0 axoneme. To determine the utility of Drosophila as a model for motile cilia, we survey the Drosophila genome for ciliary motility gene homologs, and assess their expression and function. We find that the molecules of cilium motility are well conserved in Drosophila. Most are readily characterized by their restricted cell-type specific expression patterns and phenotypes. There are also striking differences between the two motile ciliated cell types. Notably, sperm and Ch neuron cilia express and require entirely different outer dynein arm variants—the first time this has been clearly established in any organism. These differences might reflect the specialized functions for motility in the two cilium types. Moreover, the Ch neuron cilia lack the critical two-headed inner arm dynein (I1/f) but surprisingly retain key regulatory proteins previously associated with it. This may have implications for other motile 9+0 cilia, including vertebrate embryonic nodal cilia required for left-right axis asymmetry. We discuss the possibility that cell-type specificity in ciliary motility machinery might occur in humans, and therefore underlie some of the phenotypic variation observed in PCD caused by different gene mutations. Our work lays the foundation for the increasing use of Drosophila as an excellent model for new motile ciliary gene discovery and validation, for understanding motile cilium function and assembly, as well as understanding the nature of genetic defects underlying human motile ciliopathies

Dielectric characterization of biological cells using high frequency dielectrophoresis

Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse concernent le développement d’une méthode de caractérisation électrique de cellules biologiques, sans marquage, basée sur la diélectrophorèse Ultra Haute Fréquence (DEP-UHF). Sous l’action d’un champ électrique alternatif non uniforme, les cellules biologiques sont soumises à des forces de déplacement essentiellement liées à leurs propriétés diélectriques. En particulier, aux hautes fréquences, le champ électrique pénètre à l’intérieur de la cellule et interagit donc avec son contenu intracellulaire. Il est donc possible d’accéder à une «signature diélectrophorétique» de la cellule représentative de ses propriétés biologiques internes mais aussi de mécanismes physiologiques tels que l’apoptose ou encore la différenciation. Ce manuscrit présente le développement d’un microsystème innovant, implémenté à partir des couches passives d’une puce BiCMOS et couplé à un réseau microfluidique, pour la caractérisation, à l’échelle cellulaire, par DEP-UHF. Le microsystème développé permet une analyse fine et précise du comportement DEP haute fréquence d’une cellule. Un banc expérimental dédié aux caractérisations cellulaires, capable de générer des signaux hautes fréquences dans la gamme 10 MHz – 1 GHz pour des amplitudes allant jusqu’à 18 Vpp, a été développé. Ces travaux exploratoires ont pour but de démontrer le potentiel de discrimination de cette méthode entre différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines à des stades tumoraux différents, dans l’objectif de développer de nouveaux outils d’aide au diagnostic. L’existence de différences significatives entre les signatures de certains types cellulaires ouvre des perspectives très intéressantes notamment pour le développement d’outils de tri cellulaire originaux basés uniquement sur les propriétés diélectriques intracellulaires.The work presented in this dissertation concerns the development of an original label-free electrical characterization method dedicated to biological cells based on Ultra High Frequency dielectrophoresis (DEP-UHF). Under the action of a non-uniform alternative electric field, the biological cells are subjected to displacement forces related to their own dielectric properties. In particular, at high frequencies, the electric field penetrates inside the cell and thus interacts with its intracellular content. Therefore, it is possible to access to a «dielectrophoretic signature» of the cell that it is representative of its internal biological properties but also of physiological mechanisms such as apoptosis or differentiation. This dissertation presents the development of an innovative microsystem, implemented in the passive layer stack of a BiCMOS chip and associated with microfluidic, dedicated to biological characterization, at the cellular level. The developed microsystem allows an accurate analysis of a single cell DEP-UHF behaviour. An experimental bench, dedicated to cell characterization, and able to generate high frequency signals from 10 MHz to 1 GHz up to 18 Vpp magnitude, has been also developed accordingly. Actually, the led exploratory work achieved was focused on evaluating the discrimination potential of this method between different human cancer cells at different tumor stages with the objective to envision new kind of diagnostic tools. Finally, the existence of significant differences between the signatures of different cell types leads to very interesting perspectives, particularly for the development of new cell sorting tools based especially on the intracellular dielectric properties

Caractérisation diélectrique de cellules biologiques par diélectrophorèse haute fréquence

The work presented in this dissertation concerns the development of an original label-free electrical characterization method dedicated to biological cells based on Ultra High Frequency dielectrophoresis (DEP-UHF). Under the action of a non-uniform alternative electric field, the biological cells are subjected to displacement forces related to their own dielectric properties. In particular, at high frequencies, the electric field penetrates inside the cell and thus interacts with its intracellular content. Therefore, it is possible to access to a «dielectrophoretic signature» of the cell that it is representative of its internal biological properties but also of physiological mechanisms such as apoptosis or differentiation. This dissertation presents the development of an innovative microsystem, implemented in the passive layer stack of a BiCMOS chip and associated with microfluidic, dedicated to biological characterization, at the cellular level. The developed microsystem allows an accurate analysis of a single cell DEP-UHF behaviour. An experimental bench, dedicated to cell characterization, and able to generate high frequency signals from 10 MHz to 1 GHz up to 18 Vpp magnitude, has been also developed accordingly. Actually, the led exploratory work achieved was focused on evaluating the discrimination potential of this method between different human cancer cells at different tumor stages with the objective to envision new kind of diagnostic tools. Finally, the existence of significant differences between the signatures of different cell types leads to very interesting perspectives, particularly for the development of new cell sorting tools based especially on the intracellular dielectric properties.Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse concernent le développement d’une méthode de caractérisation électrique de cellules biologiques, sans marquage, basée sur la diélectrophorèse Ultra Haute Fréquence (DEP-UHF). Sous l’action d’un champ électrique alternatif non uniforme, les cellules biologiques sont soumises à des forces de déplacement essentiellement liées à leurs propriétés diélectriques. En particulier, aux hautes fréquences, le champ électrique pénètre à l’intérieur de la cellule et interagit donc avec son contenu intracellulaire. Il est donc possible d’accéder à une «signature diélectrophorétique» de la cellule représentative de ses propriétés biologiques internes mais aussi de mécanismes physiologiques tels que l’apoptose ou encore la différenciation. Ce manuscrit présente le développement d’un microsystème innovant, implémenté à partir des couches passives d’une puce BiCMOS et couplé à un réseau microfluidique, pour la caractérisation, à l’échelle cellulaire, par DEP-UHF. Le microsystème développé permet une analyse fine et précise du comportement DEP haute fréquence d’une cellule. Un banc expérimental dédié aux caractérisations cellulaires, capable de générer des signaux hautes fréquences dans la gamme 10 MHz – 1 GHz pour des amplitudes allant jusqu’à 18 Vpp, a été développé. Ces travaux exploratoires ont pour but de démontrer le potentiel de discrimination de cette méthode entre différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines à des stades tumoraux différents, dans l’objectif de développer de nouveaux outils d’aide au diagnostic. L’existence de différences significatives entre les signatures de certains types cellulaires ouvre des perspectives très intéressantes notamment pour le développement d’outils de tri cellulaire originaux basés uniquement sur les propriétés diélectriques intracellulaires

Caractérisation diélectrique de cellules biologiques par diélectrophorèse haute fréquence

The work presented in this dissertation concerns the development of an original label-free electrical characterization method dedicated to biological cells based on Ultra High Frequency dielectrophoresis (DEP-UHF). Under the action of a non-uniform alternative electric field, the biological cells are subjected to displacement forces related to their own dielectric properties. In particular, at high frequencies, the electric field penetrates inside the cell and thus interacts with its intracellular content. Therefore, it is possible to access to a «dielectrophoretic signature» of the cell that it is representative of its internal biological properties but also of physiological mechanisms such as apoptosis or differentiation. This dissertation presents the development of an innovative microsystem, implemented in the passive layer stack of a BiCMOS chip and associated with microfluidic, dedicated to biological characterization, at the cellular level. The developed microsystem allows an accurate analysis of a single cell DEP-UHF behaviour. An experimental bench, dedicated to cell characterization, and able to generate high frequency signals from 10 MHz to 1 GHz up to 18 Vpp magnitude, has been also developed accordingly. Actually, the led exploratory work achieved was focused on evaluating the discrimination potential of this method between different human cancer cells at different tumor stages with the objective to envision new kind of diagnostic tools. Finally, the existence of significant differences between the signatures of different cell types leads to very interesting perspectives, particularly for the development of new cell sorting tools based especially on the intracellular dielectric properties.Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse concernent le développement d’une méthode de caractérisation électrique de cellules biologiques, sans marquage, basée sur la diélectrophorèse Ultra Haute Fréquence (DEP-UHF). Sous l’action d’un champ électrique alternatif non uniforme, les cellules biologiques sont soumises à des forces de déplacement essentiellement liées à leurs propriétés diélectriques. En particulier, aux hautes fréquences, le champ électrique pénètre à l’intérieur de la cellule et interagit donc avec son contenu intracellulaire. Il est donc possible d’accéder à une «signature diélectrophorétique» de la cellule représentative de ses propriétés biologiques internes mais aussi de mécanismes physiologiques tels que l’apoptose ou encore la différenciation. Ce manuscrit présente le développement d’un microsystème innovant, implémenté à partir des couches passives d’une puce BiCMOS et couplé à un réseau microfluidique, pour la caractérisation, à l’échelle cellulaire, par DEP-UHF. Le microsystème développé permet une analyse fine et précise du comportement DEP haute fréquence d’une cellule. Un banc expérimental dédié aux caractérisations cellulaires, capable de générer des signaux hautes fréquences dans la gamme 10 MHz – 1 GHz pour des amplitudes allant jusqu’à 18 Vpp, a été développé. Ces travaux exploratoires ont pour but de démontrer le potentiel de discrimination de cette méthode entre différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines à des stades tumoraux différents, dans l’objectif de développer de nouveaux outils d’aide au diagnostic. L’existence de différences significatives entre les signatures de certains types cellulaires ouvre des perspectives très intéressantes notamment pour le développement d’outils de tri cellulaire originaux basés uniquement sur les propriétés diélectriques intracellulaires

Microcapteurs RF dédiés à la spectroscopie diélectrique de liquides et de particules micrométriques en suspension

National audienc

Conception Et Test De Microsystèmes Pour La Caractérisation Cellulaire Par Diélectrophorèse

National audienc

Analysis of Intracellular Properties of Individual Biological Cells Using Label-Free High Frequency Microfluidic Biosensor

International audienc

Microfluidic Embedded BiCMOS Process for DEP Trapping of Single Cell

International audienc

UHF dielectrophoretic handling of individual biological cells using BiCMOS microfluidic RF-sensors

International audienc

High frequency microfluidic biosensors for intracellular dielectric spectroscopy

International audienceThis paper deals with the development and characterization of a high frequency (HF) label-free microfluidic biosensor for the non-invasive analysis of cell intracellular properties. The presented microfluidic biosensor is based on a band pass filter architecture made of thick gold electrodes designed to ensure a high sensitivity to cells flowing in the microfluidic channel. In a first step, to prove the feasibility of the proposed approach, HF measurements have been successfully achieved on polystyrene beads. Then, combining HF measurements with dielectrophoresis forces, to trap cells in the sensitive area, it has been possible to characterize cell dielectric properties without any denaturation. We demonstrate here the proof of concept of using high frequency impedance spectroscopy to analyze single cells in a microfluidic environment