FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal

Stammzellen sind in der Lage, differenzierende und regenerierende Tochterzellen zu produzieren, wobei das Gleichgewicht zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung strikt kontrolliert werden muss. Jede Störung kann entweder zur Degeneration von Geweben oder zur Entstehung von Tumoren führen. Aus diesem Grund ist es wichtig, jene grundlegenden Mechanismen zu verstehen, welche die Balance zwischen Stammzellregeneration und Differenzierung kontrollieren. Dafür nutzen wir in dieser Studie neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten, aus dem larvalen Nervensystem der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch in eine größere, sich selbst erneuernde Stammzelle und eine kleinere differenzierende Zelle, die Ganglion-Mutterzelle (GMC). Während der Zellteilung akkumulieren Zellschicksaldeterminanten an einer Seite der Stammzelle und werden ausschließlich in die GMC segregiert, wo sie ein Differenzierungsprogramm einleiten. Larvale Neuroblasten sind gut geeignet, um genetische Interaktionen zwischen verschiedenen Proteinen zu untersuchen, allerdings ist nicht viel darüber bekannt, welche spezifischen Proteine in den unterschiedlichen neuronalen Zelltypen exprimiert sind. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode, um eine große Anzahl von Neuroblasten sowie ihre differenzierten neuronalen Tochterzellen mittels Fluorescence-activated cell sorting (FACS) aus larvalen Gehirnen zu isolieren. Wir zeigen mit Hilfe von Immunfluoreszenz sowie Expressionsanalysen, dass die sortierten Zellen die korrekte Identität besitzen und die Zellpopulationen nicht mit anderen neuronalen Zelltypen kontaminiert sind. Desweiteren teilen sich die isolierten Neuroblasten in Kultur entsprechend ihrem Verhalten in vivo asymmetrisch und mit ähnlicher Zellzyklusdauer. Die Transkriptomanalyse von Neuroblasten und Neuronen mittels mRNA Sequenzierung ergibt 28 Transkriptionsfaktoren, die im Vergleich zu Neuronen stark in Neuroblasten exprimiert sind. Diese Transkriptionsfaktoren können in einem Netzwerk angeordnet werden, welches auf deren Co-expression in verschiedenen Drosophila Geweben basiert. Dieses Netzwerk enthält Knotenpunkte mit Genen, die wichtige Prozesse in der Stammzelle steuern, wie den Notch Signaltransduktionsweg, die Kontrolle des Wachstums und Chromatinremodellierung. Die Überexpression dieser Neuroblasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren identifiziert Klumpfuss als bisher unbekannten Regulator für die Selbsterneuerung von Neuroblasten. Klumpfuss ist in primären Typ I und II Neuroblasten sowie in gereiften intermediären Vorläufernervenzellen der Typ II Zelllinie exprimiert. Das Protein kann nicht in den direkten Nachkommen der Typ I und II Neuroblasten, den GMCs sowie unreifen intermediären Vorläufernervenzellen, detektiert werden. Wenn Klumpfuss in unreifen intermediären Vorläufernervenzellen dauerhaft exprimiert bleibt, differenzieren diese Zellen zurück zu Typ II Neuroblasten. Dies hat die Entstehung von Hirntumoren zur Folge, aus denen Teile entnommen und in andere Gewebe der Fliege transplantiert werden können wo sie erneut Tumore bilden. Dieses Phänomen kann nicht beobachtet werden, wenn Klumpfuss weiterhin in GMCs vorhanden bleibt. Ein Verlust von Klumpfuss in Neuroblasten hat den Verlust sowie das Schrumpfen von fast allen Typ II und einigen Typ I Neuroblasten zur Folge. Um herauszufinden, wie die Zellschicksaldeterminanten ein Differenzierungs-programm etablieren, indem sie Stammzellfaktoren wie beispielsweise Klumpfuss herunter regulieren und Differenzierungsfaktoren anschalten, separierten wir Neuroblasten und GMCs zu unterschiedlichen Zeitpunkten ihres Reifungsprozesses mittels FACS. Wir analysierten die Expression der 28 Neuroblasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren in einer Zeitreihe von Neuroblasten, unterschiedlich alten Ganglion-Mutterzellen sowie terminal differenzierten Neuronen. Für einige dieser Transkriptionsfaktoren konnten wir einen Anstieg ihrer Expression in GMCs bereits kurz nach der Zellteilung beobachten, während die Expression bekannter Neuroblastenfaktoren erst um den Zeitpunkt der zweiten Neuroblastenteilung herum stark sinkt. Die Identifizierung der Zielgene der Zellschicksal- und Neuroblastendeterminanten mittels knock down Experimenten wird es uns ermöglichen, ein transkriptionelles Netzwerk zu erstellen, welches helfen kann zu erklären, wie Selbsterhaltung der Neuroblasten sowie Differenzierung in GMCs funktionieren

FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal

Drosophila neuroblasts (NBs) have emerged as a model for stem cell biology that is ideal for genetic analysis but is limited by the lack of cell-type-specific gene expression data. Here, we describe a method for isolating large numbers of pure NBs and differentiating neurons that retain both cell-cycle and lineage characteristics. We determine transcriptional profiles by mRNA sequencing and identify 28 predicted NB-specific transcription factors that can be arranged in a network containing hubs for Notch signaling, growth control, and chromatin regulation. Overexpression and RNA interference for these factors identify Klumpfuss as a regulator of self-renewal. We show that loss of Klumpfuss function causes premature differentiation and that overexpression results in the formation of transplantable brain tumors. Our data represent a valuable resource for investigating Drosophila developmental neurobiology, and the described method can be applied to other invertebrate stem cell lineages as well

Longitudinal monitoring of SARS-CoV-2 spike protein-specific antibody responses in Lower Austria

The Lower Austrian Wachau region was an early COVID-19 hotspot of infection. As previously reported, in June 2020, after the first peak of infections, we determined that 8.5% and 9.0% of the participants in Wei ss enkirchen and surrounding communities in the Wachau region were positive for immunoglobulin G (IgG) and immunoglobulin A (IgA) antibodies against the receptor-binding domain of the spike protein of SARS-CoV-2, respectively. Here, we present novel data obtained eight months later (February 2021) from Wei ss enkirchen, after the second peak of infection, with 25.0% (138/552) and 23.6% (130/552) of participants that are positive for IgG and IgA, respectively. In participants with previous IgG/IgA positivity (June 2020), we observed a 24% reduction in IgG levels, whereas the IgA levels remained stable in February 2021. This subgroup was further analyzed for SARS-CoV-2 induced T cell activities. Although 76% (34/45) and 76% (34/45) of IgG positive and IgA positive participants, respectively, showed specific T cell activities (upon exposure to SARS-CoV-2 spike protein-derived peptides), those were not significantly correlated with the levels of IgG or IgA. Thus, the analyses of antibodies cannot surrogate the measurement of T cell activities. For a comprehensive view on SARS-CoV-2-triggered immune responses, the measurement of different classes of antibodies should be complemented with the determination of T cell activities

The asymmetrically segregating lncRNA cherub is required for transforming stem cells into malignant cells

Tumor cells display features that are not found in healthy cells. How they become immortal and how their specific features can be exploited to combat tumorigenesis are key questions in tumor biology. Here we describe the long non-coding RNA cherub that is critically required for the development of brain tumors in; Drosophila; but is dispensable for normal development. In mitotic; Drosophila; neural stem cells, cherub localizes to the cell periphery and segregates into the differentiating daughter cell. During tumorigenesis, de-differentiation of cherub-high cells leads to the formation of tumorigenic stem cells that accumulate abnormally high cherub levels. We show that cherub establishes a molecular link between the RNA-binding proteins Staufen and Syncrip. As Syncrip is part of the molecular machinery specifying temporal identity in neural stem cells, we propose that tumor cells proliferate indefinitely, because cherub accumulation no longer allows them to complete their temporal neurogenesis program