Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of selected lipases: a procedure for the proper calculation of their recovered activity

In the last few years, synthesis of carrier-free immobilized biocatalysts by cross-linking of enzyme aggregates has appeared as a promising technique. Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) present several interesting advantages over carrier-bound immobilized enzymes, such as highly concentrated enzymatic activity, high stability of the produced superstructure, important production costs savings by the absence of a support, and the fact that no previous purification of the enzyme is needed. However, the published literature evidences that a) much specific non-systematic exploratory work is being done and, b) recovered activity calculations in CLEAs still need to be optimized. In this context, this contribution presents results of an optimized procedure for the calculation of the activity retained by CLEAs, based on the comparison of their specific activity relative to their free enzyme counterparts. The protocol implies determination of precipitable protein content in commercial enzyme preparations through precipitation with ammonium sulphate and a protein co-feeder. The identification of linear ranges of activity versus concentration/amount of protein in the test reaction is also required for proper specific activity determinations. By use of mass balances that involve the protein initially added to the synthesis medium, and the protein remaining in the supernatant and washing solutions (these last derived from activity measurements), the precipitable protein present in CLEAs is obtained, and their specific activity can be calculated. In the current contribution the described protocol was applied to CLEAs of Thermomyces lanuginosa lipase, which showed a recovered specific activity of 11.1% relative to native lipase. The approach described is simple and can easily be extended to other CLEAs and also to carrier-bound immobilized enzymes for accurate determination of their retained activity.Fil: Guauque Torres, María del Pilar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Bahía Blanca. Planta Piloto de Ingeniería Química (i); ArgentinaFil: Foresti, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Tecnologías y Ciencias de la Ingeniería; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Bahía Blanca. Planta Piloto de Ingeniería Química (i); ArgentinaFil: Ferreira, Maria Lujan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Bahía Blanca. Planta Piloto de Ingeniería Química (i); Argentin

Influence of the nature of the support on the catalytic performance of CALB: Experimental and theoretical evidence

The immobilization of the lipase B of Candida antarctica (CALB) was carried out on various hydrophilic and hydrophobic supports through adsorption and covalent bond interactions. The catalytic performance of the biocatalysts was evaluated in the enantioselective esterification of R/S-ibuprofen with ethanol without co-solvents added. The present investigation demonstrates that the biocatalysts based on CALB immobilized by adsorption on hydrophobic supports (acrylic resin, polymethylmethacrylate, polystyrene, epoxy resin and polypropylene) exhibit higher conversion of ibuprofen and enantiomeric excess towards the S-enantiomer than CALB immobilized on hydrophilic materials. Additionally, the enzyme loading is a key factor influencing the conversion of the substrate regardless of the nature of the support material. A high enzyme loading is detrimental to the specific activity of the biocatalysts. Experimental and molecular modeling investigations provided evidence for the influence of water activity in the stereospecificity of the lipase.Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias AplicadasConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnica

Influence of the nature of the support on the catalytic performance of CALB: Experimental and theoretical evidence

The immobilization of the lipase B of Candida antarctica (CALB) was carried out on various hydrophilic and hydrophobic supports through adsorption and covalent bond interactions. The catalytic performance of the biocatalysts was evaluated in the enantioselective esterification of R/S-ibuprofen with ethanol without co-solvents added. The present investigation demonstrates that the biocatalysts based on CALB immobilized by adsorption on hydrophobic supports (acrylic resin, polymethylmethacrylate, polystyrene, epoxy resin and polypropylene) exhibit higher conversion of ibuprofen and enantiomeric excess towards the S-enantiomer than CALB immobilized on hydrophilic materials. Additionally, the enzyme loading is a key factor influencing the conversion of the substrate regardless of the nature of the support material. A high enzyme loading is detrimental to the specific activity of the biocatalysts. Experimental and molecular modeling investigations provided evidence for the influence of water activity in the stereospecificity of the lipase.Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias AplicadasConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnica

Molecular recognition of an acyl–enzyme intermediate on the lipase B from <i>Candida antarctica</i>

This investigation provides evidence of the acyl enzyme species involved in the interaction of R/Sketoprofen with the lipase B from Candida antarctica. The interaction between the profen and the enzyme was studied by in situ time-resolved ATR-FTIR under both static and transient conditions. Particularly, modulation excitation spectroscopy (MES) with phase sensitive detection (PSD) allowed us to univocally distinguish the signals belonging to the interaction between ketoprofen and the enzyme from the strong background signals. These experimental tools coupled with theoretical DFT analysis allowed us to propose various species derived from the interaction of ketoprofen with serine through H bonding (without reaction) and the acyl enzyme species (ester bond formation) which are the intermediates in the biocatalytic assisted esterification and hydrolysis using lipases.Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias AplicadasFacultad de Ciencias Exacta

Light modulates important physiological features of Ralstonia pseudosolanacearum during the colonization of tomato plants

Ralstonia pseudosolanacearum GMI1000 (Rpso GMI1000) is a soil-borne vascular phytopathogen that infects host plants through the root system causing wilting disease in a wide range of agro-economic interest crops, producing economical losses. Several features contribute to the full bacterial virulence. In this work we study the participation of light, an important environmental factor, in the regulation of the physiological attributes and infectivity of Rpso GMI1000. In silico analysis of the Rpso genome revealed the presence of a Rsp0254 gene, which encodes a putative blue light LOV-type photoreceptor. We constructed a mutant strain of Rpso lacking the LOV protein and found that the loss of this protein and light, influenced characteristics involved in the pathogenicity process such as motility, adhesion and the biofilms development, which allows the successful host plant colonization, rendering bacterial wilt. This protein could be involved in the adaptive responses to environmental changes. We demonstrated that light sensing and the LOV protein, would be used as a location signal in the host plant, to regulate the expression of several virulence factors, in a time and tissue dependent way. Consequently, bacteria could use an external signal and Rpsolov gene to know their location within plant tissue during the colonization process.Fil: Tano, María Josefina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ripa, Maria Belén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Tondo, Maria Laura. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Carrau, Analía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Petrocelli, Silvana. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Rodriguez, María Victoria. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Ferreira, Virginia. Universidad de la República. Facultad de Química; UruguayFil: Siri, María Inés. Universidad de la República. Facultad de Química; UruguayFil: Piskulic, Laura. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Orellano, Elena Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Novel o-naphthoquinones induce apoptosis of EL-4 T lymphoma cells through the increase of reactive oxygen species

Novel β-lapachone analogs 2-phenyl-3,4-dihydro-2H-benzo[h]chromene-5,6-dione (NQ1), 2-p-tolyl-3,4-dihydro-2H-benzo[h]chromene-5,6-dione (NQ3) and 2-methyl-2-phenyl-3,4-dihydro-2H-benzo[h]chromene-5,6-dione (NQ7), which have trypanocidal activity, were assayed for cytotoxic effects on murine EL-4 T lymphoma cells. The NQs inhibited the proliferation of EL-4 cells at concentrations above 1 μM. Nuclear staining of the EL-4 cells revealed chromatin condensation and a nuclear morphology compatible with the induction of apoptosis. Flow cytometry assays with annexin V-FITC and propidium iodide confirmed the cell death by apoptosis. Using electron paramagnetic resonance (EPR), a semiquinone radical was detected in EL-4 cells treated with NQs. In addition, a decrease in the GSH level in parallel with reactive oxygen species (ROS) production was observed. Preincubation with n-acetyl-l-cysteine (NAC) was able to reverse the inhibitory effects of the NQs on cell proliferation, indicating that ROS generation is involved in NQ-induced apoptosis. In addition, the NQs induced a decrease in the mitochondrial membrane potential and increased the proteolytic activation of caspases 9 and 3 and the cleavage of Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP). In conclusion, these results indicate that redox cycling is induced by the NQs in the EL-4 cell line, with the generation of ROS and other free radicals that could inhibit cellular proliferation as a result of the induction of the intrinsic apoptosis pathway.Fil: Di Rosso, María Emilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Barreiro Arcos, María Laura. Universidad Catolica Argentina; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Elingold, Igal. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Sterle, Helena Andrea. Pontificia Universidad Católica Argentina "Santa María de Los Buenos Aires"; ArgentinaFil: Ferreira, Sabrina Baptista. Universidade Federal Do Rio de Janeiro; BrasilFil: Ferreira, Vitor Francisco. Universidade Federal Fluminense; BrasilFil: Galleano, Monica Liliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular; ArgentinaFil: Cremaschi, Graciela Alicia. Pontificia Universidad Católica Argentina "Santa María de Los Buenos Aires"; ArgentinaFil: Dubin, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentin

Evaluación nutricional, caracterización de compuestos bioactivos y actividad antioxidante de la pulpa y piel de diferentes variedades de clementinas

Los cítricos y en particular las clementinas son una de las frutas frescas más consumidas en España, aunque también se comercializan como productos de IV Gama. Destacan por la presencia de compuestos bioactivos y funcionales tales como la vitamina C (principalmente como ácido ascórbico, AA), carotenoides y fibra. Su piel, subproducto derivado del procesamiento de estas frutas, presenta aplicaciones industriales tales como la fabricación de piensos, además puede considerarse una importante fuente de componentes bioactivos (tocoferoles y ácidos grasos) de gran interés para su utilización como ingrediente funcional. En el presente trabajo, se ha estudiado tres variedades de clementinas (Basol, Clemenrubí y Clemensoon) recolectadas en dos estadios diferentes de maduración durante la campaña de otoño-invierno de 2013. Determinándose el contenido de nutrientes (hidratos de carbono, proteínas, grasa y minerales), compuestos bioactivos (ácidos orgánicos, vitamina C, tocoferoles, perfil de ácidos grasos) y actividad antioxidante in vitro (ensayo de DPPH, poder reductor e inhibición de la decoloración del β-caroteno) de la pulpa, así como la caracterización en compuestos bioactivos y actividad antioxidante in vitro de la piel. En general, la pulpa destaca por su contenido en fibra total (alrededor de 2g/100g, destacando la fracción soluble), bajo contenido en grasa (inferior al 0.1%) y elevado contenido de vitamina C (102 mg/100 g, en la variedad Basol) principalmente en forma de AA, que aumenta ligeramente con la maduración. Mientras que las pieles pueden considerarse como una buena fuente de tocoferoles (38 mg/100g, en Basol), principalmente α-tocoferol (37.66 mg/ 100g), así como una buena fuente de ácido linoleico (C18:2n6; alrededor del 40%). Tanto la pulpa como la piel presentan buenos resultados de actividad antioxidante total, obtenidos a través del ensayo de poder reductor. Por su parte, la piel también destaca por sus buenos resultados frente al ensayo de inhibición de la peroxidación lipídica

Generation of intra- and interspecific Saccharomyces hybrids with improved oenological and aromatic properties

Non-wine yeasts could enhance the aroma and organoleptic profile of wines. However, compared to wine strains, they have specific intolerances to winemaking conditions. To solve this problem, we generated intra- and interspecific hybrids using a non-GMO technique (rare-mating) in which non-wine strains of S. uvarum, S. kudriavzevii and S. cerevisiae species were crossed with a wine S. cerevisiae yeast. The hybrid that inherited the wine yeast mitochondrial showed better fermentation capacities, whereas hybrids carrying the non-wine strain mitotype reduced ethanol levels and increased glycerol, 2,3-butanediol and organic acid production. Moreover, all the hybrids produced several fruity and floral aromas compared to the wine yeast: β-phenylethyl acetate, isobutyl acetate, γ-octalactone, ethyl cinnamate in both varietal wines. Sc × Sk crosses produced three- to sixfold higher polyfunctional mercaptans, 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP) and 3-mercaptohexanol (3MH). We proposed that the exceptional 3MH release observed in an S. cerevisiae × S. kudriavzevii hybrid was due to the cleavage of the non-volatile glutathione precursor (Glt-3MH) to detoxify the cell from the presence of methylglyoxal, a compound related to the high glycerol yield reached by this hybrid. In conclusion, hybrid generation allows us to obtain aromatically improved yeasts concerning their wine parent. In addition, they reduced ethanol and increased organic acids yields, which counteracts climate change effect on grapes.EEA MendozaFil: Perez, Maria Dolores. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentina.Fil: Perez, Maria Dolores. Consejo Superior de Investigación Científica (CSIC). Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA). Departamento de Biotecnología de los Alimentos, Grupo de Biología de Sistemas en Levaduras de Interés Biotecnológico; EspañaFil: Denat, Marie. Universidad de Zaragoza. Department of Analytical Chemistry. Laboratory for Aroma Analysis and Enology. Instituto Agroalimentario de Aragón; EspañaFil: Pérez-Través, Laura. Consejo Superior de Investigación Científica (CSIC). Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA). Departamento de Biotecnología de los Alimentos, Grupo de Biología de Sistemas en Levaduras de Interés Biotecnológico; EspañaFil: Heras, José María. Lallemand Bio S.L.; EspañaFil: Guillamón, José Manuel. Consejo Superior de Investigación Científica (CSIC). Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA). Departamento de Biotecnología de los Alimentos, Grupo de Biología de Sistemas en Levaduras de Interés Biotecnológico; EspañaFil: Ferreira, Vicente. Universidad de Zaragoza. Department of Analytical Chemistry. Laboratory for Aroma Analysis and Enology. Instituto Agroalimentario de Aragón; EspañaFil: Querol, Amparo. Consejo Superior de Investigación Científica (CSIC). Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA). Departamento de Biotecnología de los Alimentos, Grupo de Biología de Sistemas en Levaduras de Interés Biotecnológico; Españ

Contribución a un futuro sostenible : una dimensión necesaria y posible en toda acción e investigación educativa

El estudio de los errores conceptuales, preconcepciones, concepciones alternativas, etc., ha constituido posiblemente la línea de investigación más desarrollada en didáctica de las ciencias. Miles de artículos publicados lo atestiguan (Duit, 2004). Sin embargo, la inmensa mayoría de estos trabajos se centra en conceptos concretos de los distintos campos de la ciencia y, en cambio, apenas si se ha prestado atención a otras concepciones, tanto del alumnado como del profesorado, con notable influencia en el proceso de enseñanza/ aprendizaje, como las referidas a la naturaleza de la ciencia y, más particularmente, a las relaciones CTSA. Para ver en qué medida este reduccionismo persiste hoy en día hemos procedido a plantear a 50 investigadores en el área de las concepciones alternativas estas dos cuestiones: 1) Cuáles son las preconcepciones cuyo estudio le ha resultado de mayor interés. 2) Qué otras preconcepciones considera que convendría abordar o profundizar. La superación de este reduccionismo nos parece esencial por dos razones: En primer lugar, porque la construcción de la Didáctica de las Ciencias como un cuerpo coherente de conocimientos exige la superación de los tratamientos puntuales y el establecimiento de relaciones entre las diferentes áreas de investigación, integrando los resultados convergentes que se obtienen en las mismas. Y, por otra parte, ello puede contribuir a dar respuesta a la demanda de Naciones Unidas para que toda la educación contribuya a formar ciudadanas y ciudadanos conscientes de la situación de emergencia planetaria y preparados para la toma fundamentada de decisiones. Porque ello exige, entre otras cosas, estudiar las concepciones iniciales en este campo del profesorado y del alumnado y sacar a la luz los posibles obstáculos y los puntos de apoyo. Pero no se trata únicamente de esta línea de investigación: muchas otras permiten incorporar la atención a la situación del mundo como un elemento enriquecedor para lograr una educación científica de calidad y una contribución útil para la educación para la sostenibilidad