Adaption aviärer Influenzaviren vom Subtyp H5N1 an die Maus durch Mutationen in der Viruspolymerase

Die sporadische Übertragung von HPAIV des Subtyps H5N1 vom Vogel auf den Menschen und andere Säugetiere ist nach wie vor mit einer hohen Mortalität verbunden. Die zugrundeliegenden Mechanismen für die besondere Pathogenität dieser Viren im Vergleich zu anderen HPAIV wie zum Beispiel A/FPV/Rostock/34 (H7N1), sind aber bislang kaum geklärt. Ziel dieser Arbeit war es, anhand des humanen H5N1-Isolats A/Thailand/1(Kan-1)/04 die Auswirkung von zwei Mutationen im PB2-Protein der viralen Polymerase auf die Anpassung und gesteigerte Virulenz von HPAIV des Subtyps H5N1 für Säuger eingehender zu untersuchen. 1. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mutationen PB2 D701N und PB2 S714I und PB2 S714R auf ihre Auswirkung auf die Aktivität der viralen Polymerase in Säuger- und Vogelzellen hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die eingeführten Mutationen sowohl allein als auch in Kombination zu einer signifikanten Steigerung der Polymerase-Aktivität führen. 2. Des Weiteren wurden rekombinante Viren erzeugt, die die entsprechenden Mutationen im PB2-Protein einzeln oder in Kombination tragen. 3. Die durchgeführten Studien zum viralen Wachstum in verschiedenen Zellen aus Säugern zeigen, dass die Mutation PB2 D701N eine maßgebliche Rolle bei der viralen Replikation in Säugern spielt. Die Mutationen S714I und S714R dagegen führen nur in Kombination mit der Mutation D701N zu einer weiteren Steigerung der Virusreplikation in Säugern. 4. Für die Mutationen S714I und S714R konnte gezeigt werden, dass sie wirtsunabhängig zu einer Steigerung der Polymerase-Aktivität führen. Diese gesteigerte Aktivität resultiert in aviären Zellen aber nicht in einer gesteigerten Virusreplikation. 5. Zur Überprüfung der Bedeutung der eingeführten Mutationen für die Pathogenität der Viren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Studien in der Maus durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutation D701N auch in der Maus den größten Einfluss auf die Pathogenität der Viren hat. 6. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Mutationen S714I und S714R in Kombination mit der Mutation D701N die Pathogenität der Viren für die Maus weiter steigern können, dass die Einzelpunktmutanten S714I und S714R aber attenuiert sind. 7. Im Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die aviär-typischen Viren unter starkem Selektionsdruck stehen und in Zellkultur zum Erwerb adaptiver Mutationen neigen

Adaption aviärer Influenzaviren vom Subtyp H5N1 an die Maus durch Mutationen in der Viruspolymerase

Die sporadische Übertragung von HPAIV des Subtyps H5N1 vom Vogel auf den Menschen und andere Säugetiere ist nach wie vor mit einer hohen Mortalität verbunden. Die zugrundeliegenden Mechanismen für die besondere Pathogenität dieser Viren im Vergleich zu anderen HPAIV wie zum Beispiel A/FPV/Rostock/34 (H7N1), sind aber bislang kaum geklärt. Ziel dieser Arbeit war es, anhand des humanen H5N1-Isolats A/Thailand/1(Kan-1)/04 die Auswirkung von zwei Mutationen im PB2-Protein der viralen Polymerase auf die Anpassung und gesteigerte Virulenz von HPAIV des Subtyps H5N1 für Säuger eingehender zu untersuchen. 1. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mutationen PB2 D701N und PB2 S714I und PB2 S714R auf ihre Auswirkung auf die Aktivität der viralen Polymerase in Säuger- und Vogelzellen hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die eingeführten Mutationen sowohl allein als auch in Kombination zu einer signifikanten Steigerung der Polymerase-Aktivität führen. 2. Des Weiteren wurden rekombinante Viren erzeugt, die die entsprechenden Mutationen im PB2-Protein einzeln oder in Kombination tragen. 3. Die durchgeführten Studien zum viralen Wachstum in verschiedenen Zellen aus Säugern zeigen, dass die Mutation PB2 D701N eine maßgebliche Rolle bei der viralen Replikation in Säugern spielt. Die Mutationen S714I und S714R dagegen führen nur in Kombination mit der Mutation D701N zu einer weiteren Steigerung der Virusreplikation in Säugern. 4. Für die Mutationen S714I und S714R konnte gezeigt werden, dass sie wirtsunabhängig zu einer Steigerung der Polymerase-Aktivität führen. Diese gesteigerte Aktivität resultiert in aviären Zellen aber nicht in einer gesteigerten Virusreplikation. 5. Zur Überprüfung der Bedeutung der eingeführten Mutationen für die Pathogenität der Viren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Studien in der Maus durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutation D701N auch in der Maus den größten Einfluss auf die Pathogenität der Viren hat. 6. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Mutationen S714I und S714R in Kombination mit der Mutation D701N die Pathogenität der Viren für die Maus weiter steigern können, dass die Einzelpunktmutanten S714I und S714R aber attenuiert sind. 7. Im Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die aviär-typischen Viren unter starkem Selektionsdruck stehen und in Zellkultur zum Erwerb adaptiver Mutationen neigen

The Human Antimicrobial Protein Bactericidal/Permeability-Increasing Protein (BPI) Inhibits the Infectivity of Influenza A Virus

In addition to their well-known antibacterial activity some antimicrobial peptides and proteins (AMPs) display also antiviral effects. A 27 aa peptide from the N-terminal part of human bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) previously shown to harbour antibacterial activity inhibits the infectivity of multiple Influenza A virus strains (H1N1, H3N2 and H5N1) the causing agent of the Influenza pneumonia. In contrast, the homologous murine BPI-peptide did not show activity against Influenza A virus. In addition human BPI-peptide inhibits the activation of immune cells mediated by Influenza A virus. By changing the human BPIpeptide to the sequence of the mouse homologous peptide the antiviral activity was completely abolished. Furthermore, the human BPI-peptide also inhibited the pathogenicity of the Vesicular Stomatitis Virus but failed to interfere with HIV and measles virus. Electron microscopy indicate that the human BPI-peptide interferes with the virus envelope and at high concentrations was able to destroy the particles completely

Mutant human BPI-peptide corresponding to the mouse peptide loose its activity and human BPI peptide inhibits the replication of VSV.

<p>BHK-cells were infected with 360 PFU/well of VSV-GFP virus. Prior to infection the VSV was incubated with 20 μg/mL of human BPI (huBPI) and mouse BPI-peptide (mBPI), respectively or remained untreated (control) for 1 h. After 1.5 h of the cells were overlaid with 1.25% Avicel medium and incubated for 42 h. Thereafter, the cells were fixed and stained with crystal violet for 1 h at 4°C. Finally the plaques were counted (A). MDCK(H) cells were infected with 500 PFU/well Influenza A virus strain A/PR/8/34 (H1N1) for 1 h. Before the infection the virus was incubated in the presence or absence of 20 μg/mL of either human BPI-peptide (huBPI), murine BPI-peptide (mBPI), human BPI-peptide ^N1^D (mutant 1), human BPI-peptide ^K11^M (mutant 2), human BPI-peptide ^N1^D and ^K11^M (mutant 3) or left untreated (control) for 1 h (B) or incubated in the presence or absence of 20 μg/mL of either human BPI-peptide (huBPI), murine BPI-peptide (mBPI), mouse BPI-peptide ^D1^N and ^M11^K (mutant 4) or left untreated (control) for 1 h (C). After the infection the virus containing supernatant was removed and the cells were grown for additional 13 h. Thereafter, the fixed and permeabilized cells were incubated with the mouse anti–nucleoprotein IAV monoclonal antibody. The binding of the antibody was detected by a donkey anti-mouse IgG-HRP antiserum and adding of the reagent TMB Super Sensitive One Component HRP Microwell Substrate. Substrate conversion was detected by 450 nm. One representative experiment out of 3 performed is shown. Statistically significant differences are given as p values (*** <0.001); n.s. is not significant; n = 5 ± SEM.</p

Human BPI-peptide inhibits the activation of PBMCs by Influenza A virus.

<p>Human PBMCs were isolated by dense gradient centrifugation from buffy coats. Thereafter, the cells were seeded and stimulated with purified Influenza A virus (MOI 2) (H1N1) in the presence (black bars) of increasing concentrations and absence (white bar) of human and mouse BPI-peptides (50 μg/mL, (grey bar)), and left unstimulated (control). In addition, the cells were incubated in the presence of either human BPI-peptide (50 μg/mL, huBPI) or mouse BPI-peptide (50 μg/mL, mBPI), respectively. After 20 h the supernatant was collected and the release of IFNα (A) as well as IL-6 (B) was determined by a specific ELISA. One representative experiment out of three is displayed. Statistically significant differences are given as p values (* <0.05 and ** <0.01); n = 3 ± SEM.</p

BPI peptides used.

<p>BPI peptides used.</p

Human BPI-peptide specifically inhibits the replication of different IAV strains.

<p>Protease-deficient MDCK(H) cells were infected with 500 PFU/well of Influenza A virus strain A/PR/8/34 (H1N1) (A) and strain A/Aichi/2/68 (H3N2) (B) for 1 h. After the infection the virus containing supernatant was removed and the cells were grown for additional 13 h. Thereafter, the fixed and permeabilized cells were incubated with the mouse anti–nucleoprotein IAV monoclonal antibody. The binding of the antibody was detected by a donkey anti-mouse IgG-HRP antiserum and adding the reagent TMB Super Sensitive One Component HRP Microwell Substrate. Substrate conversion was detected by 450 nm. For the control sample is n = 8 ± SEM, all other samples n = 5 ± SEM. C) Calu-3 cells were infected with 300 PFU/well of Influenza A virus strain A/Aichi/2/68 (H3N2). Prior to the infection the virus was incubated in the presence or absences of the indicated amount of human or mouse BPI-peptide for 1 h. Thereafter, the virus solution was removed and the cells were incubated for 24 h. The virus amount in the supernatant was analysed by adding an aliquot of the supernatant to MDCK (H) cells for 1 h. After the infection the virus containing supernatant was removed and the cells were grown for additional 13 h. Thereafter, the fixed and permeabilized cells were incubated with the mouse anti–nucleoprotein IAV monoclonal antibody and detected as outlined above. (D) Furthermore, also the release of CCL5 into the supernatant of the infected Calu-3 cells was determined via a specific ELISA. One representative experiment out of 5 performed is displayed. Statistically significant differences are given as p values (** <0.01 and *** <0.001); n.s. is not significant; n = 3 ± SEM.</p

Human BPI-peptide damages the IAV particles.

<p>Virus particles were incubated either with 100 (100) and 500 μg/mL (500) of human (A) or murine BPI-peptides (B) for 1 h or left untreated (C). After the incubation the virus particles were visualized by transmission electron microscopy. Therefore, the particles were negatively stained with 2% uranylacetate and transmission electron microscopy was carried out using a JEOL TEM 2100 at 120kV. Micrographs were recorded with a fast-scan 2k x 2k CCD camera F214. One representative experiment out of 3 performed is displayed.</p