29 research outputs found
Untersuchungen zu einem tumorrelevanten, FGF-bindenden Protein (FGF-BP)
Die nahezu ubiquitÀr vorkommenden
Wachstumsfaktoren FGF-1 und FGF-2 spielen neben ihren
physiologischen Funktionen auch eine wichtige Rolle beim
Wachstum vieler neoplastischer Erkrankungen. Allerdings werden
FGF-1 und FGF-2 nach ihrer Sekretion aus der Zelle in der
extrazellulÀren Matrix immobilisiert und dadurch daran
gehindert, ihre Wirkung durch das Binden an spezifische
extrazellulÀre Rezeptoren zu entfalten.
Ein sekretiertes
Protein, FGF-Bindeprotein (FGF-BP), bindet reversibel und
nicht-kovalent an FGF-1 und FGF-2, löst sie aus der
extrazellulÀren Matrix und ermöglicht ihnen so, mit ihren
Rezeptoren zu interagieren.
Gerade bei neoplastischen
Erkrankungen kommt dieser FGF-BP-vermittelten AktivitÀt von
FGF-1 und FGF-2 eine Schalterfunktion bei der
Wachstumsförderung von Tumoren, auch bedingt durch die
Induktion der Angiogenese, zu. Diese zentrale regulierende
Rolle von FGF-BP in malignen Erkrankungen macht es zu einem
eventuell vielversprechenden therapeutischen bzw.
diagnostischen Ansatzpunkt in der Krebsbehandlung.
Im ersten
Teil dieser Arbeit sollte die biologische AktivitÀt von exogen
zugesetztem rekombinantem FGF-BP auf Tumor- bzw.
Endothel-Zelllinien nÀher definiert werden.
Hierzu wurde
rekombinantes, gereinigtes FGF-BP mittels eines
Baculovirus-Expressions-System in Insektenzellen gewonnen
(Bv-(FGF-BP)), die Suspensionskultur fĂŒr dieses System
etabliert und gezeigt, dass diese der AdhÀsionskultur in Bezug
auf Effizienz und Aufwand ĂŒberlegen ist.
Die parakrine,
FGF-2-abhÀngige BioaktivitÀt des rekombinanten Bv-(FGF-BP)
wurde mittels eines Softagar-Assays mit
SW-13-Nebennieren-Karzinom- und DU-145-Prostata-Karzinom-Zellen
nachgewiesen. Durch den Zusatz von Bv-(FGF-BP) konnte eine
deutliche Steigerung der WachstumsaktivitÀt dieser Tumorzellen
erreicht werden, welche sich durch den Zusatz von
FGF-2-Antikörpern komplett blockieren lieĂ.
Auch das Wachstum
von HUVECs, humanen venösen Nabelschnur-Endothelzellen, konnte
in Proliferations-Assays durch Bv-(FGF-BP) beschleunigt
werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass FGF-BP das Wachstum von
Tumoren auf zwei verschiedene Arten anregt: direkt durch
Stimulation der Tumorzellen und indirekt durch die Förderung
der Blutversorgung des Tumors.
Im zweiten Teil dieser Arbeit
sollten die abnorme Molmasse des vollstÀndigen, rekombinanten
Bv-(FGF-BP) und das Auftreten höhermolekularer kovalenter
FGF-BP-Komplexe, die auch schon in anderen Arbeiten beschrieben
worden waren, untersucht werden.
Nachdem eine mögliche
Glykosilierung als Ursache fĂŒr die zu hohe Molmasse
ausgeschlossen werden konnte, wurden FGF-BP und FGF-2 in
Insektenzellen koexprimiert, um Hinweise auf ein eventuelle
intrazellulÀre Komplexbildung zu erhalten. Trotz erfolgreicher
Koexpression wurde unter den gewÀhlten Bedingungen keine
Komplexbildung beobachtet.
Im dritten Teil gelang es
erstmals, endogen exprimiertes FGF-BP mittels Immunhistochemie
auf Prostata-Karzinom-Schnitten nachzuweisen und zu
quantifizieren. Hierbei wurde bei allen 129 Schnitten von 88
Patienten eine immunhistochemische Reaktion beobachtet.
Die
Ergebnisse dieser Arbeit geben weiteren Aufschluss ĂŒber die
biologische Wirkung von FGF-BP, zeigen seine FGF-2-vermittelte,
duale wachstumssteigernde Wirkung auf Tumoren und beweisen
dessen Expression im Prostatakarzinom. Diese Erkenntnisse
unterstreichen die mögliche Bedeutung dieses Proteins als
therapeutisches ZielmolekĂŒl
The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer
Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefĂ€hrlichsten gynĂ€kologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres VerstĂ€ndnis der genetischen Ănderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2).
FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulĂ€ren Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulĂ€ren FGF-BioaktivitĂ€t spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome ĂŒberexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische FĂ€rbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Ăberexpression von FGF-BP eine bösartige phĂ€notypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann.
Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. AbhĂ€ngig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg ĂŒber ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleĂ€re Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleĂ€rem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleĂ€re Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. ZusĂ€tzlich wurde die AbhĂ€ngigkeit der zellulĂ€ren Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene VerkĂŒrzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass VerkĂŒrzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzellulĂ€re Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, wĂ€hrend bei N-terminalen VerkĂŒrzungsmutanten die nukleĂ€re Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhĂ€ngen. WĂ€hrend in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. AuĂerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen VerkĂŒrzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, wĂ€hrend bei C- und N-terminalen VerkĂŒrzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert.
ZusÀtzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulÀren Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazellulÀre, nukleÀre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhÀngig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende AktivitÀten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen.
HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezĂŒglich der Effekte der HER-2-Ăberexpression auf die zellulĂ€re SensitivitĂ€t von Tumoren gegenĂŒber Chemotherapie sind jedoch widersprĂŒchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten SensitivitĂ€t von Tumoren fĂŒhrt. Dies gilt besonders fĂŒr Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Ăberexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulĂ€ren Resistenz gegenĂŒber Paclitaxel und rViscumin untersucht.
Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren fĂŒhrte zu erhöhter zellulĂ€rer Resistenz gegenĂŒber Paclitaxel. Diese Daten bestĂ€tigten vorherige Ergebnisse bezĂŒglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein âHER-2-Gen-Dosis-Effektâ etabliert, wĂ€hrend Doxorubicin- und Cisplatin-ZytotoxitĂ€ten unverĂ€ndert blieben. Zur nĂ€heren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte VerĂ€nderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhĂ€ngig von der HER-2-Expressions, aber Ă€nderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhĂ€ngig. SchlieĂlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen ĂŒber einen Caspase-unabhĂ€ngigen Weg Apoptose induziert.
Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting fĂŒhrte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der SensitivitĂ€t gegenĂŒber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine âHER-2-Gen-Dosisâ-abhĂ€ngige SensitivitĂ€t der Zellen gegenĂŒber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geĂ€nderte zellulĂ€re rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhĂ€ngiger Weise aktiviert werden. WĂ€hrend keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhĂ€ngige Herunterregulation des antiapoptotischen MolekĂŒls bcl-2.
Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches ZielmolekĂŒl in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezĂŒglich seiner intrazellulĂ€ren Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezĂŒglich der SensitivitĂ€t von Ovarialkarzinomen gegenĂŒber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was fĂŒr die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte
Resistenz von Brust- und Ovarialkarzinom-Zellen gegenĂŒber Chemotherapeutika in AbhĂ€ngigkeit von der Expression des HER-2 neu-Rezeptors
Der HER-2-Rezeptor, ein Tyrosinkinase-Rezeptor aus der ÂEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-Familie, gilt in Brustkarzinomen als wichtiger Marker fĂŒr ein aggressiveres Tumorwachstum, ein erhöhtes Metastasierungs-Potential und eine gesteigerte Chemoresistenz gegenĂŒber verschiedenen Zytostatika. Ovarialkarzinome, in denen sich ebenfalls hĂ€ufig eine Ăberexpression des HER-2-Rezeptors findet, sind sehr schlecht chemotherapeutisch zu behandeln, da sie schnell Resistenzen gegenĂŒber Zytostatika entwickeln. Ăber den Einfluss des HER-2-Rezeptors auf die Chemoresistenz von Ovarialkarzinom-Zellen gibt es widersprĂŒchliche Daten.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der HER-2-Expression auf die Resistenz gegenĂŒber verschiedenen Chemotherapeutika in Brust- und Ovarialkarzinomzellen untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen die Expression des HER-2-Rezeptors mittels Ribozym-Targeting und klonaler Selektion inhibiert, und in MCF-7-Brustkarzinom-Zellen, zur Antagonisierung des HER-2-Rezeptors, eine dominant-negative HER-2-Rezeptormutante (HER-2-ECD) ĂŒberexprimiert.
Es konnte fĂŒr MCF-7-Mammakarzinom-Zellen eine AbhĂ€ngigkeit der SensitivitĂ€t gegenĂŒber Paclitaxel und Topotekan von dem Expressionslevel der HER-2-ECD gezeigt werden. Diese war bei der Behandlung mit Paclitaxel auf VerĂ€nderungen im Zellzyklus zurĂŒckzufĂŒhren. Bei SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen wurde anhand der unterschiedlich stark HER-2-exprimierenden Zellklone eine HER-2-Gendosis-AbhĂ€ngigkeit der Chemoresistenz gegenĂŒber Taxol und Topotekan demonstriert, die sich aber interessanterweise zu der von Mammakarzinom-Zellen gegenlĂ€ufig verhĂ€lt. Als ursĂ€chlich fĂŒr diese AbhĂ€ngigkeit der Chemoresistenz in SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen vom HER-2-Expressionslevel und fĂŒr den gegensĂ€tzlichen Verlauf, im Vergleich zu den Mammakarzinom-Zellen, konnten entscheidende VerĂ€nderungen in Apoptose-Induktion und Zellzyklus bestimmt werden.
Bei der Behandlung der Ovarialkarzinom-Zellen mit Doxorubicin und Cisplatin und der Mammakarzinom-Zellen mit Vinblastin und Cisplatin konnte nachgewiesen werden, dass keinerlei Einfluss der HER-2-Rezeptor-Expression auf die Chemoresistenz gegenĂŒber diesen Zytostatika besteht. Daher wurde weitergehend der Frage nachgegangen, ob eventuell dem Wirkmechanismus des Zytostatikums eine entscheidende Bedeutung bei der HER-2-AbhĂ€ngigkeit der Resistenz zukommt. Hierbei zeigte sich, dass rViscumin, welches sich im Wirkmechansismus völlig von den anderen untersuchten Zytostatika unterscheidet, durch die VerĂ€nderung der HER-2-Expressionslevel deutlich in seiner zytostatischen Potenz auf SKOV3-Ovarialkarzinom-Zellen beeinflusst wurde. Es konnte auch hier die AbhĂ€ngigkeit der Chemoresistenz der Zellen von der HER-2-Expression auf VerĂ€nderungen in der Apoptose-Induktion zurĂŒckgefĂŒhrt werden.
Die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben somit, dass die Chemoresistenz von MCF-7-Mammakarzinom-Zellen und SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen bei einigen Zytostatika von der HER-2-Expression abhĂ€ngig ist. Sie fĂŒhrten aber zu der Schlussfolgerung, dass dies offensichtlich nicht auf alle Zytostatika verallgemeinert werden kann, sondern fĂŒr jedes Zytostatikum individuell und auĂerdem tumorzellspezifisch gesehen werden muss. Dem Wirkmechanismus der Zytostatika kommt, wie diese Ergebnisse hier zeigen, keine entscheidende Bedeutung zu
Dopamine-modulated dynamic cell assemblies generated by the GABAergic striatal microcircuit
The striatum, the principal input structure of the basal ganglia, is crucial to both motor control and learning. It receives convergent input from all over the neocortex, hippocampal formation, amygdala and thalamus, and is the primary recipient of dopamine in the brain. Within the striatum is a GABAergic microcircuit that acts upon these inputs, formed by the dominant medium-spiny projection neurons (MSNs) and fast-spiking interneurons (FSIs). There has been little progress in understanding the computations it performs, hampered by the non-laminar structure that prevents identification of a repeating canonical microcircuit. We here begin the identification of potential dynamically-defined computational elements within the striatum. We construct a new three-dimensional model of the striatal microcircuit's connectivity, and instantiate this with our dopamine-modulated neuron models of the MSNs and FSIs. A new model of gap junctions between the FSIs is introduced and tuned to experimental data. We introduce a novel multiple spike-train analysis method, and apply this to the outputs of the model to find groups of synchronised neurons at multiple time-scales. We find that, with realistic in vivo background input, small assemblies of synchronised MSNs spontaneously appear, consistent with experimental observations, and that the number of assemblies and the time-scale of synchronisation is strongly dependent on the simulated concentration of dopamine. We also show that feed-forward inhibition from the FSIs counter-intuitively increases the firing rate of the MSNs. Such small cell assemblies forming spontaneously only in the absence of dopamine may contribute to motor control problems seen in humans and animals following a loss of dopamine cells. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved
Die Bedeutung der Formine FMNL1, 2 und 3 fĂŒr die InvasivitĂ€t und das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo
Aktinfilamente sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts in Eukaryonten. FĂŒr zahlreiche essentielle zellulĂ€re Prozesse wie die Migration, die AdhĂ€sion, den intrazel-lulĂ€ren Vesikeltransport und die Zytokinese ist der zielgerichtete, rasche Auf- und Abbau von Aktinfilamenten unerlĂ€sslich. Eine wichtige Rolle bei der Assemblierung dieser Filamente spielen Aktinnukleatoren, zu denen unter anderem Formine wie FMNL1-3 zĂ€hlen.
Bei Tumorerkrankungen wie dem malignen Melanom stellt die Metastasierung des PrimĂ€rtumors eine der Haupttodesursachen dar. Dabei ist fĂŒr das Wachstum des Tu-mors und dessen Metastasen neben der InvasionsfĂ€higkeit der Tumorzellen auch ihre FĂ€higkeit, an die extrazellulĂ€re Matrix (EZM) zu binden, von entscheidender Bedeu-tung. Da diese beiden Prozesse durch das Aktinzytoskelett beeinflusst werden, ist die Untersuchung einer diesbezĂŒglichen Formin-AbhĂ€ngigkeit besonders interessant.
Bisherige Untersuchungen konzentrierten sich lediglich auf den Einfluss von FMNL2 auf die InvasivitÀt von Zellen. Daher war es Gegenstand dieser Arbeit, den Einfluss von FMNL1-3 auf die InvasivitÀt und besonders auf das Zellwachstum in humanen Melanomzelllinien zu analysieren.
Anhand von siRNA- oder shRNA-vermittelter Expressionsverminderung von FMNL1-3 in zwei invasiven Melanomzelllinien WM278 und LOX konnte gezeigt werden, dass hauptsÀchlich FMNL2 die InvasivitÀt der Zellen beeinflusst.
Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit in vitro eine deutliche AbhÀngigkeit des AdhÀsions-unabhÀngigen Wachstums der Zellen von FMNL2 und besonders FMNL3 gezeigt werden. In Mausstudien konnten wir zudem einen Einfluss von FMNL2 und FMNL3 auf das Tumorwachstum sowie die Ausbildung von MV3- und LOX-Zell-Tumoren nachweisen.
Weitere Untersuchungen dieser Zellen zeigten ein Defizit im Ablauf des Zellzyklus. Dies Ă€uĂerte sich in einem beeintrĂ€chtigten Ăbergang von der G1- in die S-Phase, was zu einem erhöhten Zell-Anteil in der G1-Phase fĂŒhrte. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Anzahl fokaler AdhĂ€sionen und somit die Interaktion zwischen Zelle und EZM durch FMNL2 und FMNL3 beeinflusst wird. Bei allen Untersuchungen war der Effekt einer kombinierten Runterregulierung von FMNL2 und FMNL3 am stĂ€rksten, was auf eine redundante Funktion dieser beiden Formine hinweist. Um starke Effekte z.B. auf die Proliferation zu erzielen, muss daher eine gewisse Schwellenkonzentration beider FMNLs unterschritten werden. Dies könnte durch die von uns nachgewiesene Hetero-Dimerisierung von FMNL2 und FMNL3 bedingt sein.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass sowohl FMNL2, neben seiner Bedeutung fĂŒr die InvasivitĂ€t von Melanomzellen, als auch FMNL3 eine bedeutende Rolle fĂŒr das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo spielen. Dabei fĂŒhrt vermutlich die reduzierte Anzahl fokaler AdhĂ€sionen nach FMNL2- und/oder FMNL3-Runterregulierung zu einer BeeintrĂ€chtigung des Zellzyklus und somit zu einem verminderten Zellwachstum
Entwicklung eines systematischen Verfahrens zur Untersuchung von indikationsĂŒbergreifenden Signalwegen und ZielmolekĂŒlen fĂŒr pharmazeutische Forschung und Entwicklung
Medikamente, die indikationsĂŒbergreifend zur Therapie von mehreren Krankheiten genutzt werden können, sind meist nicht nur von medizinischem Nutzen fĂŒr die Patienten, sondern auch von wirtschaftlichem Nutzen fĂŒr das entwickelnde Unternehmen. Obwohl immer mehr Wissen ĂŒber biologische Signalwege und funktionelle ZusammenhĂ€nge von ZielmolekĂŒlen verfĂŒgbar ist, ist die Entwicklung dieser indikationsĂŒbergreifenden Medikamente meist von ZufĂ€llen abhĂ€ngig. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Entwicklung eines systematischen Verfahrens zur Identifikation von indikationsĂŒbergreifenden Signalwegen und ZielmolekĂŒlen.
Zu diesem Zweck wurde eine Access-basierte relationale Datenbank aufgebaut, die systematisch und automatisiert Verbindungen von therapeutischen Gebieten und Indikationsgruppen durch indikationsĂŒbergreifende Signalwege und ZielmolekĂŒle untersucht. Eine angeschlossene Priorisierung ermöglicht, konkrete ZielmolekĂŒlkandidaten zu ermitteln, die eine erhöhte Chance fĂŒr indikationsĂŒbergreifende Bedeutung haben. Die Datenbank berĂŒcksichtigt dabei erstmals neben direkten Verbindungen zweier therapeutischer Gebiete durch ein gemeinsames ZielmolekĂŒl auch indirekte Verbindungen ĂŒber Signalwege, die kein gemeinsames ZielmolekĂŒl haben. Mit Hilfe verschiedener Gewichtungsformen können unterschiedlich starke Verbindungen differenziert sowie der Schwerpunkt der Analyse variiert werden.
Im Einzelnen können die folgenden Aspekte untersucht werden:
1. Verbindung von therapeutischen Gebieten durch gemeinsame Signalwege
Der Grad der Verbindung eines therapeutischen Gebiets mit einem anderen kann durch BerĂŒcksichtigung von gemeinsamen Signalwegen und ZielmolekĂŒlen bestimmt werden. Die Verbindungen können entsprechend ihrer biologischen StĂ€rke und ihrer kommerziellen Bedeutung gewichtet werden.
2. Verbindung von Indikationsgruppen durch gemeinsame Signalwege
Innerhalb von bereits bestehenden Forschungsschwerpunkten können Kombinationen von Indikationsgruppen identifiziert werden, die besonders eng miteinander verbunden sind und damit eine hohe Chance fĂŒr indikationsĂŒbergreifende Projekte bieten.
3. Identifikation und Priorisierung von gemeinsamen Signalwegen
Die Datenbank erlaubt es, die wichtigsten Signalwege einer Verbindung von zwei Indikationsgruppen zu identifizieren. Dies ermöglicht die Spezialisierung von Methoden und VersuchsansĂ€tzen auf diejenigen Signalwege, die mit der gröĂten Wahrscheinlichkeit fĂŒr beide Indikationen von Bedeutung sind.
4. Identifikation von möglichen ZielmolekĂŒlkandidaten
Ist bereits eine Ausrichtung auf Indikationsgruppen und Signalwege erfolgt, können alle bereits bekannten indikationsĂŒbergreifenden ZielmolekĂŒle sowie Kandidaten fĂŒr zukĂŒnftig indikationsĂŒbergreifende ZielmolekĂŒle ermittelt werden. Kandidaten fĂŒr zukĂŒnftig indikationsĂŒbergreifende ZielmolekĂŒle werden bisher nur fĂŒr eine der beiden Indikationsgruppen erforscht bzw. genutzt. Aufgrund ihrer Position im Signalweg haben sie aber eine gute Chance, in Zukunft auch fĂŒr die andere Indikationsgruppe von Bedeutung zu sein.
5. Priorisierung von ZielmolekĂŒlkandidaten
Eine Bewertung der ZielmolekĂŒlkandidaten in den vier Bereichen âbiologische Evidenz fĂŒr indikationsĂŒbergreifende Funktionâ, âpharmazeutische Machbarkeitâ, âWettbewerbsintensitĂ€tâ und âstrategische Eignungâ reduziert die Empfehlung von ZielmolekĂŒlkandidaten auf die am besten geeigneten.
Das in dieser Arbeit entwickelte Instrument bietet damit eine neue Möglichkeit, systematisch die Forschung und Entwicklung an indikationsĂŒbergreifenden ZielmolekĂŒlen und Signalwegen zu unterstĂŒtzen. Zur erfolgreichen Entwicklung von indikationsĂŒbergreifenden Medikamenten ist darĂŒber hinaus vor allem intensive Kommunikation und Zusammenarbeit zwischen den einzelnen Forschungs- und Entwicklungsgruppen wichtig
Gentargeting des Onkogens HER-2 und des Wachstumsfaktors VEGF ĂŒber Intronribozyme und Untersuchungen zur HER-2-abhĂ€ngigen Resistenz gegenĂŒber Taxol und Viscumin
Tumorerkrankungen nehmen in den letzten Jahren einen immer gröĂer werdenden Prozentsatz der Krankheiten in unserer Bevölkerung ein. Krebs ist mit circa 25% die zweithĂ€ufigste Todesursache in Deutschland (Statistik des Deutschen Krebsregisters von 2002 â veröffentlicht im FrĂŒhjahr 2006). Umso wichtiger ist die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten.
Der HER-2-Rezeptor ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor, der bei verschiedenen Tumoren als wichtiger Marker fĂŒr ein aggressiveres Tumorwachstum, ein erhöhtes Metastasierungs-Potential und eine gesteigerte Chemoresistenz unter der Therapie mit verschiedenen Zytostatika gilt. Ăber den Einfluss von HER-2 auf die ChemosensitivitĂ€t von Ovarialkarzinomzellen gibt es widersprĂŒchliche Daten. In dieser Promotionsarbeit wurde untersucht, inwiefern sich eine Verringerung des HER-2 Levels in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen auf die Proliferation der Zellen auswirkt und welche Auswirkungen reduzierte HER-2 Level auf die Behandlung mit den Zytostatika Taxol und Viscumin haben. Der HER-2-Rezeptor wurde in SKOV-3 Zellen entweder durch Ribozyme reduziert oder durch den HER-2 Antikörper Herceptin inhibiert. Ribozyme sind katalytische RNA-MolekĂŒle, die durch sequenzspezifische Spaltung der Ziel-RNA zu einer Hemmung der Proteinbiosynthese fĂŒhren.
Es zeigte sich, dass die Proliferation der SKOV-3 Zellen sowohl in AdhĂ€sions- als auch in Softagarkulturen mit einer Verringerung des HER-2 Levels sinkt. Ein additver Effekt zwischen Ribozymen und Herceptin konnte festgestellt werden. Ein reduzierter HER-2 Level bewirkte unter der Behandlung mit Taxol oder Viscumin ĂŒberraschenderweise eine Abnahme - und nicht wie in den meisten Vorstudien eine Zunahme - der ChemosensitivitĂ€t der Zellen. Wurde der HER-2 Level durch kombinierte Therapie mit Ribozymen und Herceptin vermindert, konnte kein additiver Effekt auf die ChemosensitivitĂ€ts-Ănderung beobachtet werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Effizienz von Ribozymen gegen Intronsequenzen der jeweiligen Zielgene untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen die Expression des HER-2-Rezeptors und in U87 Glioblastomzellen die Expression des tumorrelevanten Wachstumsfaktor VEGF inhibiert.
Intronribozyme fĂŒhrten in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen zu einer Verringerung von HER-2, was durch FACS-Analyse und ELISA demonstriert wurde. Gleichfalls konnte die Expression von VEGF in U87 Glioblastomzellen durch Intronribozyme vermindert werden, was durch Daten aus Northern Blot und ELISA belegt wurde. Interessanterweise konnte bei Intronribozymen, deren katalytisches Zentrum durch Mutation inaktiviert worden war, eine Reduktion von VEGF auf Proteinebene, jedoch nicht auf RNA-Ebene, beobachtet werden. Ribozyme gegen Intronsequenzen besitzen somit eine ebenso effektive und prĂ€zise FĂ€higkeit zur Hemmung der Biosynthese eines spezifischen Proteins wie Ribozyme gegen Exonsequenzen, wobei eine zusĂ€tzliche Antisense-Wirkung der Intronribozyme anzunehmen ist.
Die Untersuchungen dieser Promotionsarbeit ergaben, dass Intronribozyme eine spezifische, effektive und vielversprechende Möglichkeit zum Gentargeting darstellen. Zum anderen wurde gezeigt, dass die Proliferation und ChemosensitivitÀt von SKOV-3 Zellen abhÀngig von ihrem HER-2 Level ist und Ribozyme hier Àhnlich effizient sind wie der HER-2 Antikörper Herceptin
Der Einfluss von Ăstrogen auf die Ausbildung eines nukleĂ€ren Aktinnetzwerks in Mammakarzinomzellen
Als essenzieller Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryoten Zellen haben Aktinfilamente Anteil an verschiedensten wichtigen zellulĂ€ren Prozessen. Viele davon beziehen sich auf dynamische Prozesse innerhalb von Zellen (Vesikeltransport) als auch auf die MotilitĂ€t von Zellen an sich (Migration, AdhĂ€sion). Immer hĂ€ufiger wird jedoch noch eine viel weitreichendere Aufgabe von Aktinfilamenten diskutiert: Ihr möglicher Anteil an der Regulation der Genexpression. Bisher gibt es noch keine abschlieĂenden ErklĂ€rungen dafĂŒr, wie genau der dynamische Prozess funktioniert, bei dem sich ĂŒber tausende Basenpaare entfernte Promotoren und Enhancer oder Silencer rĂ€umlich aneinander annĂ€hern. Mehrfach ist beschrieben, dass Aktinfilamente (F-Aktin) hierbei eine maĂgebliche Rolle zu spielen scheinen. Ein entsprechender Nachweis konnte jedoch noch nicht sicher erbracht werden, zumal lange Zeit davon ausgegangen wurde, dass im Zellkern lediglich Aktinmonomere (G-Aktin) vorhanden ist. Seit einigen Jahren ist dieser Umstand jedoch widerlegt, Aktinfilamente konnten im Zellkern von diversen Zelllinien nachgewiesen werden. Hierbei stellte sich nun erneut die Frage, wie diese Aktinfilamente an der Genexpression beteiligt sein und was diese Interaktion beeinflussen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass die bekanntermaĂen mit Ăstrogenrezeptoren ausgestattete humane Mammakarzinomzelllinie MCF-7 nicht nur nukleĂ€re Aktinfilamente aufweist, sondern dass das MaĂ an sich bildenden nukleĂ€ren Aktinfilamenten nach Serumstimulation abhĂ€ngig von einer zuvor applizierten Konzentration an Ăstrogen zu sein scheint. In dieser Arbeit wurde als möglicher ErklĂ€rungsansatz zur vermehrten Bildung von nukleĂ€rem F-Aktin nach Ăstrogenvorbehandlung eine von der Ăstrogenkonzentration abhĂ€ngige verminderte Expression des Proteins Cofilin dargestellt. Ăstrogen fĂŒhrt bei der erwĂ€hnten Zelllinie ĂŒber den Ăstrogenrezeptor ERα bekanntermaĂen zur Proliferation, was auch in dieser Arbeit durch diverse Wachstumsassays bestĂ€tigt werden konnte. Bekannt ist ebenfalls, dass nach Ăstrogenbindung an den ERα dieser als Transkriptionsfaktor fĂŒr diverse Gene tĂ€tig wird. Zu diesen Genen zĂ€hlen unter anderem BRCA1, FOXA1 oder auch TP53. Genannte Gene ĂŒben vielfĂ€ltige EinflĂŒsse auf Zellen aus. In dieser Arbeit wurde untersucht inwieweit nukleĂ€re Aktinfilamente im Zusammenwirken mit Ăstrogen an der Expression von bekanntermaĂen Ăstrogen-responsiven Genen beteiligt sind. Direkt verglichen wurden hierbei mit Ăstrogen vorbehandelte MCF-7 Zellen, wovon die einen eine Wildtyp-Variante des Aktins aufwiesen, wohingegen die anderen eine dysfunktionale Aktinvariante (R62D-Aktin, fehlende Aktinpolymerisierung) exprimierten.In Zusammenschau der gewonnenen prĂ€liminĂ€ren Ergebnisse zeigte sich keine einfache Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen Ăstrogen, nukleĂ€rem F-Aktin und bestimmten Genen. Es eröffneten sich jedoch vielfĂ€ltige neue Fragestellungen hinsichtlich der wohl Ă€uĂerst komplexen Funktion von F-Aktin bei der Expression unterschiedlicher Gene in humanen Tumorzellen, sowie deren Beeinflussung durch Steroidhormonen als Ă€uĂere Faktoren