Untersuchungen zu einem tumorrelevanten, FGF-bindenden Protein (FGF-BP)

Die nahezu ubiquitär vorkommenden Wachstumsfaktoren FGF-1 und FGF-2 spielen neben ihren physiologischen Funktionen auch eine wichtige Rolle beim Wachstum vieler neoplastischer Erkrankungen. Allerdings werden FGF-1 und FGF-2 nach ihrer Sekretion aus der Zelle in der extrazellulären Matrix immobilisiert und dadurch daran gehindert, ihre Wirkung durch das Binden an spezifische extrazelluläre Rezeptoren zu entfalten. Ein sekretiertes Protein, FGF-Bindeprotein (FGF-BP), bindet reversibel und nicht-kovalent an FGF-1 und FGF-2, löst sie aus der extrazellulären Matrix und ermöglicht ihnen so, mit ihren Rezeptoren zu interagieren. Gerade bei neoplastischen Erkrankungen kommt dieser FGF-BP-vermittelten Aktivität von FGF-1 und FGF-2 eine Schalterfunktion bei der Wachstumsförderung von Tumoren, auch bedingt durch die Induktion der Angiogenese, zu. Diese zentrale regulierende Rolle von FGF-BP in malignen Erkrankungen macht es zu einem eventuell vielversprechenden therapeutischen bzw. diagnostischen Ansatzpunkt in der Krebsbehandlung. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die biologische Aktivität von exogen zugesetztem rekombinantem FGF-BP auf Tumor- bzw. Endothel-Zelllinien näher definiert werden. Hierzu wurde rekombinantes, gereinigtes FGF-BP mittels eines Baculovirus-Expressions-System in Insektenzellen gewonnen (Bv-(FGF-BP)), die Suspensionskultur für dieses System etabliert und gezeigt, dass diese der Adhäsionskultur in Bezug auf Effizienz und Aufwand überlegen ist. Die parakrine, FGF-2-abhängige Bioaktivität des rekombinanten Bv-(FGF-BP) wurde mittels eines Softagar-Assays mit SW-13-Nebennieren-Karzinom- und DU-145-Prostata-Karzinom-Zellen nachgewiesen. Durch den Zusatz von Bv-(FGF-BP) konnte eine deutliche Steigerung der Wachstumsaktivität dieser Tumorzellen erreicht werden, welche sich durch den Zusatz von FGF-2-Antikörpern komplett blockieren ließ. Auch das Wachstum von HUVECs, humanen venösen Nabelschnur-Endothelzellen, konnte in Proliferations-Assays durch Bv-(FGF-BP) beschleunigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass FGF-BP das Wachstum von Tumoren auf zwei verschiedene Arten anregt: direkt durch Stimulation der Tumorzellen und indirekt durch die Förderung der Blutversorgung des Tumors. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten die abnorme Molmasse des vollständigen, rekombinanten Bv-(FGF-BP) und das Auftreten höhermolekularer kovalenter FGF-BP-Komplexe, die auch schon in anderen Arbeiten beschrieben worden waren, untersucht werden. Nachdem eine mögliche Glykosilierung als Ursache für die zu hohe Molmasse ausgeschlossen werden konnte, wurden FGF-BP und FGF-2 in Insektenzellen koexprimiert, um Hinweise auf ein eventuelle intrazelluläre Komplexbildung zu erhalten. Trotz erfolgreicher Koexpression wurde unter den gewählten Bedingungen keine Komplexbildung beobachtet. Im dritten Teil gelang es erstmals, endogen exprimiertes FGF-BP mittels Immunhistochemie auf Prostata-Karzinom-Schnitten nachzuweisen und zu quantifizieren. Hierbei wurde bei allen 129 Schnitten von 88 Patienten eine immunhistochemische Reaktion beobachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben weiteren Aufschluss über die biologische Wirkung von FGF-BP, zeigen seine FGF-2-vermittelte, duale wachstumssteigernde Wirkung auf Tumoren und beweisen dessen Expression im Prostatakarzinom. Diese Erkenntnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung dieses Proteins als therapeutisches Zielmolekül

The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer

Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2). FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulären Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulären FGF-Bioaktivität spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome überexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische Färbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Überexpression von FGF-BP eine bösartige phänotypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann. Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Abhängig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg über ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleäre Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleärem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleäre Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene Verkürzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass Verkürzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzelluläre Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, während bei N-terminalen Verkürzungsmutanten die nukleäre Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhängen. Während in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. Außerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen Verkürzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, während bei C- und N-terminalen Verkürzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert. Zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulären Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazelluläre, nukleäre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhängig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende Aktivitäten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen. HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezüglich der Effekte der HER-2-Überexpression auf die zelluläre Sensitivität von Tumoren gegenüber Chemotherapie sind jedoch widersprüchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten Sensitivität von Tumoren führt. Dies gilt besonders für Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Überexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulären Resistenz gegenüber Paclitaxel und rViscumin untersucht. Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren führte zu erhöhter zellulärer Resistenz gegenüber Paclitaxel. Diese Daten bestätigten vorherige Ergebnisse bezüglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein „HER-2-Gen-Dosis-Effekt“ etabliert, während Doxorubicin- und Cisplatin-Zytotoxitäten unverändert blieben. Zur näheren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte Veränderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhängig von der HER-2-Expressions, aber änderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhängig. Schließlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen über einen Caspase-unabhängigen Weg Apoptose induziert. Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting führte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der Sensitivität gegenüber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine „HER-2-Gen-Dosis“-abhängige Sensitivität der Zellen gegenüber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geänderte zelluläre rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhängiger Weise aktiviert werden. Während keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhängige Herunterregulation des antiapoptotischen Moleküls bcl-2. Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches Zielmolekül in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezüglich seiner intrazellulären Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezüglich der Sensitivität von Ovarialkarzinomen gegenüber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte

Resistenz von Brust- und Ovarialkarzinom-Zellen gegenüber Chemotherapeutika in Abhängigkeit von der Expression des HER-2 neu-Rezeptors

Der HER-2-Rezeptor, ein Tyrosinkinase-Rezeptor aus der ”Epidermal Growth Factor Receptor” (EGFR)-Familie, gilt in Brustkarzinomen als wichtiger Marker für ein aggressiveres Tumorwachstum, ein erhöhtes Metastasierungs-Potential und eine gesteigerte Chemoresistenz gegenüber verschiedenen Zytostatika. Ovarialkarzinome, in denen sich ebenfalls häufig eine Überexpression des HER-2-Rezeptors findet, sind sehr schlecht chemotherapeutisch zu behandeln, da sie schnell Resistenzen gegenüber Zytostatika entwickeln. Über den Einfluss des HER-2-Rezeptors auf die Chemoresistenz von Ovarialkarzinom-Zellen gibt es widersprüchliche Daten. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der HER-2-Expression auf die Resistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika in Brust- und Ovarialkarzinomzellen untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen die Expression des HER-2-Rezeptors mittels Ribozym-Targeting und klonaler Selektion inhibiert, und in MCF-7-Brustkarzinom-Zellen, zur Antagonisierung des HER-2-Rezeptors, eine dominant-negative HER-2-Rezeptormutante (HER-2-ECD) überexprimiert. Es konnte für MCF-7-Mammakarzinom-Zellen eine Abhängigkeit der Sensitivität gegenüber Paclitaxel und Topotekan von dem Expressionslevel der HER-2-ECD gezeigt werden. Diese war bei der Behandlung mit Paclitaxel auf Veränderungen im Zellzyklus zurückzuführen. Bei SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen wurde anhand der unterschiedlich stark HER-2-exprimierenden Zellklone eine HER-2-Gendosis-Abhängigkeit der Chemoresistenz gegenüber Taxol und Topotekan demonstriert, die sich aber interessanterweise zu der von Mammakarzinom-Zellen gegenläufig verhält. Als ursächlich für diese Abhängigkeit der Chemoresistenz in SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen vom HER-2-Expressionslevel und für den gegensätzlichen Verlauf, im Vergleich zu den Mammakarzinom-Zellen, konnten entscheidende Veränderungen in Apoptose-Induktion und Zellzyklus bestimmt werden. Bei der Behandlung der Ovarialkarzinom-Zellen mit Doxorubicin und Cisplatin und der Mammakarzinom-Zellen mit Vinblastin und Cisplatin konnte nachgewiesen werden, dass keinerlei Einfluss der HER-2-Rezeptor-Expression auf die Chemoresistenz gegenüber diesen Zytostatika besteht. Daher wurde weitergehend der Frage nachgegangen, ob eventuell dem Wirkmechanismus des Zytostatikums eine entscheidende Bedeutung bei der HER-2-Abhängigkeit der Resistenz zukommt. Hierbei zeigte sich, dass rViscumin, welches sich im Wirkmechansismus völlig von den anderen untersuchten Zytostatika unterscheidet, durch die Veränderung der HER-2-Expressionslevel deutlich in seiner zytostatischen Potenz auf SKOV3-Ovarialkarzinom-Zellen beeinflusst wurde. Es konnte auch hier die Abhängigkeit der Chemoresistenz der Zellen von der HER-2-Expression auf Veränderungen in der Apoptose-Induktion zurückgeführt werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben somit, dass die Chemoresistenz von MCF-7-Mammakarzinom-Zellen und SKOV-3-Ovarialkarzinom-Zellen bei einigen Zytostatika von der HER-2-Expression abhängig ist. Sie führten aber zu der Schlussfolgerung, dass dies offensichtlich nicht auf alle Zytostatika verallgemeinert werden kann, sondern für jedes Zytostatikum individuell und außerdem tumorzellspezifisch gesehen werden muss. Dem Wirkmechanismus der Zytostatika kommt, wie diese Ergebnisse hier zeigen, keine entscheidende Bedeutung zu

Dopamine-modulated dynamic cell assemblies generated by the GABAergic striatal microcircuit

The striatum, the principal input structure of the basal ganglia, is crucial to both motor control and learning. It receives convergent input from all over the neocortex, hippocampal formation, amygdala and thalamus, and is the primary recipient of dopamine in the brain. Within the striatum is a GABAergic microcircuit that acts upon these inputs, formed by the dominant medium-spiny projection neurons (MSNs) and fast-spiking interneurons (FSIs). There has been little progress in understanding the computations it performs, hampered by the non-laminar structure that prevents identification of a repeating canonical microcircuit. We here begin the identification of potential dynamically-defined computational elements within the striatum. We construct a new three-dimensional model of the striatal microcircuit's connectivity, and instantiate this with our dopamine-modulated neuron models of the MSNs and FSIs. A new model of gap junctions between the FSIs is introduced and tuned to experimental data. We introduce a novel multiple spike-train analysis method, and apply this to the outputs of the model to find groups of synchronised neurons at multiple time-scales. We find that, with realistic in vivo background input, small assemblies of synchronised MSNs spontaneously appear, consistent with experimental observations, and that the number of assemblies and the time-scale of synchronisation is strongly dependent on the simulated concentration of dopamine. We also show that feed-forward inhibition from the FSIs counter-intuitively increases the firing rate of the MSNs. Such small cell assemblies forming spontaneously only in the absence of dopamine may contribute to motor control problems seen in humans and animals following a loss of dopamine cells. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved

Entwicklung eines systematischen Verfahrens zur Untersuchung von indikationsübergreifenden Signalwegen und Zielmolekülen für pharmazeutische Forschung und Entwicklung

Medikamente, die indikationsübergreifend zur Therapie von mehreren Krankheiten genutzt werden können, sind meist nicht nur von medizinischem Nutzen für die Patienten, sondern auch von wirtschaftlichem Nutzen für das entwickelnde Unternehmen. Obwohl immer mehr Wissen über biologische Signalwege und funktionelle Zusammenhänge von Zielmolekülen verfügbar ist, ist die Entwicklung dieser indikationsübergreifenden Medikamente meist von Zufällen abhängig. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Entwicklung eines systematischen Verfahrens zur Identifikation von indikationsübergreifenden Signalwegen und Zielmolekülen. Zu diesem Zweck wurde eine Access-basierte relationale Datenbank aufgebaut, die systematisch und automatisiert Verbindungen von therapeutischen Gebieten und Indikationsgruppen durch indikationsübergreifende Signalwege und Zielmoleküle untersucht. Eine angeschlossene Priorisierung ermöglicht, konkrete Zielmolekülkandidaten zu ermitteln, die eine erhöhte Chance für indikationsübergreifende Bedeutung haben. Die Datenbank berücksichtigt dabei erstmals neben direkten Verbindungen zweier therapeutischer Gebiete durch ein gemeinsames Zielmolekül auch indirekte Verbindungen über Signalwege, die kein gemeinsames Zielmolekül haben. Mit Hilfe verschiedener Gewichtungsformen können unterschiedlich starke Verbindungen differenziert sowie der Schwerpunkt der Analyse variiert werden. Im Einzelnen können die folgenden Aspekte untersucht werden: 1. Verbindung von therapeutischen Gebieten durch gemeinsame Signalwege Der Grad der Verbindung eines therapeutischen Gebiets mit einem anderen kann durch Berücksichtigung von gemeinsamen Signalwegen und Zielmolekülen bestimmt werden. Die Verbindungen können entsprechend ihrer biologischen Stärke und ihrer kommerziellen Bedeutung gewichtet werden. 2. Verbindung von Indikationsgruppen durch gemeinsame Signalwege Innerhalb von bereits bestehenden Forschungsschwerpunkten können Kombinationen von Indikationsgruppen identifiziert werden, die besonders eng miteinander verbunden sind und damit eine hohe Chance für indikationsübergreifende Projekte bieten. 3. Identifikation und Priorisierung von gemeinsamen Signalwegen Die Datenbank erlaubt es, die wichtigsten Signalwege einer Verbindung von zwei Indikationsgruppen zu identifizieren. Dies ermöglicht die Spezialisierung von Methoden und Versuchsansätzen auf diejenigen Signalwege, die mit der größten Wahrscheinlichkeit für beide Indikationen von Bedeutung sind. 4. Identifikation von möglichen Zielmolekülkandidaten Ist bereits eine Ausrichtung auf Indikationsgruppen und Signalwege erfolgt, können alle bereits bekannten indikationsübergreifenden Zielmoleküle sowie Kandidaten für zukünftig indikationsübergreifende Zielmoleküle ermittelt werden. Kandidaten für zukünftig indikationsübergreifende Zielmoleküle werden bisher nur für eine der beiden Indikationsgruppen erforscht bzw. genutzt. Aufgrund ihrer Position im Signalweg haben sie aber eine gute Chance, in Zukunft auch für die andere Indikationsgruppe von Bedeutung zu sein. 5. Priorisierung von Zielmolekülkandidaten Eine Bewertung der Zielmolekülkandidaten in den vier Bereichen „biologische Evidenz für indikationsübergreifende Funktion“, „pharmazeutische Machbarkeit“, „Wettbewerbsintensität“ und „strategische Eignung“ reduziert die Empfehlung von Zielmolekülkandidaten auf die am besten geeigneten. Das in dieser Arbeit entwickelte Instrument bietet damit eine neue Möglichkeit, systematisch die Forschung und Entwicklung an indikationsübergreifenden Zielmolekülen und Signalwegen zu unterstützen. Zur erfolgreichen Entwicklung von indikationsübergreifenden Medikamenten ist darüber hinaus vor allem intensive Kommunikation und Zusammenarbeit zwischen den einzelnen Forschungs- und Entwicklungsgruppen wichtig

Die Bedeutung der Formine FMNL1, 2 und 3 für die Invasivität und das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo

Aktinfilamente sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts in Eukaryonten. Für zahlreiche essentielle zelluläre Prozesse wie die Migration, die Adhäsion, den intrazel-lulären Vesikeltransport und die Zytokinese ist der zielgerichtete, rasche Auf- und Abbau von Aktinfilamenten unerlässlich. Eine wichtige Rolle bei der Assemblierung dieser Filamente spielen Aktinnukleatoren, zu denen unter anderem Formine wie FMNL1-3 zählen. Bei Tumorerkrankungen wie dem malignen Melanom stellt die Metastasierung des Primärtumors eine der Haupttodesursachen dar. Dabei ist für das Wachstum des Tu-mors und dessen Metastasen neben der Invasionsfähigkeit der Tumorzellen auch ihre Fähigkeit, an die extrazelluläre Matrix (EZM) zu binden, von entscheidender Bedeu-tung. Da diese beiden Prozesse durch das Aktinzytoskelett beeinflusst werden, ist die Untersuchung einer diesbezüglichen Formin-Abhängigkeit besonders interessant. Bisherige Untersuchungen konzentrierten sich lediglich auf den Einfluss von FMNL2 auf die Invasivität von Zellen. Daher war es Gegenstand dieser Arbeit, den Einfluss von FMNL1-3 auf die Invasivität und besonders auf das Zellwachstum in humanen Melanomzelllinien zu analysieren. Anhand von siRNA- oder shRNA-vermittelter Expressionsverminderung von FMNL1-3 in zwei invasiven Melanomzelllinien WM278 und LOX konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich FMNL2 die Invasivität der Zellen beeinflusst. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit in vitro eine deutliche Abhängigkeit des Adhäsions-unabhängigen Wachstums der Zellen von FMNL2 und besonders FMNL3 gezeigt werden. In Mausstudien konnten wir zudem einen Einfluss von FMNL2 und FMNL3 auf das Tumorwachstum sowie die Ausbildung von MV3- und LOX-Zell-Tumoren nachweisen. Weitere Untersuchungen dieser Zellen zeigten ein Defizit im Ablauf des Zellzyklus. Dies äußerte sich in einem beeinträchtigten Übergang von der G1- in die S-Phase, was zu einem erhöhten Zell-Anteil in der G1-Phase führte. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Anzahl fokaler Adhäsionen und somit die Interaktion zwischen Zelle und EZM durch FMNL2 und FMNL3 beeinflusst wird. Bei allen Untersuchungen war der Effekt einer kombinierten Runterregulierung von FMNL2 und FMNL3 am stärksten, was auf eine redundante Funktion dieser beiden Formine hinweist. Um starke Effekte z.B. auf die Proliferation zu erzielen, muss daher eine gewisse Schwellenkonzentration beider FMNLs unterschritten werden. Dies könnte durch die von uns nachgewiesene Hetero-Dimerisierung von FMNL2 und FMNL3 bedingt sein. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass sowohl FMNL2, neben seiner Bedeutung für die Invasivität von Melanomzellen, als auch FMNL3 eine bedeutende Rolle für das Wachstum von Melanomzellen in vitro und in vivo spielen. Dabei führt vermutlich die reduzierte Anzahl fokaler Adhäsionen nach FMNL2- und/oder FMNL3-Runterregulierung zu einer Beeinträchtigung des Zellzyklus und somit zu einem verminderten Zellwachstum

Gentargeting des Onkogens HER-2 und des Wachstumsfaktors VEGF über Intronribozyme und Untersuchungen zur HER-2-abhängigen Resistenz gegenüber Taxol und Viscumin

Tumorerkrankungen nehmen in den letzten Jahren einen immer größer werdenden Prozentsatz der Krankheiten in unserer Bevölkerung ein. Krebs ist mit circa 25% die zweithäufigste Todesursache in Deutschland (Statistik des Deutschen Krebsregisters von 2002 – veröffentlicht im Frühjahr 2006). Umso wichtiger ist die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten. Der HER-2-Rezeptor ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor, der bei verschiedenen Tumoren als wichtiger Marker für ein aggressiveres Tumorwachstum, ein erhöhtes Metastasierungs-Potential und eine gesteigerte Chemoresistenz unter der Therapie mit verschiedenen Zytostatika gilt. Über den Einfluss von HER-2 auf die Chemosensitivität von Ovarialkarzinomzellen gibt es widersprüchliche Daten. In dieser Promotionsarbeit wurde untersucht, inwiefern sich eine Verringerung des HER-2 Levels in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen auf die Proliferation der Zellen auswirkt und welche Auswirkungen reduzierte HER-2 Level auf die Behandlung mit den Zytostatika Taxol und Viscumin haben. Der HER-2-Rezeptor wurde in SKOV-3 Zellen entweder durch Ribozyme reduziert oder durch den HER-2 Antikörper Herceptin inhibiert. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, die durch sequenzspezifische Spaltung der Ziel-RNA zu einer Hemmung der Proteinbiosynthese führen. Es zeigte sich, dass die Proliferation der SKOV-3 Zellen sowohl in Adhäsions- als auch in Softagarkulturen mit einer Verringerung des HER-2 Levels sinkt. Ein additver Effekt zwischen Ribozymen und Herceptin konnte festgestellt werden. Ein reduzierter HER-2 Level bewirkte unter der Behandlung mit Taxol oder Viscumin überraschenderweise eine Abnahme - und nicht wie in den meisten Vorstudien eine Zunahme - der Chemosensitivität der Zellen. Wurde der HER-2 Level durch kombinierte Therapie mit Ribozymen und Herceptin vermindert, konnte kein additiver Effekt auf die Chemosensitivitäts-Änderung beobachtet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Effizienz von Ribozymen gegen Intronsequenzen der jeweiligen Zielgene untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen die Expression des HER-2-Rezeptors und in U87 Glioblastomzellen die Expression des tumorrelevanten Wachstumsfaktor VEGF inhibiert. Intronribozyme führten in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen zu einer Verringerung von HER-2, was durch FACS-Analyse und ELISA demonstriert wurde. Gleichfalls konnte die Expression von VEGF in U87 Glioblastomzellen durch Intronribozyme vermindert werden, was durch Daten aus Northern Blot und ELISA belegt wurde. Interessanterweise konnte bei Intronribozymen, deren katalytisches Zentrum durch Mutation inaktiviert worden war, eine Reduktion von VEGF auf Proteinebene, jedoch nicht auf RNA-Ebene, beobachtet werden. Ribozyme gegen Intronsequenzen besitzen somit eine ebenso effektive und präzise Fähigkeit zur Hemmung der Biosynthese eines spezifischen Proteins wie Ribozyme gegen Exonsequenzen, wobei eine zusätzliche Antisense-Wirkung der Intronribozyme anzunehmen ist. Die Untersuchungen dieser Promotionsarbeit ergaben, dass Intronribozyme eine spezifische, effektive und vielversprechende Möglichkeit zum Gentargeting darstellen. Zum anderen wurde gezeigt, dass die Proliferation und Chemosensitivität von SKOV-3 Zellen abhängig von ihrem HER-2 Level ist und Ribozyme hier ähnlich effizient sind wie der HER-2 Antikörper Herceptin

Der Einfluss von Östrogen auf die Ausbildung eines nukleären Aktinnetzwerks in Mammakarzinomzellen

Als essenzieller Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryoten Zellen haben Aktinfilamente Anteil an verschiedensten wichtigen zellulären Prozessen. Viele davon beziehen sich auf dynamische Prozesse innerhalb von Zellen (Vesikeltransport) als auch auf die Motilität von Zellen an sich (Migration, Adhäsion). Immer häufiger wird jedoch noch eine viel weitreichendere Aufgabe von Aktinfilamenten diskutiert: Ihr möglicher Anteil an der Regulation der Genexpression. Bisher gibt es noch keine abschließenden Erklärungen dafür, wie genau der dynamische Prozess funktioniert, bei dem sich über tausende Basenpaare entfernte Promotoren und Enhancer oder Silencer räumlich aneinander annähern. Mehrfach ist beschrieben, dass Aktinfilamente (F-Aktin) hierbei eine maßgebliche Rolle zu spielen scheinen. Ein entsprechender Nachweis konnte jedoch noch nicht sicher erbracht werden, zumal lange Zeit davon ausgegangen wurde, dass im Zellkern lediglich Aktinmonomere (G-Aktin) vorhanden ist. Seit einigen Jahren ist dieser Umstand jedoch widerlegt, Aktinfilamente konnten im Zellkern von diversen Zelllinien nachgewiesen werden. Hierbei stellte sich nun erneut die Frage, wie diese Aktinfilamente an der Genexpression beteiligt sein und was diese Interaktion beeinflussen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass die bekanntermaßen mit Östrogenrezeptoren ausgestattete humane Mammakarzinomzelllinie MCF-7 nicht nur nukleäre Aktinfilamente aufweist, sondern dass das Maß an sich bildenden nukleären Aktinfilamenten nach Serumstimulation abhängig von einer zuvor applizierten Konzentration an Östrogen zu sein scheint. In dieser Arbeit wurde als möglicher Erklärungsansatz zur vermehrten Bildung von nukleärem F-Aktin nach Östrogenvorbehandlung eine von der Östrogenkonzentration abhängige verminderte Expression des Proteins Cofilin dargestellt. Östrogen führt bei der erwähnten Zelllinie über den Östrogenrezeptor ERα bekanntermaßen zur Proliferation, was auch in dieser Arbeit durch diverse Wachstumsassays bestätigt werden konnte. Bekannt ist ebenfalls, dass nach Östrogenbindung an den ERα dieser als Transkriptionsfaktor für diverse Gene tätig wird. Zu diesen Genen zählen unter anderem BRCA1, FOXA1 oder auch TP53. Genannte Gene üben vielfältige Einflüsse auf Zellen aus. In dieser Arbeit wurde untersucht inwieweit nukleäre Aktinfilamente im Zusammenwirken mit Östrogen an der Expression von bekanntermaßen Östrogen-responsiven Genen beteiligt sind. Direkt verglichen wurden hierbei mit Östrogen vorbehandelte MCF-7 Zellen, wovon die einen eine Wildtyp-Variante des Aktins aufwiesen, wohingegen die anderen eine dysfunktionale Aktinvariante (R62D-Aktin, fehlende Aktinpolymerisierung) exprimierten.In Zusammenschau der gewonnenen präliminären Ergebnisse zeigte sich keine einfache Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen Östrogen, nukleärem F-Aktin und bestimmten Genen. Es eröffneten sich jedoch vielfältige neue Fragestellungen hinsichtlich der wohl äußerst komplexen Funktion von F-Aktin bei der Expression unterschiedlicher Gene in humanen Tumorzellen, sowie deren Beeinflussung durch Steroidhormonen als äußere Faktoren