Analogues of the antimicrobial peptide BP214

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017The excessive and uncontrolled use of antibiotics over the last decades has contributed strongly to the increase in the number of resistant microorganisms and with this, the increase in the number of deaths due to intractable infections and an increase of the Healthcare expenditure. For economic and regulatory reasons, the development of new antibiotics has also decreased significantly. Thus, the search for new therapeutic alternatives to conventional antibiotics led researchers to focus on the study of antimicrobial peptides. In addition to antimicrobial activity, these peptides have the ability to exhibit antibiofilm, immunomodulatory and anticancer activities. Recently a previous study reported BP214 peptide, an analogue of the cecropin-α-melittin hybrid BP100, which showed a high antimicrobial potential against colistin-resistant Acinetobacter baumannii strains and other relevant bacterial agents and a relatively low hemolytic activity. In order to identify the most important amino acids for BP214 activity, a D-Alanine scan was performed. Thus, eleven new analogues of the BP214 peptide were synthesized through the solid-phase peptide synthesis. Subsequently, the synthesized peptides were analysed and purified using MALDI-TOF mass spectrometry and reversed-phase HPLC. Finally, its antimicrobial and hemolytic activities were determined. In the analogues where a single lysine or arginine was replaced by alanine, an improvement in antimicrobial activity against most bacterial strains was verified. On the other hand, with the substitution of a single leucine, isoleucine, phenylalanine or tyrosine, the analogues showed a reduced antimicrobial potential compared to BP214. In addition, all analogues which showed antimicrobial activities as good or better than the BP214 peptide also showed higher hemolytic toxicities. From the information obtained with reversed-phase HPLC, it was still possible to relate the retention time of each peptide to its hydrophobic character. Thus, the influence of the hydrophobicity on antimicrobial and hemolytic activities and consequently on cell selectivity was ascertained. All analogues that showed a superior hydrophobic character to BP214 were also those that showed superior antimicrobial and hemolytic activities. Before presenting the results, a detailed procedure of all the methods performed was also included in this dissertation.O uso excessivo e descontrolado de antibióticos nas últimas décadas tem contribuído fortemente para o aumento do número de microrganismos resistentes e com isto, o aumento do número de mortes por infeções intratáveis e um aumento nas despesas para a saúde. Por questões económicas e regulamentares, o desenvolvimento de novos antibióticos tem também diminuído significativamente. Assim, a procura de novas alternativas terapêuticas aos antibióticos convencionais levou investigadores a focarem-se no estudo dos péptidos antimicrobianos. Os péptidos antimicrobianos são pequenas moléculas anfipáticas e catiónicas com elevada seletividade e especificidade, que existem naturalmente nos seres vivos e que contribuem para a defesa imunitária dos mesmos. Como a superfície das células bacterianas é carregada negativamente, os péptidos antimicrobianos, com carga positiva, são atraídos electrostaticamente, provocando a disrupção da membrana bacteriana e, assim, a morte celular. Atualmente, inúmeros péptidos antimicrobianos já foram identificados e alguns mesmo já se encontram aprovados como fármacos. Para além da atividade antimicrobiana, estes péptidos têm a capacidade de exibir atividades antibiofilme, imunomodulatória e anticancerígena. Contudo, a baixa biodisponibilidade, o curto tempo de semivida, a dificuldade na purificação e a toxicidade hemolítica que apresentam tornam essencial a síntese para a otimização destas estruturas. Recentemente foi reportado o péptido BP214 (kklfkkilryl-NH2), um análogo do híbrido cecropina-α-melitina BP100 (KKLFKKILKYL-NH2), que mostrou um elevado potencial antimicrobiano contra estirpes de Acinetobacter baumannii resistentes à colistina e outros agentes bacterianos relevantes, para além de uma atividade hemolítica relativamente reduzida na presença de altas concentrações de péptido. Com o objetivo de identificar quais os aminoácidos mais importantes para a atividade do BP214, procedeu-se à realização de um scan de D-Alanina, ou seja, à substituição de cada um dos aminoácidos da sequência peptídica do BP214 pelo aminoácido D-Alanina. Assim, através da síntese de péptidos em fase sólida, foi então possível sintetizar onze novos análogos do péptido BP214. A síntese em fase sólida é o método de escolha na síntese de péptidos, em particular a estratégia Fmoc/tBu, a mesma estratégia utilizada no presente estudo. Nesta síntese em fase sólida, um primeiro aminoácido, protegido pelo grupo Fmoc no grupo α-amina, é acoplado através do resíduo C-terminal a um suporte sólido polimérico, a resina. De seguida, a desproteção da amina permite o ataque nucleofílico deste grupo ao ácido carboxílico do segundo aminoácido, com a formação de uma ligação amida. O grupo Fmoc é lábil a bases, por isso é removido através do tratamento com piperidina, uma base forte. Este ciclo repete-se até que todo o péptido desejado seja obtido. Os péptidos sintetizados neste trabalho foram posteriormente analisados e purificados usando o HPLC em fase-reversa, de modo a obter uma purificação de pelo menos 95%. E, de forma a identificar e determinar a massa molecular dos mesmos, foi utilizada a espectrometria de massa MALDI-TOF. Em anexo, são apresentados os respetivos cromatogramas e espectros. Por fim, as suas atividades antimicrobiana e hemolítica foram determinadas. A resistência antimicrobiana está sobretudo associada a bactérias Gram-negativas, por essa razão, a atividade antimicrobiana dos análogos do péptido BP214 foi testada contra estirpes de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii, todas bactérias Gram-negativas clinicamente revelantes. Utilizando a microdiluição em caldo, um dos métodos mais usados para avaliar o potencial antimicrobiano de fármacos, cada uma das bactérias selecionadas foi inoculada com diferentes concentrações dos péptidos em estudo e as suas concentrações mínimas inibitórias foram determinadas. Contudo, não basta apenas que os péptidos antimicrobianos apresentem elevada atividade bactericida para que possam ser aplicados na prática clínica. É também essencial que demonstrem baixa toxicidade contra as células hospedeiras, em particular, os eritrócitos. Para a determinação da atividade hemolítica, diferentes concentrações de péptido foram também incubadas com uma suspensão de glóbulos vermelhos e, a partir da hemoglobina libertada, a percentagem de hemólise foi calculada. Nos análogos em que se procedeu à substituição de uma única lisina ou arginina pelo aminoácido alanina, verificou-se uma melhoria na atividade antimicrobiana contra a maioria das estirpes bacterianas, com concentrações mínimas inibitórias inferiores a 8 µg/mL. Por outro lado, com a substituição de uma única leucina, isoleucina, fenilalanina ou tirosina, os análogos demonstraram uma diminuição no potencial antimicrobiano em relação ao péptido BP214, em particular a substituição da leucina na posição 11, que revelou concentrações mínimas inibitórias superiores a 128 µg/mL na generalidade dos casos. Estes resultados sugerem que os aminoácidos lisina e arginina não são cruciais para a atividade do BP214 e que os aminoácidos leucina, isoleucina, fenilalanina e tirosina são importantes para a atividade deste mesmo péptido. Para além disso, todos os análogos que revelaram concentrações mínimas inibitórias tão boas ou melhores que o péptido BP214, apresentaram também uma toxicidade hemolítica superior. Também se observou que, de todas as estirpes bacterianas selecionadas, as piores concentrações mínimas inibitórias (≥ 34 µg/mL) dos análogos do péptido BP214 foram obtidas para a Pseudomonas aeruginosa. Este resultado já era de esperar, uma vez que a Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo que adquire facilmente resistências. A partir da informação obtida no HPLC de fase reversa, foi ainda possível relacionar o tempo de retenção de cada péptido sintetizado com o seu caráter hidrofóbico. Deste modo, averiguou-se a influência da hidrofobicidade nas atividades antimicrobiana e hemolítica e consequentemente, na seletividade celular. Todos os análogos que mostraram um caráter hidrofóbico superior ao péptido BP214, foram também os que revelaram atividades antimicrobianas e hemolíticas superiores. Com isto concluiu-se que a hidrofobicidade contribui para o aumento da atividade antimicrobiana e da toxicidade hemolítica e assim, para a redução da seletividade celular. Assim, apesar de alguns dos análogos do péptido BP214 terem-se revelado bastante promissores quanto ao seu potencial antimicrobiano, também mostraram uma toxicidade significativa que torna pouco provável a continuação dos seus estudos e a sua aplicação futura no tratamento de doenças infeciosas. Antes da apresentação dos resultados foi também incluído, nesta dissertação, um procedimento detalhado de todos os métodos realizados para atingir os objetivos deste trabalho, com base nos protocolos fornecidos e utilizados pelo laboratório

Maping customer experience tips: insights from online museum reviews

To understand the main attributes with impact on museum’s visitors’ experience, this study analyses the e-WOM communication in the form of the reviews shared by customers on TripAdvisor. A qualitative and exploratory approach was applied through a thematic content analysis on 1403 reviews from five Portuguese museums with a presence on that online platform. The results revealed the attributes and sub-attributes with more impact on the visitor’s experience. Exhibition’s Quality and Ambient Conditions greatly influence the reviewers, and Staff Behaviour and Signs & Signage are the attributes with less impact on the experience. Given the recognized lack of research regarding the museums’ atmospherics features, this study provides contributions to literature and practice by giving continuity to the gaps identified in previous studies. This research brings useful light tips for museums’ management to explore and improve their services and take advantage of e-WOM as a marketing tool. Due to the recognizable increase of technology in museums, the sub-attribute Multimedia Displays arise reveals the importance of exploring this feature in future research.O setor dos museus cresceu consideravelmente no último terço do século XX (Harris, 2013). Entre 2012 e 2020 o número de equipamentos culturais desta natureza aumentou 60% (UNESCO, 2020) em todo o Mundo. Assim como em Portugal, onde se verificou um aumento de 238 museus em 2019 face ao ano de 2000 (Fundação Francisco Manuel dos Santos, 2020). Segundo o International Council of Museums (ICOM) (2018): “O museu é uma instituição permanente sem fins lucrativos, ao serviço da sociedade e do seu desenvolvimento, aberta ao público, que adquire, conserva, investiga, comunica e expõe o património material e imaterial da humanidade e do seu meio envolvente com fins de educação, estudo e deleite.” (Museum Definition, Prospects and Potentials report and recommendations, ICOM’s Executive Board, December 2018). Os museus, tal como outras atrações culturais, têm um papel importante na indústria do turismo (Bauer, Sohn & Oliveira, 2019; Durão, 2009) e contribuem para o crescimento da economia local (Llop & Carod, 2012). Embora o crescimento do turismo seja uma realidade do século XXI (Pennings, 2015), a pandemia Covid-19 veio inverter a tendência de crescimento e este sector tornou-se um dos mais afetados, tendo registado, em 2020, uma queda de 74% em relação ao ano anterior (UNWT, 2021). De acordo com a UNESCO (2020), apesar de, um modo geral, o turismo cultural ter sido particularmente afetado, nomeadamente os museus, as respostas e soluções para manter as operações surgiram de forma célere e eficaz. Cada vez mais, os museus utilizam ferramentas da Internet para atrair visitantes (Bauer et al., 2019) e, simultaneamente, acompanhar o seu comportamento através dos comentários partilhados através de electronic Word of Mouth (e-WOM) nas redes sociais (Alexander, Blank & Hale, 2009; Antón, Camarero & Garrido, 2019; Dellarocas, 2003; Hausmann, 2012; Kempiak, Hollywood, Bolan & McMahon-Beattie, 2017; Rodgers & Wang, 2011). Babić Rosario et al. (2020: 427) definiram e-WOM como a “comunicação relativa ao consumo, gerada pelo consumidor, que implica ferramentas digitais e que é dirigida a outros consumidores”. O e-WOM pode ser de conteúdo positivo, negativo, uma combinação de positivo e negativo ou neutro (Rodgers & Wang, 2011). A avaliação do conteúdo gerado e partilhado nas redes sociais, denominada de valência, tem recebido atenção crescente na academia (Cheung & Thadani, 2010; Filieri, 2016; Zanibellato et al., 2018) na medida que os consumidores têm propensão em atribuir forte relevância e confiança ao mesmo. As avaliações negativas tendem ainda a ser mais valorizadas do que as positivas e as classificações extremas tendem a ser consideradas não confiáveis (Filieri, 2016). No TripAdvisor os utilizadores fazem a avaliação da experiência através dos comentários (reviews) e da classificação de 1 a 5 (rating). Através do rating é possível avaliar a qualidade do produto (Hong & Pittman, 2020) e a satisfação (Zanibellato et al., 2018). Segundo os estudos de Alexander et al. (2018) e Yoon et al. (2019) há uma correlação entre o rating e a valência de e-WOM. O e-WOM permite saber o que é que os consumidores dizem de um produto (neste caso os museus) e criar campanhas de e-WOM para atingir objetivos de marketing (Chu & J. Kim, 2018). Assim, os museus devem trabalhar o e-WOM como uma ferramenta de marketing (Hausmann, 2012) e desenhar as experiências oferecidas tendo em vista proporcionar satisfação dos seus visitantes. A literatura reconhece que visitantes satisfeitos geram avaliações positivas (Antón et al., 2019). De acordo com McLean (1997), o produto do museu é a experiência da visita e esta resulta dos serviços tangíveis e não tangíveis. A experiência começa antes da entrada no museu (Rowley, 1999) com uma pesquisa sobre o museu e os seus serviços (Alexander et al., 2018). Uma vez no museu, o visitante experiencia a exposição e todos os serviços disponíveis (Chan, 2009; de Rojas & Camarero, 2008). A experiência continua depois da saída do edifício, estende-se às memórias e às partilhas em redes sociais e avaliações no TripAdvisor (Alexander et al., 2018). Zanibellato et al. (2018) estudaram as características/atributos que influenciam a experiência do visitante (de forma positiva ou negativa) através da informação partilhada pelos visitantes dos 10 museus mais comentados no TripAdvisor. A partir dos conceitos de atmospherics e servicescape, Conti et al. (2020) desenvolveram o conceito de museumscape. Com base, essencialmente, na teoria de Bitner (1992) definiram as seis categorias que influenciam a experiência do visitante: Ambient Conditions, Staff Behaviour, Facilities and Convenience, Art Gallery Quality, Exhibition Space Aesthetics, Signs and Signage. Os autores, através de uma pesquisa exploratória por entrevistas diretas aos visitantes de três museus italianos, estudaram o espaço do museu e o ambiente físico e o seu impacto no Word of Mouth (WOM). Sendo uma área de investigação emergente (Alexander et al., 2018; Conti et al., 2020; Hausmann, 2012; Zanibellato et al., 2018), são identificadas pertinentes lacunas de investigação, nomeadamente o facto de haver poucos estudos sobre e-WOM no campo museológico e sobre a influência do ambiente e espaço físico dos museus na experiência de visita. Assim, e nesta sequência, o objetivo principal desta pesquisa é estudar os atributos dos museus com impacto na experiência do visitante através do e-e-WOM. Os objetivos específicos deste estudo são os seguintes: • Analisar o perfil do visitante com base na sua atividade no TripAdvisor: origem, experiência como utilizador na plataforma (status) e data da experiência; • Classificar os atributos da experiência de visita ao museu de acordo com a sua natureza: produto principal, serviços periféricos e ambiente; • Identificar os atributos e subatributos mais relevantes da experiência de visita ao museu, mencionados pelos reviewers; • Examinar a relação entre a performance dos atributos do museu e a satisfação. Desenvolveu-se um estudo qualitativo exploratório (Creswell, 2007; Merriam & Tisdell, 2016) com uma abordagem dedutiva e indutiva (Bardin, 1977). A informação foi recolhida de uma fonte secundária (Adams, Khan, Raeside & White, 2007), nomeadamente de documentos virtuais (Bryman, 2012): reviews partilhadas no TripAdvisor.com. Esta abordagem foi inspirada em estudos anteriores (Zanibellato et al., 2018; Alexander et al., 2018). O estudo empírico debruçou-se sobre o caso português. As avaliações estudadas pertencem aos cinco museus portugueses, com presença no TripAdvisor, com mais avaliações nas categorias de Museus de Arte e Museus de Especialidade: Museu Calouste Gulbenkian, Museu Nacional do Azulejo, Museu Coleção Berardo, Museu Nacional dos Coches e Museu Nacional de Arte Antiga. Os 1403 comentários recolhidos pertencem aos anos de 2018 e 2019 e foram escritos em língua inglesa. A informação foi tratada através de uma análise temática de conteúdo categorial (Adams et al., 2007; Bardin, 1977; Esteves, 2006) com recurso ao software Nvivo 12. As categorias, baseadas em Conti et al. (2020), surgiram de acordo com os temas repetidos; de seguida, esses temas foram divididos em subcategorias e posteriormente as referências foram distribuídas conforme a direção/valência (positivo, negativo ou neutro) (Rodgers & Wang, 2011; Zanibellato et al., 2018). Por último, procedeu-se à quantificação para encontrar a frequência de ocorrências (Esteves, 2006) e, assim, analisar os atributos e subatributos com mais impacto na experiência do visitante. Em relação aos reviewers, verificou-se que a maioria são de origem Norte Americana e Europeia e que apresentam um elevado grau de experiência enquanto utilizadores do TripAdvisor (status). Os resultados mostram que a classificação dos museus é positiva (4.5 na escala de 1 a 5), assim como as referências das reviews são maioritariamente positivas, em linha com outros estudos (Alexander et al., 2018; Yoon et al., 2019). A codificação revelou os cinco principais atributos que impactam a experiência do visitante, com algumas diferenças em relação aos atributos definidos no estudo de Conti et al. (2020): Ambient Conditions, Exhibition’s Quality, Facilities and Convenience, Museum Space Aesthetics, Signs & Signage, and Staff Behaviour. Também surgiram novos subatributos em relação aos trabalhos de Zanibellato et al. (2018) e de Conti et al. (2020). A principal conclusão da análise de resultados é que o produto principal do museu (Exhibition’s Quality) é o maior influenciador da visita, seguido das condições do ambiente. Os atributos que impactam menos a experiência do visitante são Signs & Signage e Staff Behaviour. Os resultados permitem confirmar as conclusões de Zanibellato et al. (2018) sobre algumas características que impactam a experiência apenas quando há um acontecimento negativo, como é o caso de Staff Behaviour e dos subatributos Display e Acessibility. Ao cruzar os dois estudos, um sobre o conceito de museumscape (Conti et al., 2020) e o outro sobre a análise de e-WOM no contexto museológico (Zanibellato et al., 2018), foi possível desenvolver uma abordagem mais alargada ao e-WOM e ao museumscape, reforçada com a emergência de novos subatributos. As pistas encontradas neste estudo podem ser ferramentas úteis para os museus explorarem e melhorarem os seus serviços e também para mostrar como seria importante considerar as comunicações de e-WOM nas estratégias de marketing. A recolha manual das 1403 reviews e da respetiva informação sobre cada review foi a maior dificuldade encontrada durante a pesquisa, pelo que, para futura investigação, recomenda-se a utilização de um software de recolha de dados adequado ou então, quando possível, a recolha da informação de forma gradual. Este estudo foi realizado antes da Covid-19, pelo que os atributos revelados podem ser úteis para estudar estratégias de espaço e serviço no contexto pandémico e pós-pandémico. Um dos subatributos que parece ser merecedor de atenção futura, devido ao crescimento da utilização de tecnologia por parte dos museus (Luo, 2020; Trunfio & Campana, 2019), é o subatributo referente aos dispositivos Multimedia (Multimedia Displays). Este estudo também deixa como sugestão para investigação futura aprofundar as razões que explicam o decréscimo de reviews de um ano para o outro quando o número de visitantes aumentou. Finalmente, parece ainda ser merecedor de investigação futura, o estudo da influência das reviews partilhadas por outros utilizadores (Yoon et al., 2019) nas reviews atuais

Relação da postura crânio-vertebral, osso hióide e ombros em indivíduos com e sem disfunções temporomandibulares

Projeto de Graduação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Licenciada em FisioterapiaA disfunção temporomandibular (DTM) é uma disfunção prevalente a nível mundial, apresentando limitação funcional e alterações posturais. Objetivo: Verificar a relação da postura crânio-vertebral, osso hióide e ombros em indivíduos com e sem DTM. Métodos: A amostra foi constituída por 44 participantes divididos em dois grupos: grupo sem DTM e grupo com DTM. Para a distribuição dos participantes entre grupos utilizou-se o índice anamnésico de Fonseca sendo que, 54,3% possuíam DTM leve, 31,8% DTM moderada e 13,6% DTM grave. Foi avaliada a postura através da utilização do Software de Avaliação Postural (SAPO). Resultados: Houve diferenças significativas entre os grupos no parâmetro distância mento-osso hióide. No grupo com DTM, verificou-se uma correlação negativa moderada entre a idade e o índice anamnésico de Fonseca, entre o ângulo crânio-vertebral e a distância mento-osso hióide e uma correlação positiva moderada entre a presença de cefaleias e o ângulo crânio-vertebral. Conclusão: No presente estudo apenas o grupo com DTM apresentou alterações a nível postural do osso hióide e o ângulo crânio-vertebral, assim como relação entre as cefaleias e o ângulo crânio-vertebral.The temporomandibular dysfunction (TMD) is a prevalent dysfunction worldwide, having functional limitation and postural changes. Objective: To analyse the relation in craniovertebral posture, hyoid bone and shoulders in subjects with and without TMD. Methods: The sample consisted of 44 participants divided into two groups: group without TMD and group with TMD. For the distribution of the participants, the Fonseca anamnesic index was used, with 54,3% having mild TMD, 31,8% moderate TMD and 13,6% severe TMD. Posture was evaluated through the use of Postural Evaluation Software (“SAPO”). Results: There were significant differences between the groups in the parameter distance mentus-hyoid bone. In group with TMD, there was a moderate negative correlation between age and Fonseca's anamnesic index, between the craniovertebral angle and the distance mentus-hyoid bone and a moderate positive correlation between the presence of headache and the craniovertebral angle. Conclusion: In this study, only the TMD group had postural changes between hyoid bone and craniovertebral angle, as well as the relation between the headache and the craniovertebral angle.N/

Prevalência da automedicação em estudantes da Universidade de Aveiro

Mestrado em Psicologia - Psicologia Clínica e da SaúdeSendo um problema de saúde pública mundial e uma prática bastante actual nos dias de hoje, a automedicação constitui-se como um dos principais comportamentos de risco. Nesse sentido, o presente estudo objectiva caracterizar o padrão de medicamentos não prescritos na população estudantil da Universidade de Aveiro. Para isso, realizou-se um estudo descritivo e transversal numa amostra de conveniência, constituída por 511 alunos, aos quais foi realizado em contexto de sala de aula um questionário para obtenção de informação relativa ao consumo de medicamentos não prescritos. A prevalência da automedicação foi de 44.2% e revelou-se independente do sexo, da idade e das habilitações académicas. O estudo revelou ainda que os estudantes da área da saúde se automedicam com mais frequência e que os estudantes que recorrem à automedicação o fazem por influência de familiares, amigos ou outra pessoa (53.4%) e/ou por prescrições anterior do próprio (52.3%). O presente estudo pretende contribuir para o aumento de conhecimento sobre o uso de medicamentos não prescritos. Além disso, são referidas também algumas implicações visando a promoção da saúde do estudante universitário.As a worldwide public health problem and a fairly current practice today, self-medication was a established as a major health risk behavior. Thus, this study pretends to characterize the pattern of consumption of non-prescribed drugs among the student population at the University of Aveiro. A descriptive and transversal study was made in a convenience sample consisting of 511 students, with questionnaires being accomplished in the context of classroom a questionnaire to obtain data on consumption of non-prescribed drugs. The prevalence of self-medication was 44.2% and proved to be independent of sex, age and academic qualifications. The survey also revealed that health students self-medicate themselves more frequently and that students who self-medicate do it under the influence of family, friends or someone else (53.4%) and/or previous prescriptions of their own (52.3%). This study intends to contribute to increasing knowledge about the use of non-prescription medicines. Moreover, in the course of this work are also referred to some implications in order to promote college student health

Psychophysiological Factors Analysis in Unpressurized Aircraft Cabins

In the versatile aviation environment, the pilot’s well-being is a crucial and demanding factor which is directly related to his good performance. Adding the fact that most of the aircraft that belong to the light aviation do not have pressurized cabins, this type of aviation can become a dangerous activity for the safety of pilots and passengers. The change in pilot’s performance during the changing of psychological and physiological parameters has proved to be a very significant factor in terms of flight safety. Also the increasing of altitude in different phases of flight corresponds to a reduction in oxygen partial pressure. This occurrence may lead to early symptoms of hypoxia which may become an even greater danger if the pilots do not have time to feel, or recognize their symptoms. A review of international legislation indicates a high tolerance to establish safety limits in this matter, taking into account the unpredictability of reactions of the human body of each pilot for the same flight conditions. This work is generally focused in acquired data during different flight situations, with different pilots and respective processing of data obtained during different tasks of flight. To achieve the proposed objectives the acquired data contain parameters such as altitude, absolute pressure and temperature inside the cabin; as well as registration oximetry, peripheral and cerebral, to study the phenomenon hypoxia. Also comprises electrocardiogram (ECG) and electroencephalogram (EEG) in order to establish a correlation between the influence of mental workload and other physiological parameters during different phases of flight. The specific objective of this research is the acquisition and processing of data collected directly from the aircraft and the pilot, performing flight simulation tests in different scenarios, contributing to trying to define the physiological limits of each individual with the purpose of creating an alert system on board to avoid possible incidents or accidents. This study also aims to suggest a restriction in the legislation on licensing of light aviation, within physiological limits of each individual, thus contributing to a safer flight environment.No ambiente versátil da aviação, o bem-estar do piloto é um factor crucial e exigente que está directamente relacionado com o seu desempenho. Adicionando o facto da maioria das aeronaves que pertencem á aviação ligeira não possuírem cabines pressurizadas, este tipo de aviação pode tornar-se numa actividade perigosa para a segurança de pilotos e passageiros. A mudança de desempenho dos pilotos aquando da alteração de parâmetros psicológicos e fisiológicos tem-se revelado um fator bastante significativo em termos de segurança de voo. Também o aumento da altitude nas diferentes fases de voo corresponde a uma diminuição da pressão parcial de oxigénio. Esta ocorrência pode levar a sintomas iniciais de hipoxia o que se pode tornar um perigo ainda maior se os pilotos não possuírem tempo para sentir, ou reconhecer, os seus sintomas. Uma revisão da legislação internacional indica uma grande tolerância a estabelecer limites de segurança neste tema, tendo em conta a imprevisibilidade de reacções do corpo humano de cada piloto para as mesmas condições de voo. O objectivo geral deste trabalho consiste na aquisição de dados durante distintas situações de voo, com diferentes pilotos, e o respectivo processamento dos dados obtidos durante as diferentes tarefas de voo. Para realizar os objectivos propostos os dados adquiridos contêm parâmetros como altitude, pressão absoluta e temperatura no interior da cabina, bem como o registo de oximetrias, periférica e cerebral, para estudar o fenómeno hipoxia. Também compreende electrocardiogramas (ECG) e electroencefalogramas (EEG) de modo a estabelecer uma correlação entre a influência da carga de trabalho mental e outros parâmetros fisiológicos durante as diferentes fases de voo. O objectivo específico desta investigação é a aquisição e processamento de dados recolhidos directamente da aeronave e do piloto, realizando testes de simulação de voo em diferentes cenários, contribuindo para tentar definir os limites fisiológicos de cada individuo com a finalidade de criar um sistema de alerta a bordo para evitar possíveis incidentes ou acidentes. Com este estudo pretende-se também sugerir uma restrição na legislação no licenciamento da aviação ligeira, dentro dos limites fisiológicos de cada individuo, contribuindo assim para um ambiente de voo mais seguro

Crystallographic studies on molybdopterin-dependent enzymes

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Bioquímica, Especialidade Bioquímica EstruturalThis Thesis reports the determination of the crystal structure of two molybdenum-dependent enzymes, as well as its functional interpretation. In Chapter 1 is given a general introduction on the use of molybdenum in biological systems, particularly its incorporation into the active site of several enzymes. In the same chapter is also included an overview on X-ray protein crystallography, briefly describing its main basic principles. Aldehyde oxidases are homodimeric proteins belonging to the xanthine oxidase (XO) family of molybdenum containing enzymes. The three-dimensional structure of mouse aldehyde oxidase homologue1 (mAOH1) is here reported and described (Chapter 2). This constitutes the first crystal structure ever obtained for an aldehyde oxidase. The mAOH1 protein was extracted from rat liver, and heterologously expressed in E.coli. The recombinant protein allowed determining suitable crystallization conditions, which were reproduced using the native enzyme from mouse liver. Suitable crystals were obtained, allowing to solve the protein structure at 2.9Å resolution, using bovine milk xanthine oxidase as a search model. Both proteins belong to the XO family of Mo proteins and are very similar, although catalyzing different reactions. The structure of mAOH1 and its comparison with the XO structure allowed drawing important structure and function correlations, and to explain the different enzyme specificities. These studies have also contributed to better understand the role of aldehyde oxidase in human health. The enzyme has received considerable attention from several pharmaceutical companies, as it is involved in the detoxification of several drugs and xenobiotics, assuming particular relevance in human health and drug design studies. Periplasmic nitrate reductase from the Cupriavidus necator bacterium (Cn NapAB) is a heterodimeric protein, and belongs to the DMSO reductase family of molybdenum containing enzymes. The three-dimensional structure of the C.necator NapAB was solved at 1.5Å resolution using crystals obtained from a crystallization robot. Structural, spectroscopic and functional studies of this protein are reported in Chapter 3. The high resolution of the model, allowed identifying the true nature of all Mo ligands. In the first reported nitrate reductase crystal structure (NapA from Desulfovibrio desulfuricans), the 6th Mo ligand had been identified as an oxygen, but in Cn NapAB, a sulfur atom could be unambiguously assigned to this position. It is believed that this is a general feature of all nitrate reductases, which has led to the necessary revisions on the reaction mechanism for this family of enzymes. To further characterize C.necator NapAB, spectroscopic and electrochemical studies have also been performed, and have shown unexpected features, particularly regarding the potential of the two c-type hemes.Fundação para a Ciência e Tecnologia - Bolsa de Doutoramento individual SFRH/BD/37948/2007. Programa POCI2010 - projectos POCI/QUI/57641/2004 e PTDC/QUI/64733/2006. Fundo Europeu de Desenvolvimento Regiona