Développement de matériaux à base de protéines extraites du byssus de la moule bleue Mytilus edulis

Le byssus est un amas de fibres que les moules produisent afin de s’ancrer aux surfaces immergées sous l’eau. Ces fibres sont pourvues de propriétés mécaniques impressionnantes combinant rigidité, élasticité et ténacité élevées. De plus, elles possèdent un comportement d’auto-guérison de leurs propriétés mécaniques en fonction du temps lorsque la contrainte initialement appliquée est retirée. Les propriétés mécaniques de ces fibres sont le résultat de l’agencement hiérarchique de protéines de type copolymère blocs riches en collagène et de la présence de métaux formant des liens sacrificiels réversibles avec certains acides aminés comme les DOPA et les histidines. Bien que cette fibre soit très intéressante pour la production de matériaux grâce à son contenu élevé en collagène potentiellement biocompatible, cette ressource naturelle est traitée comme un déchet par les mytiliculteurs. L’objectif de cette thèse était de valoriser cette fibre en extrayant les protéines pour générer une nouvelle classe de matériaux biomimétiques. Un hydrolysat de protéines de byssus (BPH) riche en acides aminés chargés, i.e. ~30 % mol, et permettant de former des films a pu être généré. Lorsque solubilisé à pH 10.5, le BPH forme un hydrogel contenant des structures en triple hélice de collagène et des feuillets β anti-parallèles intra- et inter-moléculaires. Suite à l’évaporation de l’eau, le film de BPH résultant est insoluble en milieu aqueux à cause des structures secondaires très stables agissant comme points de réticulation effectifs. Les propriétés mécaniques des films de BPH sont modulables en fonction du pH. Au point isoélectrique (pI = 4.5), les interactions électrostatiques entre les charges opposées agissent comme points de réticulation et augmentent la rigidité des films et leur contrainte à la rupture sans affecter la déformation à la rupture. À pH plus élevé ou plus bas que le pI, les performances mécaniques des films sont plus faibles à cause de la répulsion entre les groupements fonctionnels de même charge qui interagissent plutôt avec les molécules d’eau et causent le gonflement de la matrice protéique des films. Le BPH contenant un nombre élevé d’acides aminés chargés et réactifs, nous avons pu réticuler les films de manière covalente à l’aide d’EDC ou de glutaraldéhyde. Les propriétés mécaniques des films sont modulables en fonction de la concentration d’EDC utilisée lors de la réticulation ou en employant du glutaraldéhyde comme agent réticulant. Les films sont à la fois plus rigides et plus forts avec un degré de réticulation élevé, mais perdent leur extensibilité à mesure que les segments libres de s’étirer lors d’une traction deviennent entravés par les points de réticulation. La réticulation augmente également la résistance à la dégradation enzymatique par la collagénase, les films les plus fortement réticulés lui étant pratiquement insensibles. La spectroscopie infrarouge montre enfin que la réticulation entraîne une transition de feuillets β anti-parallèles inter-moléculaires vers des structures de type hélices de collagène/PPII hydratées. Des liens sacrificiels ont été formés dans les films de BPH par traitement au pI et/ou avec différents métaux, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, afin de moduler les propriétés mécaniques statiques et d’évaluer le rôle de ces traitements sur le comportement d’auto-guérison lors de tests mécaniques cycliques avec différents temps de repos. Plus la valence des ions métalliques ajoutés augmente, plus les propriétés mécaniques statiques affichent un module, une contrainte à la rupture et une ténacité élevés sans toutefois affecter la déformation à la rupture, confirmant la formation de liens sacrificiels. Les tests mécaniques cycliques montrent que les traitements au pI ou avec Ca2+ créent des liens sacrificiels ioniques réversibles qui mènent à un processus d’auto-guérison des performances mécaniques dépendant du pH. L’ajout de Fe3+ à différentes concentrations module les performances mécaniques sur un plus large intervalle et la nature plus covalente de son interaction avec les acides aminés permet d’atteindre des valeurs nettement plus élevées que les autres traitements étudiés. Le Fe3+ permet aussi la formation de liens sacrificiels réversibles menant à l’auto-guérison des propriétés mécaniques. Les spectroscopies Raman et infrarouge confirment que le fer crée des liaisons avec plusieurs acides aminés, dont les histidines et les DOPA. Les résultats dans leur ensemble démontrent que les films de BPH sont des hydrogels biomimétiques du byssus qui peuvent être traités ou réticulés de différentes façons afin de moduler leurs performances mécaniques. Ils pourraient ainsi servir de matrices pour des applications potentielles dans le domaine pharmaceutique ou en ingénierie tissulaire.The byssus is a set of protein-based anchoring threads produced by marine mussels to tether to water immersed surfaces. These fibers have impressive mechanical properties combining stiffness, elasticity and toughness, as well as a self-healing behavior of their mechanical performance upon rest following removal of stress. These properties are the result of collagen-rich block copolymer-like proteins hierarchically assembled and of the presence of organo-metallic reversible sacrificial bonds. Even though these fibers have outstanding mechanical properties and a high content of potentially biocompatible collagen, the mussel farming industry still treats them as a waste. The main objective of this thesis was to use byssus as a sustainable biological feedstock to produce a new family of biomimetic protein-based materials. We developed a method to produce a byssus protein hydrolyzate (BPH) rich in charged amino acids (~30 % mol) and with good film-forming capabilities. A hydrogel rich in inter- and intra-molecular anti-parallel β-sheets and in collagen triple helical structures forms following the BPH solubilization at pH 10.5. After evaporation of water, the resulting film is insoluble in aqueous media as a result of the BPH self-assembly into stable secondary structures. The mechanical properties of the films are pH-responsive owing to their high electrostatic charges content that act like effective crosslinking points at the isoelectric point (pI = 4.5), but causes swelling of the protein matrix and loss of mechanical performance at pH higher or lower than the pI. The strain at fracture remains constant, which increases the toughness of the materials when moving toward the pI. The high content in charged and reactive amino acids was used to covalently crosslink the BPH films using either EDC or glutaraldehyde. Increasing the crosslinking degree gives rise to stiffer and stronger films but leads to a loss of extensibility as a consequence of protein chains being trapped by the crosslinking points. The crosslinked films become resistant to collagenase degradation even though infrared spectroscopy shows the conversion of aggregated strands to hydrated collagen/PPII related structures following the crosslinking reaction. Thus, the crosslinked collagen-related structural elements hinder the collagenase action on the BPH films. Sacrificial bonds were formed in the BPH films by treatments at their pI and/or with various metallic ions, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, in order to tune the mechanical properties and to evaluate the role of sacrificial bonds on the self-healing behavior during cyclic mechanical testing. Using metallic ions of higher valence to treat the films results in an increase of the modulus, strength and toughness without reducing the strain at fracture, confirming the formation of organo-metallic sacrificial bonds. Cyclic mechanical testing shows that pI and Ca2+ treatments create reversible ionic sacrificial bonds that induce a pH-dependent self-healing behavior. Fe3+ addition at various concentrations enables tuning the mechanical performances over a larger interval and to reach higher values than other treatments. This behavior is attributed to the more covalent nature of the iron-amino acids bonding and to the affinity of iron with numerous amino acids, including histidines and DOPA, as detected using Raman and infrared spectroscopy. Iron addition also leads to the formation of reversible sacrificial bonds that procure a self-healing behavior of the mechanical properties to BPH films. Altogether, our results show that the BPH films are byssus biomimetic hydrogels whose mechanical properties can be tuned by using various treatments or crosslinking reactions. The materials could thus find a niche as protein matrix in domains such as the pharmaceutical industry or soft tissue engineering

Covalently crosslinked mussel byssus protein-based materials with tunable properties

Mussels’ anchoring threads, named byssus, are collagen-rich fibers with outstanding mechanical properties. Our previous work has shown the possibility of producing a byssus protein hydrolyzate with good film-forming ability, providing a promising new avenue for the preparation of biomaterials. Materials prepared from regenerated fibrous proteins often need additional treatments to reach the performance required for targeted applications. Here, we studied the effect of covalent crosslinking, using a carbodiimide or glutaraldehyde, on the mechanical properties and enzymatic resistance of byssus-based materials. The results show that the mechanical properties of the films can be tuned, and that a higher crosslinking degree leads to increases in modulus and strength accompanied by a loss of extensibility. Structural analysis performed by infrared spectroscopy revealed that crosslinking induces an unexpected transition from aggregated strands to hydrated collagen/PPII-related helical structures. The materials were nevertheless more resistant to collagenase degradation as a result of higher crosslinking density. This new set of materials prepared in aqueous environment could find a niche in tissue engineering

Metal–ligand interactions and salt bridges as sacrificial bonds in mussel byssus-derived materials

The byssus that anchors mussels to solid surfaces is a protein-based material combining strength and toughness as well as a self-healing ability. These exceptional mechanical properties are explained in part by the presence of metal ions forming sacrificial bonds with amino acids. In this study, we show that the properties of hydrogel films prepared from a byssus protein hydrolyzate (BPH) can also be improved following the biomimetic formation of sacrificial bonds. Strengthening and toughening of the materials are both observed when treating films with multivalent ions (Ca2+ or Fe3+) or at the BPH isoelectric point (pI) as a result of the formation of metal–ligand bonds and salt bridges, respectively. These treatments also provide a self-healing behavior to the films during recovery time following a deformation. While pI and Ca2+ treatments have a similar but limited pH-dependent effect, the modulus, strength, and toughness of the films increase largely with Fe3+ concentration and reach much higher values. The affinity of Fe3+ with multiple amino acid ligands, as shown by vibrational spectroscopy, and the more covalent nature of this interaction can explain these observations. Thus, a judicious choice of treatments on polyampholyte protein-based materials enables control of their mechanical performance and self-healing behavior through the strategic exploitation of reversible sacrificial bonds

Solid-State NMR Structure Determination of Whole Anchoring Threads from the Blue Mussel Mytilus edulis

The molecular structure of the blue mussel Mytilus edulis whole anchoring threads was studied by two-dimensional ¹³C solid-state NMR on fully labeled fibers. This unique material proves to be well ordered at a molecular level despite its heterogeneous composition as evidenced by the narrow measured linewidths below 1.5 ppm. The spectra are dominated by residues in collagen environments, as determined from chemical shift analysis, and a complete two-dimensional assignment (including minor amino acids) was possible. The best agreement between predicted and experimental backbone chemical shifts was obtained for collagen helices with torsion angles (−75°, +150°). The abundant glycine and alanine residues can be resolved in up to five different structural environments. Alanine peaks could be assigned to collagen triple-helices, β-sheets (parallel and antiparallel), β-turns, and unordered structures. The use of ATR-FTIR microscopy confirmed the presence of these structural environments and enabled their location in the core of the thread (collagen helices and antiparallel β-sheets) or its cuticle (unordered structures). The approach should enable characterization at the molecular level of a wide range of byssus macroscopic properties