Pelota interacts with HAX1, EIF3G and SRPX and the resulting protein complexes are associated with the actin cytoskeleton

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Pelota (PELO) is an evolutionary conserved protein, which has been reported to be involved in the regulation of cell proliferation and stem cell self-renewal. Recent studies revealed the essential role of PELO in the No-Go mRNA decay, by which mRNA with translational stall are endonucleotically cleaved and degraded. Further, PELO-deficient mice die early during gastrulation due to defects in cell proliferation and/or differentiation.</p> <p>Results</p> <p>We show here that PELO is associated with actin microfilaments of mammalian cells. Overexpression of human PELO in Hep2G cells had prominent effect on cell growth, cytoskeleton organization and cell spreading. To find proteins interacting with PELO, full-length human PELO cDNA was used as a bait in a yeast two-hybrid screening assay. Partial sequences of HAX1, EIF3G and SRPX protein were identified as PELO-interacting partners from the screening. The interactions between PELO and HAX1, EIF3G and SRPX were confirmed <it>in vitro </it>by GST pull-down assays and <it>in vivo </it>by co-immunoprecipitation. Furthermore, the PELO interaction domain was mapped to residues 268-385 containing the c-terminal and acidic tail domain. By bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC), we found that protein complexes resulting from the interactions between PELO and either HAX1, EIF3G or SRPX were mainly localized to cytoskeletal filaments.</p> <p>Conclusion</p> <p>We could show that PELO is subcellularly localized at the actin cytoskeleton, interacts with HAX1, EIF3G and SRPX proteins and that this interaction occurs at the cytoskeleton. Binding of PELO to cytoskeleton-associated proteins may facilitate PELO to detect and degrade aberrant mRNAs, at which the ribosome is stalled during translation.</p

Regulation of the reproductive cycle and early pregnancy by relaxin family peptides

The relaxin family of peptide hormones are structurally closely related to one another sharing a heterodimeric A–B structure, like that of insulin. They may also be active as unprocessed B–C–A pro-forms. Relaxin has been shown to pay a key role within the ovary, being involved in follicle growth, and ovulation. Relaxin is produced in large amounts also by the corpus luteum where it acts as an endocrine hormone positively affecting implantation, placentation and vascularization during the all-important first trimester phase of pregnancy establishment. Relaxin exerts its functions via the receptor RXFP1. Insulin-like peptide 3 (INSL3) in contrast acts through the related receptor RXFP2, and plays an essential role in the production of androgens within growing antral follicles. INSL3 is also produced in large amounts by the male fetus shortly after sex determination, where it controls the first transabdominal phase of testicular descent. However, this fetal INSL3 is also able to influence placental and maternal physiology, indicating associations with later preeclampsia and/or fetal growth restriction. Other members of this relaxin-like family of peptides, such as INSL4, INSL5 and INSL6 are less well studied, though all suggest modulatory roles in ovarian and/or placental function

Relaxin-like peptides in male reproduction: a human perspective

The relaxin family of peptide hormones and their cognate GPCRs are becoming physiologically well-characterized in the cardiovascular system and particularly in female reproductive processes. Much less is known about the physiology and pharmacology of these peptides in male reproduction, particularly as regards humans. H2-relaxin is involved in prostate function and growth, while insulin-like peptide 3 (INSL3) is a major product of the testicular Leydig cells and, in the adult, appears to modulate steroidogenesis and germ cell survival. In the fetus, INSL3 is a key hormone expressed shortly after sex determination and is responsible for the first transabdominal phase of testicular descent. Importantly, INSL3 is becoming a very useful constitutive biomarker reflecting both fetal and post-natal development. Nothing is known about roles for INSL4 in male reproduction and only very little about relaxin-3, which is mostly considered as a brain peptide, or INSL5. The former is expressed at very low levels in the testes, but has no known physiology there, whereas the INSL5 knockout mouse does exhibit a testicular phenotype with mild effects on spermatogenesis,probably due to a disruption of glucose homeostasis. INSL6 is a major product of male germ cells, although it is relatively unexplored with regard to its physiology or pharmacology, except that in mice disruption of the INSL6 gene leads to a disruption of spermatogenesis. Clinically, relaxin analogues may be useful in the control of prostate cancer, and both relaxin and INSL3 have been considered as sperm adjuvants for in vitro fertilization

Neohormones as biomarkers of reproductive health

Neohormone systems are defined as evolutionarily new endocrine or paracrine adaptations that supplement basic physiologic functions and define mammalian success. The relaxin family of peptide hormones are typical neohormones. Because they define the specific mammalian aspects of reproductive physiology, such as viviparity with implantation and placentation, lactation, or in the male the necessary adaptations to sperm needed for successful internal fertilization, they offer excellent biomarkers for characterizing reproductive health and disease. For example, ovarian H2-relaxin aids implantation and the establishment of the placenta, and circulating levels are significantly altered in early miscarriage. In the fetus, testicular INSL3 is responsible for the first phase of testicular descent and may be disrupted in cryptorchidism. In the adult, INSL3 is believed to be involved as an antiapoptotic factor in germ cell survival (male) and follicle selection (female) and acts as an excellent measure of Leydig cell functional capacity, particularly in the aging male. INSL5 and INSL6 appear also to be involved in the maintenance of adequate spermatogenesis. With the development of robust immunoassays for various relaxin family members, we are progressively gathering baseline information about normal biomarker levels as well as their perturbations in a wide range of reproductive pathologies

Funktionelle Analyse der Insl5- und Insl6-Gene und Bestätigung der Interaktion von Pelota und dessen putativen Interaktionspartnern.

Die Ziele dieser Arbeit waren einerseits die Untersuchung der Expression und Funktion von zwei Mitgliedern der Insulin-ähnlichen Proteinfamilie, Insl5 und Insl6, und andererseits die Bestätigung der Interaktion zwischen PELO und dessen putativen Interaktionspartnern CDK2AP1, EIF3G und SRPX.Um die Effekte der Inaktivierung von Insl5 zu untersuchen, wurden Insl5-defiziente Mäuse mit hybridem C57Bl/Jx129/Sv- und mit Inzucht 129/Sv-Hintergrund generiert und analysiert. Diese Studie zeigt, dass die Abwesenheit von Insl5 in beiden genetischen Hintergründen die Gesundheit der Mäuse nicht signifikant beeinflusst. Die interessantesten Unterschiede zwischen Insl5-/- - und Wildtyp-Mäusen des hybriden genetischen Hintergrundes wurden in deren Verhalten beobachtet, besonders in der Reaktion auf nozizeptive Impulse. Insl5-/- -Mäuse zeigen eine verzögerte Latenz für antinozizeptives Verhalten und schnelleres Zurückziehen der Pfoten wegen einer Beeinträchtigung der Weiterleitung des inhibitorischen antinozizeptiven Impulses zum Rückenmark. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Insl5-Defizienz neuronale Signalwege beeinträchtigt, die entweder an der Meditation von Schmerz oder an der Balance zwischen stimulierenden und inhibitorischen Prozessen im Rückenmark beteiligt sind. Diese Hypothese wird durch das Ergebnis unterstützt, dass INSL5-Expression im zentralen Nervensystem detektiert werden konnte. INSL5 zeigte hierbei eine besonders starke Expression in den Bereichen des Gehirns, die mit der zentralen Vermittlung von antinozizeptiven Einflüssen in Verbindung gebracht werden, wie beispielsweise im Bereich des anterioren Hypothalamus/praeoptischen Bereich, in den ventralen Nuklei des periaquäduktalen Grau und in dem Nukleus in der pontinen Kölliker-Fuse.Männliche und weibliche Insl5-/- -Mäuse des Inzuchtstammes 129/Sv sind infertil. Dieser Phänotyp konnte in den Insl5-/- - Mäusen des hybriden Hintergrundes nicht beobachtet werden. Histologische Untersuchungen zeigten im isolierten Testes der Insl5-defizienten Mäuse das Vorhandensein aller Stadien der Spermatogenese. Die Anzahl der Spermatozoen, die in Insl5-/- -Mäusen in den Nebenhoden gefunden wurden, zeigte keinen signifikanten Unterschied zur Anzahl der Spermien in den Wildtyp-Mäusen. Die Analyse der Spermienparameter ergab, dass die Spermienmotilität bei den Insl5-/- -Mäusen eingeschränkt war. Histologische Untersuchungen zeigten bei den Weibchen normale Follikelentwicklung. Um den reproduktiven Defekt in infertilen Insl5-/- -Weibchen weiter zu analysieren, wurde die Anzahl der Oocyten von superovulierten und nicht-superovulierten Weibchen bestimmt. Keine signifikanten Unterschiede konnten in der Anzahl der isolierten Oocyten zwischen Insl5-/- -Mäusen und Wildtyp-Mäusen gefunden werden. Allerdings brachten die meisten Verpaarungen zwischen Insl5-/- -Weibchen und Wildtyp-Männchen an E1.5 Embryonen hervor, dass die sich im Einzellstadium befanden. Dies lässt darauf schließen, dass die Infertilität der Insl5-/- -Weibchen durch einen Defekt in der Oocytenreifung hervorgerufen wird.Der Glucoselevel der Insl5-defizienten Mäuse war signifikant höher als der der Geschwister aus der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse des Glucosetoleranztests (GTT) lassen vermuten, dass Insl5-/- -Mäuse schlechter dazu in der Lage sind, Glucose aus dem Blut zu verstoffwechseln, und dass die fortschreitende Verschlechterung der Glucosetoleranz ein altersabhängiger Effekt ist. Allerdings zeigte die Durchführung des Insulintoleranztests (ITT), dass die Sensitivität für Insulin in Insl5-defizienten Mäusen nicht verändert ist. Anhand der Ergebnisse des GTT und des ITT vermuten wir, dass der höhere Glucoselevel der Mäuse durch eine geringere Insulinsekretion hervorgerufen wird. Diese Ergebnisse wurden durch histologische und immunhistologische Analysen unterstützt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die durchschnittliche Größe der Langerhans schen Inseln im Insl5-/- Pankreas 1,6fach kleiner war als in dem von Wildtyp-Mäusen. Außerdem war auch die Anzahl der Insulin-positiven ß-Zellen in den Langerhans schen Inseln der Insl5-/- -Mäuse signifikant reduziert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der hohe Glucoselevel in Insl5-/- -Mäusen durch einen Defekt in der Entwicklung der Langerhans schen Inseln im Pankreas und/oder einen Defekt in der Insulinsekretion hervorgerufen wird.Analysen der Insl6-Expression zeigten, dass Insl6 hauptsächlich in männlichen Keimzellen exprimiert wird. Die Expression von Insl6 kann zuerst an Tag 15 nach der Geburt im Maus-Testis detektiert werden, wenn die erste Welle der Spermatogenese das Stadium der Pachytän-Spermatocyten erreicht. Um die Rolle von INSL6 in der Keimzellentwicklung zu untersuchen, generierten wir Insl6-defiziente Mäuse. Die Mehrzahl der männlichen Insl6-defizienten Mäuse des hybriden Hintergrundes zeigten eine eingeschränkte Fertilität, wohingegen die weiblichen Mäuse fertil waren. Die Spermienanzahl war drastisch reduziert, was möglicherweise durch eine erhöhte Apoptoserate der sich entwickelnden Keimzellen erklärt werden kann. Auch die Spermien- Motilität war stark eingeschränkt. Analyse der Keimzellentwicklung in jungen Insl6-/- -Mäusen zeigte einen Arrest der ersten Spermatogenesewelle in der späten meiotischen Prophase. Analyse der RNA zeigte eine deutliche Abnahme der Expression später meiotischer und postmeiotischer Markergene, wohingegen die Expression von frühen meiotischen Markergenen im Insl6-/- -Testis unverändert bleibt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass INSL6 für den Ablauf der Spermatogenese benötigt wird.Das dritte Ziel dieser Arbeit war die Verifizierung der Proteininteraktion zwischen pelota (PELO) und drei Proteinen: cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1 (CDK2AP1), eukaryotic translation initiation factor 3, subunit G (EIF3G) und Sushi- repeat-containing protein X-linked (SRPX). Diese drei putativen Interaktionspartner von PELO wurden mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens identifiziert. Mittels Coimmunpräzipitation konnte die spezifische Interaktion von CDKAP1, EIF3G und SRPX mit PELO bestätigt werden. GST-Pull down Assays unterstützten desweiteren die spezifische Bindung von PELO mit seinen Interaktionspartnern und zeigten, dass die dritte eEF1α-ähnliche Domäne von PELO für die Interaktion mit den Partnerproteinen verantwortlich ist. Um die Spezifität der Interaktion von PELO und den putativen Interaktionspartnern weiter zu unterstützen, sowie die subzelluläre Lokalisation der interagierenden Proteine zu bestimmen, wurde ein bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) durchgeführt. Die mittels dieser Untersuchung erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass CDK2AP1, EIF3G und SRPX je einen Proteinkomplex mit PELO bilden, die am Cytoskelett lokalisiert sind

Inactivation of insulin-like factor 6 disrupts the progression of spermatogenesis at late meiotic prophase

Insulin-like factor 6 (INSL6), a member of the insulin-like superfamily, is predominantly expressed in male germ cells. Expression of the Insl6 is first detected in mouse testis at postnatal d 15 when the first wave of spermatogenesis progresses to pachytene spermatocytes. To elucidate the role of INSL6 in germ cell development, we generated Insl6-deficient mice. The majority of the Insl6-deficient males on a hybrid genetic background exhibited impaired fertility, whereas females were fertile. The number of mature sperm and sperm motility were drastically reduced in the epididymis. The reduced sperm count could be due to apoptotic death of a significant number of developing germ cells. Analysis of germ cell development during the juvenile life showed an arrest of the first wave of spermatogenesis in late meiotic prophase. RNA analysis revealed a significant decrease in expression of late meiotic- and postmeiotic-specific marker genes, whereas expression of early meiotic-specific genes remains unaffected in the Insl6(-/-) testes. These results demonstrate that INSL6 is required for the progression of spermatogenesis. (Endocrinology 150: 4348-4357, 2009