Heterogeneous MYCN amplification in neuroblastoma

Unter den 110 MYCN amplifizierten (MNA) Neuroblastomen, die in den letzten 10 Jahren am CCRI analysiert wurden, befanden sich 26 Tumore mit variierender Anzahl von Tumorzellen oder Arealen ohne MNA. In Übereinstimmung mit den Richtlinien der INRG Biologie Gruppe wurden diese Tumore als „heterogen MYCN- amplifiziert (hetMNA)“ eingestuft. Da der genomische Hintergrund von hetMNA- Tumoren bis jetzt noch nicht beschrieben wurde, versuchten wir Gemeinsamkeiten in segmentalen und/oder nummerischen Aberrationen (SCA und/oder NCA) zu finden. Von bis zu vier Tumorstücken vom selben hetMNA Tumor von fünf Patienten wurden Kryoschnitte angefertigt. Insgesamt wurden 13 Stücke mit Interphase FISH (I-FISH) analysiert und ihre DNA zur Aufklärung des genomischen Hintergrunds in hetMNA Tumoren mit MLPA und SNP Arrays untersucht. MYCN-Heterogenität wurde mit I-FISH detektiert und in Kombination mit der DDX1-Sonde angewendet um die Amplikonzusammensetzung festzustellen. γH2AX- Färbung mit anschließende MYCN FISH wurde durchgeführt um das Auftreten von DNA-Doppelstrangbrüchen mit MNA zu korrelieren. Die Quantifizierung der Signale auf den Schnitten wurde mit einem automatischen Aufnahmesystem durchgeführt. Alle analysierten hetMNA-Tumore zeigten NCAs, wobei zwei Proben von je zwei Patienten nur NCAs zeigten, sechs Stücke von vier Tumoren zweier weiteren Patienten wiesen zusätzlich unterschiedliche SCAs auf. Drei von vier Stücken von einem Patienten zeigten ebenfalls nur NCAs, das vierte eine SCA. Zahlreiche Chromosomen waren überrepräsentiert. MNA wurde in je einem Tumorstück von vier Patienten mit MLPA und/oder SNP Arrays bestätigt, während der fünfte MNA nur mit MYCN-FISH zeigte. In einem Tumor wurde Heterogenität in der Amplikonzusammensetzung bewiesen und ein anderer zeigte zwei unterschiedliche 1p-Bruchstellen in vier Stücken. Das Muster der γH2AX-Färbung korrelierte bedingt mit MNA-Tumorzellen. Unsere Daten belegten die Existenz von mehreren Tumorzellklonen und zum Teil unterschiedlichen Amplikons im gleichen Tumor. Mit der angewendeten Auflösung konnte jedoch keine SCA-Gemeinsamkeit gefunden werden, welche MNA bedingen könnte. Es konnten keine eindeutigen Rückschlüsse gezogen werden, dass genomische Instabilität MNA auslöst. Wir können die Notwendigkeit einer detaillierten Tumoraufarbeitung mit I-FISH und DNA-basierenden Techniken, wie sie von der International Neuroblastoma Research Group (INRG) Biology Group vorgeschlagen wird, nur bestätigen, um Heterogenität festzustellen.Among 110 MYCN amplified neuroblastomas analyzed at the CCRI in the last decade, 26 tumors contained a varying number of tumor cells/areas without MNA, defined as heterogeneous MYCN amplification (hetMNA) according to INRG biology guidelines. Since the genomic background of hetMNA tumors has not yet been described, we looked for common segmental and/or numerical chromosome aberrations and genetic instability as initiators for amplicon formation. Up to four tumor pieces of the same hetMNA tumor from five patients were cryosectioned. In total, thirteen pieces were analyzed by I-FISH and their DNA was analyzed by MLPA and 250k SNP arrays to investigate the genomic background of hetMNA tumors. MYCN I-FISH was performed to detect MYCN heterogeneity and combined with DDX1 probes to assess the amplicon composition. γH2AX staining and subsequent MYCN FISH was performed to correlate DNA double strand breaks occurrence with MNA. Quantification of signals on the sections was done with an automatic device. All analyzed hetMNA tumors showed NCAs, two samples from two patients each showed only NCAs; six pieces from four tumors from two patients displayed a variety of inconsistent, additional SCAs. Three of four pieces from one tumor had only NCAs, the fourth one SCA. Numerous chromosomes were unitarily found overrepresented. MNA was confirmed in four tumor pieces of four patients by MLPA/SNP arrays, the fifth showed MNA only in its MYCN FISH results. One tumor revealed different amplicon compositions in the same piece and another showed two 1p-breakpoints in four pieces. γH2AX staining pattern only partially correlated with MNA cells. Our data indicates the existence of multiple tumor cell clones and different amplicons in single hetMNA NBs. At the applied resolution, no common SCA is found to be underlying MNA not excluding subtle genomic changes and mutations. A conclusion on genetic instability as a cause for MNA is premature. Our data strongly supports a detailed tumor work up and the application of both I-FISH and DNA-based techniques as recommended by the INRG

Introducing a novel treatment approach and deciphering tumor heterogeneity in MYCN-amplified neuroblastoma

Das Neuroblastom (NB) ist eine der am häufigsten auftretenden Krebsarten im frühen Kindesalter und geht mit einer ausgeprägten Heterogenität bezüglich der Tumorbiologie und des klinischen Verhaltens einher. Neuroblastome werden, abhängig von Diagnosealter, der Tumorlokalisation und -abgrenzung sowie dem Vorliegen von gewissen Tumormarkern, in prognostische Gruppen mit sehr niedrigem bis hohem Risiko stratifiziert. Die derzeitige, multimodale Therapie ist für etwa 50% der Hochrisiko-Patienten unzureichend, da diese häufig refraktäre und rezidivierende Tumoren, die mit einer schlechten Überlebensrate behaftet sind, haben. Neue Behandlungsansätze sind daher für diese Patienten erforderlich. In dieser Dissertation beschreibe ich eine Strategie der Integration von Daten aus RNAi- und Arzneimittelscreens zur Identifizierung von neuen Zielgenen und Medikamenten, die in der Therapie von Hochrisiko-Patienten Anwendung finden könnten. Inhibierung der mitotischen Kinase AURKB durch den selektiven Inhibitor Barasertib erwies sich als vielversprechend um das Zellwachstum zu unterbinden. Die Sensitivität von Zelllinien mit MYCN-Amplifikation und Wildtyp-TP53 lag dabei weitaus höher als die von Linien ohne Amplifikation oder mit TP53- Mutationen. Die Wirksamkeit von Barasertib ist jedoch wahrscheinlich auch von der Expression des ABC-Transporters ABCB1 abhängig, welche mit einer erhöhten Toleranz gegenüber gewissen Medikamenten einhergehen kann. Barasertib supprimierte außerdem das Wachstum von Xenotransplantaten in einem Mausmodel der MYCNamp/TP53wt-Zelllinie IMR32 sehr erfolgreich. Basierend auf unseren Erkenntnissen, dass MYCN die Expression von AURKB regeln kann und dass ein hoher AURKB-Spiegel mit einer schlechten Überlebenswahrscheinlichkeit bei NB-Patienten assoziiert ist, sind wir der Auffassung, dass die Inhibierung dieser Kinase eine neue und valide Therapiestrategie für Hochrisiko-Patienten mit MYCN-amplifizierten und Wildtyp-TP53 Tumoren sein könnte. Bereits die Detektion einer kleinen, subklonalen Zellpopulation mit einer Amplifikation des MYCN-Onkogens kann zu einer Erhöhung des Risikoprofils und zur Einstufung des Patienten in ein aggressiveres Therapieprotokol führen obwohl das klinische Verhalten dieser Tumore noch nicht ausreichend untersucht ist. Um Neuroblastomen mit heterogener MYCN-Amplifikation (hetMNA) umfassender biologisch und genetisch zu charakterisieren und dies in Relation zu ihrem klinischen Verhalten zu setzen haben wir Tumorgenome von 26 NB-Patienten, in denen bereits intra-tumorale MYCN-Heterogenität mittels FISH nachgewiesen war, mit hochauflösenden SNP arrays analysiert. Wir konnten einen klaren Unterschied bezüglich des Diagnosealters feststellen: Die meisten Patienten unter 18 Monaten hatten lokalisierte, aneuploide Tumoren mit ausschließlich nummerischen chromosomalen Aberrationen oder zusätzlich einigen segmentalen chromosomalen Aberrationen (SCAs) und sprachen gut auf die jeweilige Therapie an. Tumoren von älteren Patienten waren hingegen mehrheitlich metastasierend, di-/tetraploid, wiesen viele SCAs auf und waren assoziiert mit einer schlechten Überlebenswahrscheinlichkeit. In fast allen aneuploiden, jedoch nicht in di-/tetraploiden Tumoren, konnten wir Chromosomen mit uniparentaler Di- oder Trisomie (UPD/UPT) finden. Während das Auftreten von UPD11 auf die Gruppe von Patienten, die jünger als 18 Monate waren, beschränkt war, konnte UPD14 nur bei älteren Patienten gefunden werden. Auch Deletionen im ATRX-Gen und Anzeichen für alternative lengthening of telomeres (ALT) waren ausschließlich in der älteren Gruppe zu verzeichnen. Wir schlussfolgerten daher, dass die biologische und prognostische Relevanz des MYCN-amplifizierten Subklons in genetisch heterogenen Neuroblastomen stark von zusätzlichen Faktoren abhängt. Diese sollten in der Risikostratifizierung besonders bei jüngeren Patienten (unter 18 Monate) mit hetMNA-Neuroblastomen berücksichtigt werden.Neuroblastoma (NB) is one of the most common cancers during childhood and wildly heterogeneous in tumor biology and clinical behavior. On the one hand, NB has an unusually high rate of spontaneous regression or maturation and on the other disproportionally responsible for cancer-related deaths in children. NB tumors can range from very low- to high-risk depending on patient age at diagnosis, tumor localization and confinement as well as the presence of specific marker mutations. The current multimodality therapy is inadequate for 50% of the patients with high-risk disease who have refractory or ultimately relapsing tumors and a poor outcome. For these patients, new treatment approaches are desperately needed. In this dissertation, I am describing a strategy to identify novel targets and agents for therapy for high-risk NB. By RNAi screening of the druggable genome, we identified the mitotic kinase AURKB among other cell-cycle genes to be a genetic dependency for cell survival in NB. Additionally, the AURKB-selective inhibitor barasertib was found to be highly active in a drug screen of compounds targeting genes and pathways with relevance in oncology. NB cell lines with MYCN amplification (MNA) and wild-type TP53 proved to be more sensitive to the compound than cell lines without amplification or mutant TP53. The efficacy of barasertib, however, may also depend on drug-resistance mechanisms including high expression of the ABC transporter ABCB1 in NB according to our preliminary data which indicated that barasertib is a substrate of ABCB1. In agreement with the in vitro results, barasertib effectively suppressed tumor growth in a xenograft mouse model of the MYCNamp/TP53wt cell line IMR32. Due to our discovery that MYCN can regulate AURKB expression and a high AURKB level associates with poor patient survival, we consider inhibition of the kinase to be a new rational therapeutic strategy for high-risk NB tumors with MNA and wild-type TP53. MNA is the signature mutation of 20-25% of NB tumors and detection in only a small subclonal fraction of cells leads to the upstaging of a patient and often the assignment to an aggressive treatment protocol. Yet, a comprehensive biological and genetic characterization of tumors with heterogeneous MYCN amplification (hetMNA) with respect to clinical behavior has only been recently attempted by two groups. In our study, we examined 26 patients with known hetMNA status as determined by fluorescence in situ hybridization (FISH) using ultra-high density SNP (single nucleotide polymorphism) array analysis. We detected a high variability in the genomic profile of these tumors ranging from numerical chromosomal aberrations (NCAs) -only to highly rearranged profiles with many accompanying segmental chromosomal aberrations (SCAs). There was a clear difference of hetMNA tumors in regard to patient age at diagnosis. Most patients younger than 18 months presented with localized, aneuploid tumors with either NCA-only or mixed profiles with a few SCAs that responded well to therapy. Tumors of older patients, on the contrary, were more often metastatic, di-/tetraploid, displayed a multitude of SCAs and associated with a poor overall survival. Additionally, we detected numerous chromosomes with uniparental disomy (UPD) in almost all aneuploid but not in di-/tetraploid tumors. Whereas UPD11 (UPD of chromosome 11) was confined to tumors in the group younger than 18 months, UPD14 was found only in older patients. We also identified deletions of ATRX and alternative lengthening of telomeres (ALT) exclusively in the older age group. In summary, we concluded that the biological and prognostic relevance of the MNA subclone in a heterogeneous tumor greatly depends on additional factors which need to be taken into consideration when stratifying the risk for a patient and making a treatment decision.submitted by Dominik BogenAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2015OeBB(VLID)271371

The genetic tumor background is an important determinant for heterogeneousMYCN-amplified neuroblastoma

Photograph used for a story in the Daily Oklahoman newspaper. Caption: "An Oklahoma State University student rally, estimated at everywhere from 2,000 to 5,000 students, cheered Bob Swaffar, upper left, student senate president, as he criticized Wednesday new policy on who will be allowed to speak on the campus. A portion of the crowd is shown in the photo at upper right. Tom Lucas, president of the OSU Student Association, lower left, read a statement from OSU President Dr. Robert B. Kamm to the students.

Heterogeneous MYCN amplification in neuroblastoma: A SIOP Europe Neuroblastoma Study

Background In neuroblastoma (NB), the most powerful prognostic marker, the MYCN amplification (MNA), occasionally shows intratumoural heterogeneity (ITH), i.e. coexistence of MYCN-amplified and non-MYCN-amplified tumour cell clones, called heterogeneous MNA (hetMNA). Prognostication and therapy allocation are still unsolved issues. Methods The SIOPEN Biology group analysed 99 hetMNA NBs focussing on the prognostic significance of MYCN ITH. Results Patients 18 m: 0.67 ± 0.14, p = 0.011; metastatic: 18 m: 0.28 ± 0.09, p = 0.084). The genomic 'background’, but not MNA clone sizes, correlated significantly with relapse frequency and OS. No relapses occurred in cases of only numerical chromosomal aberrations. Infiltrated bone marrows and relapse tumour cells mostly displayed no MNA. However, one stage 4s tumour with segmental chromosomal aberrations showed a homogeneous MNA in the relapse. Conclusions This study provides a rationale for the necessary distinction between heterogeneous and homogeneous MNA. HetMNA tumours have to be evaluated individually, taking age, stage and, most importantly, genomic background into account to avoid unnecessary upgrading of risk/overtreatment, especially in infants, as well as in order to identify tumours prone to developing homogeneous MNA