Aspectos evolutivos e impacto funcional de Polimorfismos dos genes CD80 e CD86

Orientadora : Profa. Dra. Maria Luiza Petzl-ErlerTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/02/2012Bibliografia: fls. 60-63Resumo: CD80 e CD86, também denominados B7.1 e B7.2, são genes proximamente ligados no cromossomo 3 que codificam glicoproteinas da superfamília das imunoglobulinas, expressas na superfície das células apresentadoras de antígeno. Essas moléculas participam na ativação e inibição das células T através da ligação aos receptores CD28 e CTLA-4. Nesse estudo foram analizados polimorfismos dos genes CD80 e CD86 com o objetivo de investigar a diversidade genética, microevolução e relevância funcional. Foram genotipados 1.124 indivíduos, incluindo brasileiros de ancestralidade predominantemente européia, mista africana e européia e japonesa, 5 populações ameríndias e africanos. As regiões promotoras de CD80 e CD86 foram sequenciadas e utilizadas em ensaios de gene repórter com luciferase em células HEK293T. As proteínas foram quantificadas por citometria de fluxo em monócitos, estimulados com quatro ligantes de TLR, de indivíduos com diferentes genótipos. Sítios de ligação de fatores de transcrição foram inferidos in silico. Todos os alelos analisados foram encontrados em africanos, o que sugere sua origem na África antes das migrações humanas para fora do continente. Cinco novos alelos da região promotora de CD80 foram identificados e confirmados por clonagem e sequenciamento, sendo o promotor 2 o mais provável alelo ancestral. Foi encontrado um efeito de seleção balanceadora em descendentes de japoneses, nos quais todos os alelos apresentam frequências elevadas. O nucleotídeo -79 é monomórfico em 4 populações ameríndias, nas quais a presença do alelo -79G é provavelmente resultado de fluxo gênico. O haplótipo 4 de CD80 apresentou expressão significativamente menor do que os demais devido ao SNP g.-7T>C (rs16829980), g.5C>A (rs41271391) e/ou 287A>T (rs56124423). O SNP g.-7T>C está localizado no sítio de ligação da proteína ativadora AP-1 e de acordo com inferências in silico interfere na ligação. No gene CD86, dois SNPs foram analisados em 2.4 kb incluindo o promotor e a 5'UTR. O SNP CD86 -298T>C não interfere na expressão gênica segundo os experimentos com a luciferase. A quantidade das proteínas em monócitos diferiu significativamente entre os haplótipo de CD80 e os alelos -819T>C (rs11575855) de CD86 e também entre idosos e jovens e entre os quatro diferentes estímulos utilizados. Concluímos que polimorfismos na região 3' do promotor de CD80 alteram significativamente a atividade do promotor. O SNP CD86 -819T>C altera os níveis proteicos de CD86 na membrana de monócitos estimulados. As diferenças encontradas são provavelmente devidas a alterações na capacidade de ligação de fatores de transcrição.Abstract: CD80 and CD86, also called B7.1 and B7.2, are closely linked genes on chromosome 3 that code for glycoproteins of the immunoglobulin superfamily, expressed on the surface of antigen-presenting cells. These costimulatory molecules play essential roles for stimulation and inhibition of T cells through binding to CD28 and CTLA-4 receptors. In this study, CD80 and CD86 polymorphisms were analyzed to investigate the genetic diversity, microevolution, and the functional relevance of CD80 and CD86 promoter polymorphisms. We genotyped 1,124 individuals, including Brazilians of predominantly European, mixed African and European, and Japanese ancestry, 5 Amerindian populations, and an African sample. The CD80 and CD86 promoter regions were sequenced and functional studies were done using luciferase reporter assays in HEK293T cells, flow cytometry measurements of protein on TLR stimulated monocytes (using four different stimuli) of individuals with different genotypes, and in silico inferences of transcription factor binding. All variants were observed in Africans, which suggests their origin in Africa before the human migrations out of that continent. Five new CD80 promoter alleles were identified and confirmed by cloning and sequencing, and promoter 2 is most likely the ancestral allele. There is evidence of an effect of balancing selection in Japanese-brazilians, where all alleles present high frequencies. Nucleotide-79 is monomorphic in 4 Amerindian populations, where the presence of the -79G allele is probably the result of gene flow from non-Amerindians. CD80 haplotype 4 showed significantly lower promoter activity, caused by SNPs g.-7T>C (rs16829980), g.5C>A (rs41271391) and/or 287A>T (rs56124423). The SNP g.-7T>C is located in the previously reported binding site of activating protein 1 (AP-1) and is predicted to interfere with AP-1 binding. In CD86, two SNPs were analyzed in the 2.4 kb including the promoter and 5'UTR of the gene. Luciferase measurements showed that the CD86 -298T>C SNP did not interfere in gene expression. The protein expression on monocytes differed significantly among CD80 haplotypes and CD86 -819T>C (rs11575855) alleles, and also between age groups and the different stimuli given to the cells. We conclude that polymorphisms within the 3' end of the CD80 promoter significantly affect the activity of the promoter. Further, the CD86 -819T>C SNP has a significant effect on protein levels on the membrane of stimulated monocytes. These differences are most likely caused by differential binding of transcription factors

Diversidade dos genes reguladores da resposta de linfócitos T, CD80 e CD86, na populaçao da regiao metropolitana de Curitiba

Orientadora: Maria Luiza Petzl ErlerMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Curso de Graduaçao em Ciencias BiológicasResumo : Os genes CD80 e CD86 estão ligados no braço longo do cromossomo 3 (3q 13-3q21). Codificam glicoproteínas semelhantes àsimunoglobulinas, expressas na membrana das células apresentadoras de antígeno (APe). Essas moléculas atuam como coestimuladoras, participando do segundo sinal na ativação dos linfócitos T. Devido ao importante papel que possuem nas respostas imunes, os genes que as codificam são considerados candidatos a estarem associados a doenças, especialmente as autoimunes. Vários polimorfismos já foram descritos nesses genes, porém poucas populações foram caracterizadas para a maior parte deles. O estudo de genética de populações possui diversas aplicações, trazendo infonnação sobre a ação de fatores evolutivos em seqüências genômicas e auxiliando na determinação da história biológica das populações. A população brasileira é miscigenada, fonnada pela contribuição de europeus, africanos e ameríndios, em diferentes proporções em cada região do país. Na região sul, onde foi realizado o presente estudo, o componente europeu é predominante. Neste estudo foram analisados seis SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único), nas posições -454 (A, e), -387 (C, T), -232 (A, G), -79 (G, C), -7 (C, T) e +5 (A, C), e uma inserção na posição -558 (CATGA), localizados na região promotora do gene CD80 e um SNP no exon 8 do gene CD86. O objetivo foi otimizar a técnica de tipagem e determinar as freqüências alélicas, genotípicas e haplotípicas desses polimorfismos na população da região metropolitana de Curitiba. A técnica escolhida foi a PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide Probes). Essa técnica consiste na amplificação por PCR do fragmento correspondente ao gene e fixação do produto de peR em membranas de nylon. Em seguida é feita a hibridação com oligonucleotídeos-sonda marcados com biotina para a discriminação dos genótipos. Os resultados obtidos foram bons, com sinais fortes e dicotômicos, porém, sem reprodutibilidade. As soluções, membranas e sondas utilizadas foram testadas novamente e não houve melhora nos resultados. Para as posições -387, -7 e +5 do gene CD80, foi possível tipar toda a amostra. Já para as posições -588, -232 do gene CD80 e 1057 do gene CD86, apenas uma parte da amostra foi analisada, e as freqüências encontradas podem não ser representativas da nossa população. As freqüências alélicas em euro-brasileiros são: -387*T 46,0%, - 7*C_ +5*A 11,4%, -558*INS 13,9%, -232*A 27,5% e 1057*A 28,3%. A amostra encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg para todos os locos analisados. Para as posições -454 e -79 não obtivemos bons resultados na hibridação. As variantes das posições -387, -7 e +5 estão em desequilíbrio de ligação absoluto; As freqüências encontradas assemelham-se às descritas para populações européias ou de ascendência européia e diferem da população japonesa para a maior parte dos polimorfismos analisados, com exceção das posições -232 e -558 do gene CD80

Estudo de populações de diferentes ancestralidades e evolução de polimorfismos dos genes CD80 e CD86

Orientadora : Profa. Maria Luiza Petzl-ErlerDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 24/11/2008Bibliografia: fls.75-82Resumo: Os genes CD80 e CD86 estão ligados no braço curto do cromossomo 3 e codificam glicoproteínas estruturalmente relacionadas, membros da superfamília das imunoglobulinas, expressas na membrana de células apresentadoras de antígenos, que desempenham papel essencial na ativação e inibição da proliferação de células T. A ativação completa das células T requer um sinal antígeno específico, derivado da interação entre o complexo peptídeo/MHC e o receptor de célula T, e sinais coestimuladores, dentre os quais o mais bem caracterizado é dado pela ligação das moléculas B7 (CD80 e CD86) ao receptor CD28, nas células T. Já a interação entre B7 e CTLA-4, um receptor inibidor, interrompe a resposta imune. Neste estudo foram analisados polimorfismos da região promotora do gene CD80 (c.-557-561insCATGA, c.-454C>A, c.-387T>C, c.-232G>A, c.-79C>G, c.-7T>C, c.5C>A) e do éxon 8 do gene CD86 (c.1057G>A) em três amostras da população brasileira (de ancestralidade predominantemente européia, de ncestralidade mista européia e africana e descendentes de japoneses), em ameríndios de três grupos Guarani e dois grupos Kaingang e em africanos, totalizando 1100 indivíduos. A técnica utilizada para genotipagem foi PCR-SSOP (polymerase chain reaction – sequence spcific oligonucleotide probes). Todos os alelos e haplótipos foram encontrados em africanos, portanto foi possível concluir que os polimorfismos analisados surgiram no continente africano antes das migrações humanas para fora da África. A origem dos alelos da região promotora do gene CD80 foi hipotetizada e o alelo ancestral é mais provavelmente o promotor 2 (-557-561*del,-454*C,-387*C,-232*G,-79*C,-7*T+5C) ou o promotor 3 (-557-561*del,-454*C,-387*T,-232*G,-79*C,-7*T,+5C). Os alelos promotores 1 e 4 originaram-se a partir do promotor 3. O nucleotídeo -79 é monomórfico em quatro populações ameríndias analisadas e o alelo G ocorre provavelmente apenas por fluxo gênico com não indígenas. Para o SNP 1057G>A, o alelo A é o mais comum em descendentes de japoneses e o alelo G é o mais freqüente nas demais populações, portanto, provavelmente a alteração das freqüências alélicas, com o alelo A tornando-se o mais comum, ocorreu recentemente nas populações do leste asiático. A diversidade observada em ameríndios para os genes CD80 e CD86 é, em geral, menor e o desequilíbrio de ligação (DL) é maior do que o observado em populações não indígenas, como é esperado para populações historicamente pequenas e isoladas, devido aos efeitos da deriva genética e ao reduzido fluxo gênico.Abstract: CD80 and CD86 are closely linked genes on chromosome 3 and encode for structurally related glycoproteins, members of the immunoglobulin superfamily, expressed on the cell surface of antigen resenting cells, which play essential roles on stimulation and inhibition of T cells. The full activation of T cells requires several signals, one antigen-specific derived from the MHC/peptide and TCR interaction, and the second derived from costimulatory B7 molecules (CD80 and CD86) through bind ng with CD28 receptor, on T cells. On the other hand, the interaction between B7 and CTLA-4, an inhibitory T cell receptor, interrupts the response. In the present study, CD80 promoter c.-557-561insCATGA, c.-454C>A, c.-387T>C, c.-232G>A, c.- 79C>G, c.-7T>C, c.5C>A and CD86 exon 8 c.1057G>A polymorphisms were analyzed in three samples of the Brazilian population (of predominantly European, of mixed African and European, and of Japanese ancestry), in Brazilian Amerindian populations from three Guarani and two Kaingang groups, and in Africans, totaling 1,100 individuals. Polymerase chain reactions followed by hybridization with sequence specific oligonucleotide probes (PCR-SSOP) were performed to genotype these polymorphisms. All alleles and haplotypes were found in African individuals, so it was possible to conclude that the polymorphisms analyzed originated in the African continent before the human migrations out of Africa. The origin of CD80 promoter alleles was hypothesized, and either promoter 2 (-557-561*del,-454*C,-387*C,- 232*G,-79*C,-7*T+5C) or promoter 3 (-557-561*del,-454*C,-387*T,-232*G,-79*C,- 7*T,+5C) is most likely the ancestral allele, and alleles promoter 1 and 4 emerged both from promoter 3. Nucleotide -79 was found to be monomorphic in four Amerindian populations analyzed and the presence of the G allele in these populations is probably due to gene flow from non-Amerindians. For the CD86 1057G>A SNP, the A allele is the most common in Japanese descendants while G is the most frequent allele in all other populations, so the shift in allele frequencies probably occurred recently in Eastern Asian populations. The diversity observed in Amerindians for the CD80 and CD86 genes is usually lower and linkage disequilibrium (LD) is usually higher than in non-Amerindian populations, as expected for historically small and isolated populations, because of the significant effects of random genetic drift and the reduced gene flow

Tracing the distribution of european lactase persistence genotypes along the Americas

In adulthood, the ability to digest lactose, the main sugar present in milk of mammals, is a phenotype (lactase persistence) observed in historically herder populations, mainly Northern Europeans, Eastern Africans, and Middle Eastern nomads. As the –13910∗T allele in the MCM6 gene is the most well-characterized allele responsible for the lactase persistence phenotype, the –13910C > T (rs4988235) polymorphism is commonly evaluated in lactase persistence studies. Lactase non-persistent adults may develop symptoms of lactose intolerance when consuming dairy products. In the Americas, there is no evidence of the consumption of these products until the arrival of Europeans. However, several American countries’ dietary guidelines recommend consuming dairy for adequate human nutrition and health promotion. Considering the extensive use of dairy and the complex ancestry of Pan-American admixed populations, we studied the distribution of –13910C > T lactase persistence genotypes and its flanking haplotypes of European origin in 7,428 individuals from several Pan-American admixed populations. We found that the –13910∗T allele frequency in Pan-American admixed populations is directly correlated with allele frequency of the European sources. Moreover, we did not observe any overrepresentation of European haplotypes in the –13910C > T flanking region, suggesting no selective pressure after admixture in the Americas. Finally, considering the dominant effect of the –13910∗T allele, our results indicate that Pan-American admixed populations are likely to have higher frequency of lactose intolerance, suggesting that general dietary guidelines deserve further evaluation across the continent

Association of polymorphisms in HCN4 with mood disorders and obsessive compulsive disorder

Hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated (HCN) potassium channels are implicated in the control of neuronal excitability and are expressed widely in the brain. HCN4 is expressed in brain regions relevant to mood and anxiety disorders including specific thalamic nuclei, the basolateral amygdala, and the midbrain dopamine system. We therefore examined the association of HCN4 with a group of mood and anxiety disorders. We genotyped nine tag SNPs in the HCN4 gene using Sequenom iPLEX Gold technology in 285 Caucasian patients with DSM-IV mood disorders and/or obsessive compulsive disorder and 384 Caucasian controls. HCN4 polymorphisms were analyzed using single marker and haplotype-based association methods. Three SNPs showed nominal association in our population (rs12905211, rs3859014, rs498005). SNP rs12905211 maintained significance after Bonferroni correction, with allele T and haplotype CTC overrepresented in cases. These findings suggest HCN4 as a genetic susceptibility factor for mood and anxiety disorders; however, these results will require replication using a larger sample