Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer)

Coenzym F420 ist ein 5Ž-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und für die gelb-grüne Fluoreszenz dieser Organismen verantwortlich ist. Es ist an Hydrid-Transferase Reaktionen im Energie- und Baustoffwechsel dieser Organismen beteiligt. Bisher wurden acht F420-abhängige Oxidoreduktasen in methanogenen Archaea gefunden, die alle Si-Seiten-spezifisch bezüglich des Hydrid-Transfers sind. Von den acht Enzymen zeigen zwei Sequenzverwandtschaft zur Enzymfamilie der bakteriellen Luciferase (LuxA). Es handelt sich hierbei um F420-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer), die untereinander bis zu 26% sequenzverwandt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Kristallstrukturen der Alkohol-Dehydrogenase Adf und der Reduktase Mer mit gebundenem Coenzym F420 ermittelt. Die Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (Adf) aus Methanoculleus thermophilicus wurde mit einem gebundenen F420-Aceton Addukt bei einer Auflösung von 1,8 Å gelöst. Das Enzym liegt als Homodimer vor. Die Monomere besitzen eine (α/β)8-Faltung, bekannt als TIM-Barrel, und weisen eine nicht-Prolin-cis-Peptidbindung auf. Die Tertiärstruktur weicht von der Grundstruktur des TIM-Barrels durch zusätzliche Domänen mit Sekundärstrukturelementen ab, die als Insertions-Regionen bezeichnet werden. Insertions-Regionen bilden die Kontaktstelle für die Dimerisierung und sind an der Substratbindung beteiligt. Coenzym F420 bindet in einer Bindetasche, welche 15 Å tief von der Oberfläche bis in das Zentrum des Enzyms hineinreicht. Schwache Wechselwirkungen von F420 zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Proteinhauptkette tragen wesentlich zu seiner Bindung bei. Die in Proteinen selten zu beobachtende nicht-Prolin-cis-Peptidbindung dient der Fixierung des Deazaflavin-Rings an seiner Re-Seite. Diese energetisch instabile cis-Bindung wird durch benachbarte, intramolekulare Wechselwirkungen stabilisiert. Der als Isoalloxazin-Ring bezeichnete Deazaflavin-Ring liegt in einer `gebogenenŽ Konformation vor und weicht um 27° von einer planaren Konformation ab. Der Aceton-Teil des gebundenen F420-Aceton Addukts bindet kovalent am C5 auf der Si-Seite des Deazaflavin-Rings. Mit dieser Hilfe war es möglich, 2-Propanol in das aktive Zentrum des Enzyms zu modellieren. Reste, welche an der Bindung von 2-Propanol und am Hydridtransfer beteiligt sind, wurden identifiziert und zudem wurde ein katalytischer Mechanismus postuliert. Die Kristallstruktur von F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer) aus Methanosarcina barkeri wurde mit gebundenem Coenzym F420 bei einer Auflösung von 2,6 Å ermittelt. Das Enzym liegt als Homotetramer vor. Mer-Monomere haben eine (α/β)8-Tertiärstruktur mit zusätzlichen Insertionsregionen. Innerhalb des aktiven Zentrums bindet F420 hauptsächlich über schwache Wechselwirkungen zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Protein Hauptkette. Ausnahmen sind an der Bindung beteiligte Seitenketten von His36 und Lys161. Die nicht-Prolin-cis-Peptidbindung, an identischer Position zu Adf, fixiert den Deazaflavin-Ring. Der Isoalloxazin-Ring weist in Reduktase Mer die aus Alkohol-Dehydrogenase Adf bekannte gebogene Konformation auf. Ein unbekanntes Molekül bindet kovalent am C5 des Coenzyms. Anhand von Mer-Strukturvergleichen konnte eine F420-bedingte Konformationsänderung in einer flexiblen Domäne einer Insertions-Region beobachtet werden. Zwischen zwei Insertionsregionen des TIM-Barrels bindet Polyethylenglykol, welches als Präzipitant im Kristallisationsansatz vorlag. Die unspezifische Bindung von Polyethylenglykol an einer potentiellen Substratbindestelle in Mer wird im abschließenden Teil dieser Arbeit diskutiert. Aufgrund der Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase und der F420-abhängigen Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase in Abwesenheit und in Gegenwart von F420 wird ein Katalysemechanismus für diese beiden Enzyme vorgeschlagen und F420 in das aktive Zentrum der strukturverwandten bakteriellen Luciferase modelliert. Abschließend wird die in der LuxA-Familie konservierte F420-bzw. FMN-Bindestelle mit der in F420H2:NADP-Oxidoreduktase und 8-HDF-Photolyase verglichen, die weder untereinander noch mit der Luciferase-Familie Sequenzverwandtschaften zeigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit sind in zwei Orginalarbeiten beschrieben, die den Ergebnisteil der Dissertation bilden

Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer)

Coenzym F420 ist ein 5Ž-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und für die gelb-grüne Fluoreszenz dieser Organismen verantwortlich ist. Es ist an Hydrid-Transferase Reaktionen im Energie- und Baustoffwechsel dieser Organismen beteiligt. Bisher wurden acht F420-abhängige Oxidoreduktasen in methanogenen Archaea gefunden, die alle Si-Seiten-spezifisch bezüglich des Hydrid-Transfers sind. Von den acht Enzymen zeigen zwei Sequenzverwandtschaft zur Enzymfamilie der bakteriellen Luciferase (LuxA). Es handelt sich hierbei um F420-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer), die untereinander bis zu 26% sequenzverwandt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Kristallstrukturen der Alkohol-Dehydrogenase Adf und der Reduktase Mer mit gebundenem Coenzym F420 ermittelt. Die Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (Adf) aus Methanoculleus thermophilicus wurde mit einem gebundenen F420-Aceton Addukt bei einer Auflösung von 1,8 Å gelöst. Das Enzym liegt als Homodimer vor. Die Monomere besitzen eine (α/β)8-Faltung, bekannt als TIM-Barrel, und weisen eine nicht-Prolin-cis-Peptidbindung auf. Die Tertiärstruktur weicht von der Grundstruktur des TIM-Barrels durch zusätzliche Domänen mit Sekundärstrukturelementen ab, die als Insertions-Regionen bezeichnet werden. Insertions-Regionen bilden die Kontaktstelle für die Dimerisierung und sind an der Substratbindung beteiligt. Coenzym F420 bindet in einer Bindetasche, welche 15 Å tief von der Oberfläche bis in das Zentrum des Enzyms hineinreicht. Schwache Wechselwirkungen von F420 zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Proteinhauptkette tragen wesentlich zu seiner Bindung bei. Die in Proteinen selten zu beobachtende nicht-Prolin-cis-Peptidbindung dient der Fixierung des Deazaflavin-Rings an seiner Re-Seite. Diese energetisch instabile cis-Bindung wird durch benachbarte, intramolekulare Wechselwirkungen stabilisiert. Der als Isoalloxazin-Ring bezeichnete Deazaflavin-Ring liegt in einer `gebogenenŽ Konformation vor und weicht um 27° von einer planaren Konformation ab. Der Aceton-Teil des gebundenen F420-Aceton Addukts bindet kovalent am C5 auf der Si-Seite des Deazaflavin-Rings. Mit dieser Hilfe war es möglich, 2-Propanol in das aktive Zentrum des Enzyms zu modellieren. Reste, welche an der Bindung von 2-Propanol und am Hydridtransfer beteiligt sind, wurden identifiziert und zudem wurde ein katalytischer Mechanismus postuliert. Die Kristallstruktur von F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer) aus Methanosarcina barkeri wurde mit gebundenem Coenzym F420 bei einer Auflösung von 2,6 Å ermittelt. Das Enzym liegt als Homotetramer vor. Mer-Monomere haben eine (α/β)8-Tertiärstruktur mit zusätzlichen Insertionsregionen. Innerhalb des aktiven Zentrums bindet F420 hauptsächlich über schwache Wechselwirkungen zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Protein Hauptkette. Ausnahmen sind an der Bindung beteiligte Seitenketten von His36 und Lys161. Die nicht-Prolin-cis-Peptidbindung, an identischer Position zu Adf, fixiert den Deazaflavin-Ring. Der Isoalloxazin-Ring weist in Reduktase Mer die aus Alkohol-Dehydrogenase Adf bekannte gebogene Konformation auf. Ein unbekanntes Molekül bindet kovalent am C5 des Coenzyms. Anhand von Mer-Strukturvergleichen konnte eine F420-bedingte Konformationsänderung in einer flexiblen Domäne einer Insertions-Region beobachtet werden. Zwischen zwei Insertionsregionen des TIM-Barrels bindet Polyethylenglykol, welches als Präzipitant im Kristallisationsansatz vorlag. Die unspezifische Bindung von Polyethylenglykol an einer potentiellen Substratbindestelle in Mer wird im abschließenden Teil dieser Arbeit diskutiert. Aufgrund der Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase und der F420-abhängigen Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase in Abwesenheit und in Gegenwart von F420 wird ein Katalysemechanismus für diese beiden Enzyme vorgeschlagen und F420 in das aktive Zentrum der strukturverwandten bakteriellen Luciferase modelliert. Abschließend wird die in der LuxA-Familie konservierte F420-bzw. FMN-Bindestelle mit der in F420H2:NADP-Oxidoreduktase und 8-HDF-Photolyase verglichen, die weder untereinander noch mit der Luciferase-Familie Sequenzverwandtschaften zeigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit sind in zwei Orginalarbeiten beschrieben, die den Ergebnisteil der Dissertation bilden

Formicamycin biosynthesis involves a unique reductive ring contraction

Fasamycin natural products are biosynthetic precursors of the formicamycins. Both groups of compounds are polyketide natural products that exhibit potent antibacterial activity despite displaying different three-dimensional topologies. We show here that transformation of fasamycin into formicamycin metabolites requires two gene products and occurs via a novel two-step ring expansion-ring contraction pathway. Deletion of forX, encoding a flavin dependent monooxygenase, abolished formicamycin production and leads to accumulation of fasamycin E. Deletion of the adjacent gene forY, encoding a flavin dependent oxidoreductase, also abolished formicamycin biosynthesis and led to the accumulation of new lactone metabolites that represent Baeyer-Villiger oxidation products of the fasamycins. These results identify ForX as a Baeyer-Villiger monooxygenase capable of dearomatizing ring C of the fasamycins. Through in vivo cross feeding and biomimetic semi-synthesis experiments we showed that these lactone products represent biosynthetic intermediates that are reduced to formicamycins in a unique reductive ring contraction reaction catalyzed by ForY

Practices to support co-design processes: A case-study of co-designing a program for children with parents with a mental health problem in the Austrian region of Tyrol

Forms of collaborative knowledge production, such as community-academic partnerships (CAP), have been increasingly used in health care. However, instructions on how to deliver such processes are lacking. We aim to identify practice ingredients for one element within a CAP, a 6-month co-design process, during which 26 community- and 13 research-partners collaboratively designed an intervention programme for children whose parent have a mental illness. Using 22 published facilitating and hindering factors for CAP as the analytical framework, eight community-partners reflected on the activities which took place during the co-design process. From a qualitative content analysis of the data, we distilled essential practices for each CAP factor. Ten community- and eight research-partners revised the results and co-authored this article. We identified 36 practices across the 22 CAP facilitating or hindering factors. Most practices address more than one factor. Many practices relate to workshop design, facilitation methods, and relationship building. Most practices were identified for facilitating ‘trust among partners’, ‘shared visions, goals and/or missions’, ‘effective/frequent communication’, and ‘well-structured meetings’. Fewer practices were observed for ‘effective conflict resolution’, ‘positive community impact’ and for avoiding ‘excessive funding pressure/control struggles’ and ‘high burden of activities’. Co-designing a programme for mental healthcare is a challenging process that requires skills in process management and communication. We provide practice steps for delivering co-design activities. However, practitioners may have to adapt them to different cultural contexts. Further research is needed to analyse whether co-writing with community-partners results in a better research output and benefits for participants

Metabolic Engineering of Cofactor F420 Production in Mycobacterium smegmatis

Cofactor F420 is a unique electron carrier in a number of microorganisms including Archaea and Mycobacteria. It has been shown that F420 has a direct and important role in archaeal energy metabolism whereas the role of F420 in mycobacterial metabolism has only begun to be uncovered in the last few years. It has been suggested that cofactor F420 has a role in the pathogenesis of M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis. In the absence of a commercial source for F420, M. smegmatis has previously been used to provide this cofactor for studies of the F420-dependent proteins from mycobacterial species. Three proteins have been shown to be involved in the F420 biosynthesis in Mycobacteria and three other proteins have been demonstrated to be involved in F420 metabolism. Here we report the over-expression of all of these proteins in M. smegmatis and testing of their importance for F420 production. The results indicate that co–expression of the F420 biosynthetic proteins can give rise to a much higher F420 production level. This was achieved by designing and preparing a new T7 promoter–based co-expression shuttle vector. A combination of co–expression of the F420 biosynthetic proteins and fine-tuning of the culture media has enabled us to achieve F420 production levels of up to 10 times higher compared with the wild type M. smegmatis strain. The high levels of the F420 produced in this study provide a suitable source of this cofactor for studies of F420-dependent proteins from other microorganisms and for possible biotechnological applications

Medium-term seed storage of 50 genera of forage legumes and evidence-based genebank monitoring intervals

Genebanks maintaining seeds for long-term genetic resources conservation monitor seed lots to detect early loss in viability. Monitoring is costly and depletes valuable seed. Three decades of genebank seed germination test results of diverse forage species from 50 legume genera in the International Livestock Research Institute’s medium-term store (circa 8° C with 5 % moisture content) were analysed to determine whether advice on seed monitoring intervals could be derived. Cumulative normal distributions were fitted by probit analysis for each seed lot and compared within each genus. Six patterns of within-genus variation were identified: no detectable trend in germination test results during storage (4 genera); detectable trends, but variable (positive to negative) amongst lots (5); consistent slope of loss in viability amongst lots (17); consistent slope of increase in ability to germinate amongst lots (21); common loss in viability amongst lots (2); common increase in ability to germinate amongst lots (1). Seed lot monitoring intervals for the medium-term store were derived for each of 19 genera with consistent loss in viability across seed lots: three genera provided comparatively rapid deterioration, five met the general expectations for a medium-term store (2-10 years’ maintenance of high viability), whilst 11 provided much better survival. Moreover, 26 further genera provided no evidence as yet of seed deterioration; of these, 22 improved in ability to germinate during storage indicating confounding of hardseededness with viability in germination tests

Effects of grain source and processing methods on the nutritional profile and digestibility of grain amaranth

Amaranth grain is reputed to have a high nutritional value, and as a plant, be tolerant to adverse weather conditions. This suggests that grain amaranth could be useful in tackling malnutrition and the growing burden of cardiometabolic diseases. However, there is insufficient knowledge at present about how the nutrient composition and digestibility of amaranth grain varies with growing environment, crop genotype, and post-harvest processing. We investigated the effect of the source and processing of amaranth grains on the digestibility of protein and lipid present in the grains. There was variation in the composition and digestibility of raw grains from different sources, indicating a role of genotype and/or growing environment which warrants further investigation. The greatest differences in digestibility were measured between the different processing techniques. This indicates that efforts to increase the cultivation and consumption of grain amaranth need to be supported by education about effective processing and preparation techniques

Genomic Characterization of Methanomicrobiales Reveals Three Classes of Methanogens

BACKGROUND:Methanomicrobiales is the least studied order of methanogens. While these organisms appear to be more closely related to the Methanosarcinales in ribosomal-based phylogenetic analyses, they are metabolically more similar to Class I methanogens. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS:In order to improve our understanding of this lineage, we have completely sequenced the genomes of two members of this order, Methanocorpusculum labreanum Z and Methanoculleus marisnigri JR1, and compared them with the genome of a third, Methanospirillum hungatei JF-1. Similar to Class I methanogens, Methanomicrobiales use a partial reductive citric acid cycle for 2-oxoglutarate biosynthesis, and they have the Eha energy-converting hydrogenase. In common with Methanosarcinales, Methanomicrobiales possess the Ech hydrogenase and at least some of them may couple formylmethanofuran formation and heterodisulfide reduction to transmembrane ion gradients. Uniquely, M. labreanum and M. hungatei contain hydrogenases similar to the Pyrococcus furiosus Mbh hydrogenase, and all three Methanomicrobiales have anti-sigma factor and anti-anti-sigma factor regulatory proteins not found in other methanogens. Phylogenetic analysis based on seven core proteins of methanogenesis and cofactor biosynthesis places the Methanomicrobiales equidistant from Class I methanogens and Methanosarcinales. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE:Our results indicate that Methanomicrobiales, rather than being similar to Class I methanogens or Methanomicrobiales, share some features of both and have some unique properties. We find that there are three distinct classes of methanogens: the Class I methanogens, the Methanomicrobiales (Class II), and the Methanosarcinales (Class III)