Molecular interactions between neurotrophins and adenosine receptors at neuronal plasma membranes

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010Brain-­‐derived neurotrophic factor (BDNF) signaling is critical for neuronal development and transmission. Adenosine is a neuromodulator with important actions in the nervous system, and the activation of adenosine A2A receptors has been shown to trigger BDNF effects on synapses. Recruitment of TrkB receptors to lipid rafts has demonstrated to be necessary for the activation of specific signaling pathways and modulation of neurotransmitter release by BDNF. Due to the modulatory role of adenosine on TrkB function, I hypothesized that activation of A2A receptors could influence TrkB receptor localization within the membrane. The data herein described clearly shows that adenosine A2A receptor agonists increased the levels of TrkB receptors in the lipid raft fraction of cortical membranes. Furthermore, A2A receptor activation potentiated BDNF-­‐induced translocation of the phosphorylated TrkB (pTrkB) to lipid rafts. Blockade of the clathrin-­‐ mediated endocytosis with monodansyl cadaverine did not modify the effects of the A2A receptor agonists, but significantly impaired BDNF effects on TrkB recruitment to lipid rafts. The effect of A2A receptor activation in TrkB sublocalization was mimicked by forskolin, an adenylyl cyclase activator; in addition, it was blocked by the PKA inhibitors Rp-­‐cAMPs and PKI-­‐(14-­‐22), and by the Src-­‐family kinase inhibitor PP2. Moreover, removal of endogenous adenosine or disruption of lipid rafts reduced BDNF stimulatory effects on glutamate release from cortical synaptosomes. Lipid raft integrity was also required for the effects of BDNF upon hippocampal long-­‐term potentiation. In conclusion, the data presented here demonstrate, for the first time, a BDNF-­‐independent recruitment of TrkB receptors to lipid rafts, induced by activation of adenosine A2A receptors, with functional consequences for TrkB phosphorylation and BDNF-­‐induced modulation of glutamate release and hippocampal plasticity. The results herein described are relevant for a better understanding on the role of neuromodulators, namely, providing biochemical evidence to explain the cross-­‐talk between A2A and TrkB receptors and highlighting the functional importance of specific membrane domains for the signaling of TrkB receptors.O factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-­‐derived neurotrophic factor) é uma neurotrofina com importantes funções no desenvolvimento e na sobrevivência neuronal. Além das suas funções tróficas, tem sido demonstrado que o BDNF possui funções moduladoras no sistema nervoso, nomeadamente a modulação da transmissão e da plasticidade sináptica. O BDNF exerce as suas funções através da activação de dois receptores: os receptores de alta afinidade TrkB (do inglês tropomyosin-­‐related kinase B), que são receptores tirosina cinase, e os receptores de baixa afinidade p75NTR, que pertencem à superfamília dos receptores do factor de necrose tumoral. As jangadas lipídicas (em inglês, lipid rafts) são microdomínios da membrana plasmática que possuem uma elevada concentração de colesterol e de esfingolípidos, e que concentram receptores específicos e moléculas envolvidas na sinalização celular. Pensa-­‐se que a localização de diversos receptores e proteínas nestes domínios seja essencial para uma sinalização celular eficiente, mas a regulação da movimentação de proteínas para as jangadas lipídicas ainda não é bem compreendida. Sabe-­‐se que o BDNF induz o recrutamento de receptores TrkB para as jangadas lipídicas; sabe-­‐se também que a localização dos receptores TrkB nas jangadas lipídicas é necessária para a activação de algumas vias de sinalização bem como para os efeitos do BDNF na modulação da libertação de glutamato e da fadiga sináptica no hipocampo. Nos últimos anos, tem sido demonstrado que os receptores TrkB têm a sua função modulada pela activação dos receptores A2A da adenosina. A adenosina é um importante neuromodulador no sistema nervoso central, e os seus receptores estão distribuídos por várias áreas do cérebro. O objectivo do trabalho descrito nesta tese foi perceber o papel dos receptores A2A da adenosina na translocação de receptores TrkB para as jangadas lipídicas e as possíveis consequências funcionais derivadas deste recrutamento de receptores TrkB para domínios específicos da membrana. Utilizou-­‐se uma abordagem molecular e de fraccionamento celular para o isolamento das jangadas lipídicas e marcação de receptores, bem como uma abordagem funcional em que se avaliou a libertação de neurotransmissores por métodos neuroquímicos e a transmissão sináptica por métodos electrofisiológicos. Neurónios corticais foram pré-­‐incubadas na presença ou ausência de um agonista e/ou um antagonista selectivo para os receptores A2A da adenosina, e de seguida foram incubadas com BDNF. Após o tratamento, os neurónios foram lisados e as jangadas lipídicas foram isoladas e analisadas pela técnica de Western blot. Em neurónios incubados com o agonista do receptor A2A da adenosina, CGS 21680 (20 nM), observou-­‐se um aumento dos níveis de receptores TrkB na fracção das jangadas lipídicas de membranas corticais isoladas de neurónios em cultura. O antagonista dos receptores A2A, ZM 241385 (50 nM), não alterou os níveis basais de receptores TrkB nas jangadas lipídicas, mas preveniu a acção do agonista CGS 21680. Além disso, a pré-­‐activação dos receptores A2A da adenosina induziu uma potenciação da translocação de receptores TrkB fosforilados para as jangadas lipídicas induzida pelo BDNF. O antagonista do receptor A2A não modulou os efeitos do BDNF, mas preveniu o efeito do agonista destes receptores. Após a incubação das células com CGS 21680 e BDNF, os níveis de receptores TrkB localizados nas jangadas correspondeu à soma dos efeitos de cada um dos agonistas separadamente, sendo portanto os seus efeitos aditivos, e possivelmente dependentes de mecanismos de sinalização distintos. Para estudar os mecanismos envolvidos no efeito dos agonistas do receptor A2A da adenosina na translocação do receptor TrkB para as jangadas lipídicas, investigou-­‐se o efeito do agonista do receptor A2A, CGS 21680 (20 nM), e do BDNF (20 ng/ml) na presença de um inibidor da endocitose dependente de clatrina, a monodansilcadaverina (100 μM). A pré-­‐incubação de neurónios corticais com a monodansilcadaverina não modificou o efeito do CGS 21680, mas reduziu significativamente o efeito do BDNF no recrutamento de receptores TrkB para as jangadas lipídicas, indicando que o efeito dos agonistas do receptor A2A e do BDNF envolvem mecanismos diferentes. As vias de sinalização activadas pelo receptor A2A envolvidas na translocação dos receptores TrkB também foram investigadas. O efeito do CGS 21680 na localização subcelular dos receptores TrkB foi mimetizado por forscolina (5 μM), um activador da adenilato ciclase; os efeitos da forscolina e do CGS 21680 não foram aditivos, o que sugere o envolvimento de vias de sinalização comuns para os dois compostos. Além disso, o efeito do CGS 21680 na translocação dos receptores TrkB foi bloqueado pelos inibidores da PKA, Rp-­‐cAMPs (100 μM) e PKI-­‐(14-­‐ 22) (1 μM), e pelo inibidor das cinases da família das Src PP2 (500 nM). Por outro lado, o inibidor da fosfolipase C U73122 (5 μM) não preveniu o efeito do CGS 21680 (20 nM) no recrutamento de receptores TrkB para as jangadas lipídicas. Na segunda fase deste trabalho, investigaram-­‐se as possíveis consequências funcionais dos resultados obtidos nas culturas de neurónios. Para o efeito, utilizaram-­‐se terminações nervosas isoladas (sinaptossomas) de tecido cortical e avaliou-­‐se o papel modulador da adenosina e a importância das jangadas lipídicas sobre a acção do BDNF na libertação de glutamato. O BDNF (20 ng/ml) induziu um aumento da libertação de glutamato induzida por K+ (15 mM). Este aumento foi totalmente prevenido pela superfusão dos sinaptossomas com adenosina desaminase (1 U/ml), enzima que degrada a adenosina extracelular, criando portanto uma condição de ausência de adenosina endógena. Na presença de adenosina desaminase, a incubação com o agonista selectivo dos receptores A2A, CGS 21680 (20 nM), foi capaz de restaurar os efeitos do BDNF na libertação de glutamato, reforçando a conclusão anterior de que a activação de receptores A2A é imprescindível para a acção do BDNF sobre a libertação de glutamato. Para estudar a importância das jangadas lipídicas para os efeitos do BDNF na libertação de glutamato, os sinaptossomas corticais foram incubados com metil-­‐β-­‐ciclodextrina (1 mM), que promove a desorganização das jangadas lipídicas por remover o colesterol das membranas. Nestas condições, o efeito do BDNF foi significativamente reduzido quando comparado com o efeito do BDNF sozinho. A integridade das jangadas lipídicas também foi comprometida pela incubação dos sinaptossomas com a enzima colesterol oxidase (1 U/ml), que oxida o colesterol e impede a disposição estrutural normal dos lípidos nestes domínios, e nestas condições o efeito do BDNF na libertação de glutamato foi totalmente prevenido. Uma função relevante do BDNF na actividade sináptica, que decorre da sua capacidade de aumentar a libertação de glutamato, é o aumento da plasticidade sináptica. Como se sabia de estudos anteriores que esta acção do BDNF requer co-­‐activação de receptores A2A da adenosina, investigou-­‐se a dependência das jangadas lipídicas no efeito facilitatório do BDNF na plasticidade sináptica. Utilizaram-­‐se para este fim fatias de hipocampo de rato. Primeiro investigou-­‐se a localização dos receptores TrkB nas jangadas lipídicas após a estimulação de fatias com salvas de estímulos a frequências elevadas, portanto em condições que induzem actividade neuronal intensa e plasticidade sináptica; observou-­‐se que em fatias sujeitas a estas condições, há maior densidade de receptores TrkB nas jangadas lipídicas, sugerindo que a actividade neuronal intensa promove a translocação dos receptores TrkB para estes domínios da membrana. Quando a adenosina endógena foi eliminada pela incubação das fatias com adenosina desaminase, o efeito da estimulação neuronal foi totalmente prevenido, indicando que a translocação de receptores induzida pela actividade neuronal depende da adenosina extracelular. Analisou-­‐se, então, a importância das jangadas lipídicas na acção do BDNF sobre a plasticidade sináptica. Usou-­‐se um modelo clássico de plasticidade sináptica, a potenciação de longa duração (LTP, do inglês long-­‐term potentiation). Assim, avaliou-­‐se o aumento duradouro de potenciais pós-­‐sinápticos excitatórios (EPSPs, do inglês excitatory postsynaptic potentials) induzido por uma breve salva de estímulos aplicados a frequência elevada. Foi observado que o BDNF aumenta a LTP, como descrito em trabalhos anteriores. A perfusão de fatias do hipocampo com uma baixa concentração de metil-­‐β-­‐ciclodextrina (1 mM, que não afectou per se a magnitude da LTP) preveniu totalmente os efeitos estimulatórios do BDNF na potenciação de longa duração, o que sugere que a integridade das jangadas lipídicas é essencial para o aumento da magnitude da LTP induzido pelo BDNF. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a activação dos receptores A2A da adenosina induzem um recrutamento de receptores TrkB para as jangadas lipídicas, com repercussões funcionais observáveis na fosforilação do receptor TrkB, na modulação da libertação de glutamato e na plasticidade sináptica do hipocampo. Assim, propõe-­‐se que a facilitação do recrutamento dos receptores TrkB para as jangadas lipídicas seja um dos principais mecanismos pelos quais os receptores A2A da adenosina facilitam as acções neuromoduladoras do BDNF.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); BDNF; The experimental work described in this thesis was performed at the Institute of Pharmacology and Neuroscience, Faculty of Medicine and Unit of Neuroscience, Institute of Molecular Medicin