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Activation of adenosine A2A receptors induces TrkB translocation and increases BDNF-mediated phospho-TrkB localization in lipid rafts : implications for neuromodulation
Copyright © 2010 the authorsBrain-derived neurotrophic factor (BDNF) signaling is critical for neuronal development and transmission. Recruitment of TrkB receptors to lipid rafts has been hown to be necessary for the activation of specific signaling pathways and modulation of neurotransmitter release by BDNF. Since TrkB receptors are known to be modulated by adenosine A2A receptor activation, we hypothesized that activation of A2A receptors could influence TrkB receptor localization among different membrane microdomains. We found that adenosine A2A receptor agonists increased the levels of TrkB receptors in the lipid raft fraction of cortical membranes and potentiated BDNF-induced augmentation of phosphorylated TrkB levels in lipid rafts. Blockade of the clathrin-mediated endocytosis with monodansylcadaverine(100µM) did not modify the effects of theA2A receptor agonists but significantly impairedBDNFeffects on TrkB recruitment to lipid rafts.
The effect of A2A receptor activation in TrkB localization was mimicked by 5 µM forskolin, an adenylyl cyclase activator. Also, it was blocked by the PKA inhibitors Rp-cAMPs and PKI-(14 –22), and by the Src-family kinase inhibitor PP2. Moreover, removal of endogenous adenosine or disruption of lipid rafts reduced BDNF stimulatory effects on glutamate release from cortical synaptosomes.
Lipid raft integrity was also required for the effects of BDNF on hippocampal long-term potentiation at CA1 synapses. Our data
demonstrate, for the first time, a BDNF-independent recruitment of TrkB receptors to lipid rafts induced by activation of adenosine A2A receptors, with functional consequences for TrkB phosphorylation and BDNF-induced modulation of neurotransmitter
release and hippocampal plasticity.Supported by Fundacão para a Ciência e a Tecnologia (SFRH/BD/21374/2005 for N.A.L., SFRH/BD/21359/2005 for V.C.S., and SFRH/BPD/11528/2002 for D.B.P.) and by the European Union [European Cooperation in Science and Technology (COST) COST B30 concerted action, Neural Regeneration and Plasticity (NEREPLAS)]
Molecular interactions between neurotrophins and adenosine receptors at neuronal plasma membranes
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010Brain-‐derived
neurotrophic
factor
(BDNF)
signaling
is
critical
for
neuronal
development
and
transmission.
Adenosine
is
a
neuromodulator
with
important
actions
in
the
nervous
system,
and
the
activation
of
adenosine
A2A
receptors
has
been
shown
to
trigger
BDNF
effects
on
synapses.
Recruitment
of
TrkB
receptors
to
lipid
rafts
has
demonstrated
to
be
necessary
for
the
activation
of
specific
signaling
pathways
and
modulation
of
neurotransmitter
release
by
BDNF.
Due
to
the
modulatory
role
of
adenosine
on
TrkB
function,
I
hypothesized
that
activation
of
A2A
receptors
could
influence
TrkB
receptor
localization
within
the
membrane.
The
data
herein
described
clearly
shows
that
adenosine
A2A
receptor
agonists
increased
the
levels
of
TrkB
receptors
in
the
lipid
raft
fraction
of
cortical
membranes.
Furthermore,
A2A
receptor
activation
potentiated
BDNF-‐induced
translocation
of
the
phosphorylated
TrkB
(pTrkB)
to
lipid
rafts.
Blockade
of
the
clathrin-‐
mediated
endocytosis
with
monodansyl
cadaverine
did
not
modify
the
effects
of
the
A2A
receptor
agonists,
but
significantly
impaired
BDNF
effects
on
TrkB
recruitment
to
lipid
rafts.
The
effect
of
A2A
receptor
activation
in
TrkB
sublocalization
was
mimicked
by
forskolin,
an
adenylyl
cyclase
activator;
in
addition,
it
was
blocked
by
the
PKA
inhibitors
Rp-‐cAMPs
and
PKI-‐(14-‐22),
and
by
the
Src-‐family
kinase
inhibitor
PP2.
Moreover,
removal
of
endogenous
adenosine
or
disruption
of
lipid
rafts
reduced
BDNF
stimulatory
effects
on
glutamate
release
from
cortical
synaptosomes.
Lipid
raft
integrity
was
also
required
for
the
effects
of
BDNF
upon
hippocampal
long-‐term
potentiation.
In
conclusion,
the
data
presented
here
demonstrate,
for
the
first
time,
a
BDNF-‐independent
recruitment
of
TrkB
receptors
to
lipid
rafts,
induced
by
activation
of
adenosine
A2A
receptors,
with functional
consequences
for
TrkB
phosphorylation
and
BDNF-‐induced
modulation
of
glutamate
release
and
hippocampal
plasticity.
The
results
herein
described
are
relevant
for
a
better
understanding
on
the
role
of
neuromodulators,
namely,
providing
biochemical
evidence
to
explain
the
cross-‐talk
between
A2A
and
TrkB
receptors
and
highlighting
the
functional
importance
of
specific
membrane
domains
for
the
signaling
of
TrkB
receptors.O
factor
neurotrófico
derivado
do
cérebro
(BDNF,
do
inglês
brain-‐derived
neurotrophic
factor)
é
uma
neurotrofina
com
importantes
funções
no
desenvolvimento
e
na
sobrevivência
neuronal.
Além
das
suas
funções
tróficas,
tem
sido
demonstrado
que
o
BDNF
possui
funções
moduladoras
no
sistema
nervoso,
nomeadamente
a
modulação
da
transmissão
e
da
plasticidade
sináptica.
O
BDNF
exerce
as
suas
funções
através
da
activação
de
dois
receptores:
os
receptores
de
alta
afinidade
TrkB
(do
inglês
tropomyosin-‐related
kinase
B),
que
são
receptores
tirosina
cinase,
e
os
receptores
de
baixa
afinidade
p75NTR,
que
pertencem
à
superfamília
dos
receptores
do
factor
de
necrose
tumoral.
As
jangadas
lipídicas
(em
inglês,
lipid
rafts)
são
microdomínios
da
membrana
plasmática
que
possuem
uma
elevada
concentração
de
colesterol
e
de
esfingolípidos,
e
que
concentram
receptores
específicos
e
moléculas
envolvidas
na
sinalização
celular.
Pensa-‐se
que
a
localização
de
diversos
receptores
e
proteínas
nestes
domínios
seja
essencial
para
uma
sinalização
celular
eficiente,
mas
a
regulação
da
movimentação
de
proteínas
para
as
jangadas
lipídicas
ainda
não
é
bem
compreendida.
Sabe-‐se
que
o
BDNF
induz
o
recrutamento
de
receptores
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas;
sabe-‐se
também
que
a
localização
dos
receptores
TrkB
nas
jangadas
lipídicas
é
necessária
para
a
activação
de
algumas
vias
de
sinalização
bem
como
para
os
efeitos
do
BDNF
na
modulação
da
libertação
de
glutamato
e
da
fadiga
sináptica
no
hipocampo.
Nos
últimos
anos,
tem
sido
demonstrado
que
os
receptores
TrkB
têm
a
sua
função
modulada
pela
activação
dos
receptores
A2A
da
adenosina.
A
adenosina
é
um
importante
neuromodulador
no
sistema
nervoso
central,
e
os
seus
receptores
estão
distribuídos
por
várias
áreas
do
cérebro. O
objectivo
do
trabalho
descrito
nesta
tese
foi
perceber
o
papel
dos
receptores
A2A
da
adenosina
na
translocação
de
receptores
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas
e
as
possíveis
consequências
funcionais
derivadas
deste
recrutamento
de
receptores
TrkB
para
domínios
específicos
da
membrana.
Utilizou-‐se
uma
abordagem
molecular
e
de
fraccionamento
celular
para
o
isolamento
das
jangadas
lipídicas
e
marcação
de
receptores,
bem
como
uma
abordagem
funcional
em
que
se
avaliou
a
libertação
de
neurotransmissores
por
métodos
neuroquímicos
e
a
transmissão
sináptica
por
métodos
electrofisiológicos.
Neurónios
corticais
foram
pré-‐incubadas
na
presença
ou
ausência
de
um
agonista
e/ou
um
antagonista
selectivo
para
os
receptores
A2A
da
adenosina,
e
de
seguida
foram
incubadas
com
BDNF.
Após
o
tratamento,
os
neurónios
foram
lisados
e
as
jangadas
lipídicas
foram
isoladas
e
analisadas
pela
técnica
de
Western
blot.
Em
neurónios
incubados
com
o
agonista
do
receptor
A2A
da
adenosina,
CGS
21680
(20
nM),
observou-‐se
um
aumento
dos
níveis
de
receptores
TrkB
na
fracção
das
jangadas
lipídicas
de
membranas
corticais
isoladas
de
neurónios
em
cultura.
O
antagonista
dos
receptores
A2A,
ZM
241385
(50
nM),
não
alterou
os
níveis
basais
de
receptores
TrkB
nas
jangadas
lipídicas,
mas
preveniu
a
acção
do
agonista
CGS
21680.
Além
disso,
a
pré-‐activação
dos
receptores
A2A
da
adenosina
induziu
uma
potenciação
da
translocação
de
receptores
TrkB
fosforilados
para
as
jangadas
lipídicas
induzida
pelo
BDNF.
O
antagonista
do
receptor
A2A
não
modulou
os
efeitos
do
BDNF,
mas
preveniu
o
efeito
do
agonista
destes
receptores.
Após
a
incubação
das
células
com
CGS
21680
e
BDNF,
os
níveis
de
receptores
TrkB
localizados
nas
jangadas
correspondeu
à
soma
dos
efeitos
de
cada
um
dos
agonistas
separadamente,
sendo
portanto
os seus
efeitos
aditivos,
e
possivelmente
dependentes
de
mecanismos
de
sinalização
distintos.
Para
estudar
os
mecanismos
envolvidos
no
efeito
dos
agonistas
do
receptor
A2A
da
adenosina
na
translocação
do
receptor
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas,
investigou-‐se
o
efeito
do
agonista
do
receptor
A2A,
CGS
21680
(20
nM),
e
do
BDNF
(20
ng/ml)
na
presença
de
um
inibidor
da
endocitose
dependente
de
clatrina,
a
monodansilcadaverina
(100
μM).
A
pré-‐incubação
de
neurónios
corticais
com
a
monodansilcadaverina
não
modificou
o
efeito
do
CGS
21680,
mas
reduziu
significativamente
o
efeito
do
BDNF
no
recrutamento
de
receptores
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas,
indicando
que
o
efeito
dos
agonistas
do
receptor
A2A
e
do
BDNF
envolvem
mecanismos
diferentes.
As
vias
de
sinalização
activadas
pelo
receptor
A2A
envolvidas
na
translocação
dos
receptores
TrkB
também
foram
investigadas.
O
efeito
do
CGS
21680
na
localização
subcelular
dos
receptores
TrkB
foi
mimetizado
por
forscolina
(5
μM),
um
activador
da
adenilato
ciclase;
os
efeitos
da
forscolina
e
do
CGS
21680
não
foram
aditivos,
o
que
sugere
o
envolvimento
de
vias
de
sinalização
comuns
para
os
dois
compostos.
Além
disso,
o
efeito
do
CGS
21680
na
translocação
dos
receptores
TrkB
foi
bloqueado
pelos
inibidores
da
PKA,
Rp-‐cAMPs
(100
μM)
e
PKI-‐(14-‐
22)
(1
μM),
e
pelo
inibidor
das
cinases
da
família
das
Src
PP2
(500
nM).
Por
outro
lado,
o
inibidor
da
fosfolipase
C
U73122
(5
μM)
não
preveniu
o
efeito
do
CGS
21680
(20
nM)
no
recrutamento
de
receptores
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas.
Na
segunda
fase
deste
trabalho,
investigaram-‐se
as
possíveis
consequências
funcionais
dos
resultados
obtidos
nas
culturas
de
neurónios.
Para
o
efeito,
utilizaram-‐se
terminações
nervosas
isoladas
(sinaptossomas)
de
tecido
cortical
e
avaliou-‐se
o
papel
modulador
da adenosina
e
a
importância
das
jangadas
lipídicas
sobre
a
acção
do
BDNF
na
libertação
de
glutamato.
O
BDNF
(20
ng/ml)
induziu
um
aumento
da
libertação
de
glutamato
induzida
por
K+
(15
mM).
Este
aumento
foi
totalmente
prevenido
pela
superfusão
dos
sinaptossomas
com
adenosina
desaminase
(1
U/ml),
enzima
que
degrada
a
adenosina
extracelular,
criando
portanto
uma
condição
de
ausência
de
adenosina
endógena.
Na
presença
de
adenosina
desaminase,
a
incubação
com
o
agonista
selectivo
dos
receptores
A2A,
CGS
21680
(20
nM),
foi
capaz
de
restaurar
os
efeitos
do
BDNF
na
libertação
de
glutamato,
reforçando
a
conclusão
anterior
de
que
a
activação
de
receptores
A2A
é
imprescindível
para
a
acção
do
BDNF
sobre
a
libertação
de
glutamato.
Para
estudar
a
importância
das
jangadas
lipídicas
para
os
efeitos
do
BDNF
na
libertação
de
glutamato,
os
sinaptossomas
corticais
foram
incubados
com
metil-‐β-‐ciclodextrina
(1
mM),
que
promove
a
desorganização
das
jangadas
lipídicas
por
remover
o
colesterol
das
membranas.
Nestas
condições,
o
efeito
do
BDNF
foi
significativamente
reduzido
quando
comparado
com
o
efeito
do
BDNF
sozinho.
A
integridade
das
jangadas
lipídicas
também
foi
comprometida
pela
incubação
dos
sinaptossomas
com
a
enzima
colesterol
oxidase
(1
U/ml),
que
oxida
o
colesterol
e
impede
a
disposição
estrutural
normal
dos
lípidos
nestes
domínios,
e
nestas
condições
o
efeito
do
BDNF
na
libertação
de
glutamato
foi
totalmente
prevenido.
Uma
função
relevante
do
BDNF
na
actividade
sináptica,
que
decorre
da
sua
capacidade
de
aumentar
a
libertação
de
glutamato,
é
o
aumento
da
plasticidade
sináptica.
Como
se
sabia
de
estudos
anteriores
que
esta
acção
do
BDNF
requer
co-‐activação
de
receptores
A2A
da
adenosina,
investigou-‐se
a
dependência
das
jangadas
lipídicas
no
efeito
facilitatório
do
BDNF
na
plasticidade
sináptica.
Utilizaram-‐se
para
este fim
fatias
de
hipocampo
de
rato.
Primeiro
investigou-‐se
a
localização
dos
receptores
TrkB
nas
jangadas
lipídicas
após
a
estimulação
de
fatias
com
salvas
de
estímulos
a
frequências
elevadas,
portanto
em
condições
que
induzem
actividade
neuronal
intensa
e
plasticidade
sináptica;
observou-‐se
que
em
fatias
sujeitas
a
estas
condições,
há
maior
densidade
de
receptores
TrkB
nas
jangadas
lipídicas,
sugerindo
que
a
actividade
neuronal
intensa
promove
a
translocação
dos
receptores
TrkB
para
estes
domínios
da
membrana.
Quando
a
adenosina
endógena
foi
eliminada
pela
incubação
das
fatias
com
adenosina
desaminase,
o
efeito
da
estimulação
neuronal
foi
totalmente
prevenido,
indicando
que
a
translocação
de
receptores
induzida
pela
actividade
neuronal
depende
da
adenosina
extracelular.
Analisou-‐se,
então,
a
importância
das
jangadas
lipídicas
na
acção
do
BDNF
sobre
a
plasticidade
sináptica.
Usou-‐se
um
modelo
clássico
de
plasticidade
sináptica,
a
potenciação
de
longa
duração
(LTP,
do
inglês
long-‐term
potentiation).
Assim,
avaliou-‐se
o
aumento
duradouro
de
potenciais
pós-‐sinápticos
excitatórios
(EPSPs,
do
inglês
excitatory
postsynaptic
potentials)
induzido
por
uma
breve
salva
de
estímulos
aplicados
a
frequência
elevada.
Foi
observado
que
o
BDNF
aumenta
a
LTP,
como
descrito
em
trabalhos
anteriores.
A
perfusão
de
fatias
do
hipocampo
com
uma
baixa
concentração
de
metil-‐β-‐ciclodextrina
(1
mM,
que
não
afectou
per
se
a
magnitude
da
LTP)
preveniu
totalmente
os
efeitos
estimulatórios
do
BDNF
na
potenciação
de
longa
duração,
o
que
sugere
que
a
integridade
das
jangadas
lipídicas
é
essencial
para
o
aumento
da
magnitude
da
LTP
induzido
pelo
BDNF.
Em
conclusão,
os
resultados
obtidos
neste
trabalho
demonstram
que
a
activação
dos
receptores
A2A
da
adenosina
induzem
um
recrutamento
de
receptores
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas,
com
repercussões
funcionais
observáveis
na
fosforilação
do
receptor
TrkB, na
modulação
da
libertação
de
glutamato
e
na
plasticidade
sináptica
do
hipocampo.
Assim,
propõe-‐se
que
a
facilitação
do
recrutamento
dos
receptores
TrkB
para
as
jangadas
lipídicas
seja
um
dos
principais
mecanismos
pelos
quais
os
receptores
A2A
da
adenosina
facilitam
as
acções
neuromoduladoras
do
BDNF.Fundação
para
a
Ciência
e
a
Tecnologia
(FCT);
BDNF; The
experimental
work
described
in
this
thesis
was
performed
at
the
Institute
of
Pharmacology
and
Neuroscience,
Faculty
of
Medicine
and
Unit
of
Neuroscience,
Institute
of
Molecular
Medicin
Regulation of hippocampal cannabinoid CB1 receptor actions by adenosine A1 receptors and chronic caffeine administration : implications for the effects of Δ9-tetrahydrocannabinol on spatial memory
The cannabinoid CB(1) receptor-mediated modulation of γ-aminobutyric acid (GABA) release from inhibitory interneurons is important for the integrity of hippocampal-dependent spatial memory. Although adenosine A(1) receptors have a central role in fine-tuning excitatory transmission in the hippocampus, A(1) receptors localized in GABAergic cells do not directly influence GABA release. CB(1) and A(1) receptors are the main targets for the effects of two of the most heavily consumed psychoactive substances worldwide: Δ(9)-tetrahydrocannabinol (THC, a CB(1) receptor agonist) and caffeine (an adenosine receptor antagonist). We first tested the hypothesis that an A(1)-CB(1) interaction influences GABA and glutamate release in the hippocampus. We found that A(1) receptor activation attenuated the CB(1)-mediated inhibition of GABA and glutamate release and this interaction was manifested at the level of G-protein activation. Using in vivo and in vitro approaches, we then investigated the functional implications of the adenosine-cannabinoid interplay that may arise following chronic caffeine consumption. Chronic administration of caffeine in mice (intraperitoneally, 3 mg/kg/day, for 15 days, >12 h before trials) led to an A(1)-mediated enhancement of the CB(1)-dependent acute disruptive effects of THC on a short-term spatial memory task, despite inducing a reduction in cortical and hippocampal CB(1) receptor number and an attenuation of CB(1) coupling with G protein. A(1) receptor levels were increased following chronic caffeine administration. This study shows that A(1) receptors exert a negative modulatory effect on CB(1)-mediated inhibition of GABA and glutamate release, and provides the first evidence of chronic caffeine-induced alterations on the cannabinoid system in the cortex and hippocampus, with functional implications in spatial memory