Pharmacological characterization of compounds that alter H2S levels

Hydrogen sulfide (H2S), is a signaling molecule with multiple modes of action andbiological functions. It regulates physiological processes such as vascular tone,angiogenesis and neurotransmission, but deregulation of its production is implicatedin pathologies such as neurodegeneration, cancer and endocrine disorders.Endogenous hydrogen sulfide is in major part generated by two pyridoxal-5´-phosphate-dependent enzymes, cystathionine-γ-lyase (CSE) and cystathionine-β-synthase (CBS), both using L-cysteine as the main substrate. Another enzymaticpathway involves the conversion of 3-mercaptopyruvate to hydrogen sulfide andpyruvate by 3-mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST. The lack of usefulpharmacological research tools, such as potent and selective inhibitors for eachenzyme, or stimulators of the enzyme (i.e. distinct from H2S donors), has a negativeimpact on research addressing the translational potential of hydrogen sulfide and themechanism of its action.In order to fill this gap, we carried out an in vitro screening, using in-house purifiedrecombinant enzymes, of several new compounds that have been specificallysynthesized as potential inhibitors for CBS and CSE. We also screened a collection of1280 clinically used drugs and well-annotated pharmacological compounds (LOPAClibrary). After that we conducted a more extensive pharmacological characterizationof selected compounds in order to establish their selectivity.We found that the newly synthesized compounds, Hydrazino-glycine and Hydrazino-L-alanine, inhibit both CBS and CSE, displaying limited selectivity, so that they couldbecome the base for synthesis of more selective inhibitors of these enzymes. We alsoobserved that the IC50 of AVG for CSE is 1μM, making AVG the most potentavailable inhibitor for this enzyme. Initial hits from the LOPAC library screeningwere further examined. Our results showed that doxycycline and demeclocyclinecould be used as useful (in low concentrations selective) inhibitors for 3MST,especially since there are currently no selective annotated inhibitors for this enzyme.An additional purpose of the current study was to investigate the effect of theallosteric CBS activator S-adenosyl-L-methionine (SAM) on the proliferation of theCBS-hyperexpressing colon cancer cell line HCT116. The non-transformed, nontumorigeniccolon epithelial cell line NCM356 was used as control. SAM exertedtime- and concentration-dependent modulatory effects on cell proliferation. At 0,1–1mM SAM increased HCT116 proliferation between 0 and 12 h, while the highestSAM concentration (3mM) inhibited proliferation. These short-term stimulatoryeffects of SAM were attenuated by the CBS inhibitor AOAA or by stable silencing ofCBS via shRNA. In contrast, the inhibitory effects of SAM on cell proliferation wasunaffected by CBS inhibition or CBS silencing. In addition, SAM failed to exert thestimulatory effects on NCM356 proliferation, although the SAM-induced suppressionof NCM356 proliferation was maintained. We conclude that a significant portion ofSAM’s pro- proliferative effects seen in the current study are, in fact, related toincreased endogenous H2S production via CBS; however, the long-term growthinhibitory/antitumor effects of SAM involve CBS/H2S-independent mechanisms.Collectively, our study resulted in a) the identification and characterization ofcompounds, among them approved drugs (tetracyclines), as selective (in certainconcentrations) inhibitors of H2S-synthesizing enzymes, thus providing initialstructures for optimization of their potency and selectivity in the future, and b) theextensive characterization of the role of the allosteric CBS activator SAM, on theproliferation of the CBS-hyperexpressing colon cancer cells.Το υδρόθειο (H2S), είτε ενδογενώς παραγόμενο είτε εξωγενώς χορηγούμενο (μέσω«δοτών»), αποτελεί ένα σηματοδοτικό μόριο, με πλειοτροπικές και πολυπαραγοντικές βιολογικές δράσεις. Το H2S επηρεάζει διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως τη ρύθμιση του αγγειακού τόνου, την αγγειογένεση και τη νευροδιαβίβαση, αλλά απορρύθμιση της παραγωγής του μπορεί να οδηγήσει και σε παθολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστικές καταστάσεις, καρκίνο, κυκλοφορικές καιενδοκρινικές διαταραχές. Η βιοσύνθεσή του γίνεται από ένζυμα του μεταβολισμούτης L-κυστεΐνης, τη β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (cystathionine β synthase, CBS)και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine γ lyase, CSE) καθώς και από το ένζυμο σουλφοτρανσφεράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-mercaptopyruvatesulphurtransferase, 3MST). Τα δύο πρώτα ένζυμα χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα τοαμινοξύ L-κυστεΐνη ή/και την ομοκυστεΐνη και η δράση τους εξαρτάται από το συνένζυμο φωσφορική πυριδοξάλη (pyridoxal-5’-phosphate, PLP). Το ένζυμο 3MSTκαταλύει την αντίδραση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού σε πυροσταφυλικό και H2S.Η επαρκής τεκμηρίωση του ρόλου του υδροθείου στη φυσιολογία και παθολογία,αλλά και η εξακρίβωση των μηχανισμών δράσης του, δυσχεραίνεται από την έλλειψη των απαραίτητων φαρμακολογικών εργαλείων, όπως πχ εκλεκτικών αναστολέων καθενός από τα τρία ένζυμα της βιοσύνθεσής του ή ενεργοποιητών της ενδογενούς παραγωγής, δηλ. διακριτών απο τους δότες H2S.Για να καλύψουμε αυτό το σημαντικό κενό, στην παρούσα διατριβή αρχικά μελετήσαμε in vitro σε απομονωμένα ένζυμα, νέες ενώσεις που συντέθηκαν βάσει σχεδιασμού ως πιθανοί αναστολείς για τα ένζυμα CBS και CSE, αλλά και εμπορικά διαθέσιμες ουσίες από τη βιβλιοθήκη 1280 ενώσεων LOPAC (Library ofPharmacologically Active Compounds), ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουντα ένζυμα βιοσύνθεσης του υδροθείου. Στη συνέχεια έγινε πιο εκτεταμένος φαρμακολογικός χαρακτηρισμός επιλεγμένων ενώσεων για τυχόν εκλεκτική ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων CBS, CSE και 3MST.Από τη μελέτη μας βρέθηκε πως οι νεοσυντεθείσες ενώσεις Hydrazino-glycine καιHydrazino-L-alanine, αν και με περιορισμένη εκλεκτικότητα, αναστέλλουν τα ένζυμαCBS και CSE, και θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως αρχικές ενώσεις για τον σχεδιασμό ακόμη πιο εκλεκτικών φαρμακολογικών αναστολέων των ενζύμων αυτών.Στις in vitro δοκιμές μας παρατηρήθηκε επίσης, ότι η ένωση Aminoethoxyvinylglycine(AVG) αναστέλλει εκλεκτικά το ένζυμο CSE έναντι του CBS με IC50: 1,0 ±0,1μΜ, γεγονός που την καθιστά ως τον πιο δραστικό και εκλεκτικό ταυτοχρόνως αναστολέα του ενζύμου CSE που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα. Επίσης, από τα αποτελέσματα της σάρωσης της βιβλιοθήκης LOPAC, προέκυψαν μερικές ενώσεις(hits) ως εν δυνάμει αναστολείς, οι οποίες μπορούν να χρησιμεύσουν ως βάση για τη σύνθεση αναλόγων ή νέων ουσιών που να έχουν εκλεκτικά ανασταλτική δράση έναντι των ενζύμων CBS ή 3ΜSΤ. Βάσει των ευρημάτων μας, η δοξυκυκλίνη και ηδεμεκλοκυκλίνη μπορεί να θεωρηθούν ως χρήσιμοι, σε μικρές συγκεντρώσεις εκλεκτικοί, αναστολείς του ενζύμου 3ΜSΤ, για το οποίο μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν επαρκώς χαρακτηρισμένοι εκλεκτικοί αναστολείς. Από εκτενή μελέτη άλλων τετρακυκλινών δεν προέκυψαν άλλα μόρια με παρόμοια δραστικότητα.Θέλοντας να ερευνήσουμε την επίδραση σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες της τροποποίησης των επιπέδων του ενδογενώς παραγόμενου υδροθείου,χρησιμοποιήσαμε την S-αδενόσυλο-L-μεθειονίνη (S-adenosyl-L-methionine, SAM),έναν αλλοστερικό ενεργοποιητή του ενζύμου CBS, και την εξετάσαμε σε σχέση μετον έλεγχο του πολλαπλασιασμού σε φυσιολογικά και καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου. Διαπιστώσαμε πως, σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0,1-1mM), σε έκθεση 12 ωρών, η SAM επάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων HCT116, τα οποία υπερεκφράζουν το CBS, ενώ σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση του CBS, όπως τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου NCM356, και σε HCT116 κύτταρα που ανεστάλη φαρμακολογικά (ή μέσω shRNA) το ένζυμο CBS, η SAM δεν επάγει τον πολλαπλασιασμό. Αντιθέτως, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (3mM) και μεγαλύτερης διάρκειας έκθεση (12-24h), η SAM παρουσιάζει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό, η οποία μάλιστα διατηρείται και στα NCM356 κύτταρα με μειωμένη έκφραση του CBS και σε κύτταρα που ανεστάλη φαρμακολογικά (ή μέσωshRNA) το CBS. Επομένως, συμπεραίνουμε πως η αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από τη SAM (χαμηλές συγκεντρώσεις) εξαρτάται από την αυξημένη παρουσία και ενεργότητα του CBS, ενώ οι ανασταλτικές δράσεις της πιθανόν οφείλονται σε μηχανισμούς ανεξάρτητους από το μονοπάτι CBS/H2S.Συνολικά, η παρούσα εργασία κατέληξε α) στην αναγνώριση και χαρακτηρισμό συγκεκριμένων μοριακών δομών, μεταξύ αυτών και γνωστών φαρμάκων, των τετρακυκλινών, ως υπό συγκεκριμένες συνθήκες εκλεκτικών αναστολέων των ενζύμων παραγωγής του υδροθείου, με δυνατότητα βελτιστοποίησης της δράσης και εκλεκτικότητάς τους στο μέλλον, και β) στον εκτενή χαρακτηρισμό του ρόλου του ενζύμου CBS, μέσω της χρήσης του αλλοστερικού ενεργοποιητή SAM, στην αύξηση των καρκινικών κυττάρων του κόλου που υπερεκφράζουν το ένζυμο αυτό

Cystathionine-β-Synthase Inhibition for Colon Cancer: Enhancement of the Efficacy of Aminooxyacetic Acid via the Prodrug Approach

Abstract Colon cancer cells contain high levels of cystathlonlne-β-synthase (CBS). Its product, hydrogen sulfide (H2S), promotes the growth and proliferation of colorectal tumor cells. To improve the antitumor efficacy of the prototypical CBS inhibitor aminooxyacetic acid (AOAA), we have designed and synthesized YD0171, a methyl ester derivative of AOAA. The antiproliferative effect of YD0171 exceeded the antiproliferative potency of AOAA in HCT116 human colon cancer cells. The esterase inhibitor paraoxon prevented the cellular inhibition of CBS activity by YD0171. YD0171 suppressed mitochondrial respiration and glycolytic function and induced G0/G1 arrest, but did not induce tumor cell apoptosis or necrosis. Metabolomic analysis in HCT116 cells showed that YD0171 affects multiple pathways of cell metabolism. The efficacy of YD0171 as an inhibitor of tumor growth was also tested in nude mice bearing subcutaneous HCT116 cancer cell xenografts. Animals were treated via subcutaneous injection of vehicle or AOAA (0.1, 0.5 or 1 mg/kg/d) for 3 wks. Tumor growth was significantly reduced by 9 mg/kg/d AOAA, but not at the lower doses. YD0171 was more potent: tumor volume was significantly inhibited at 0.5 and 1 mg/kg/d. Thus, the in vivo efficacy of YD0171 is nine times higher than that of AOAA. YD0171 (1 mg/kg/d) attenuated tumor growth and metastasis formation in the intracecal HCT116 tumor model. YD0171 (3 mg/kg/d) also reduced tumor growth in patient-derived tumor xenograft bearing athymic mice. YD0171 (3 mg/kg/d) induced the regression of established HCT116 tumors in vivo. A 5-d safety study in mice demonstrated that YD0171 at 20 mg/kg/d (given in two divided doses) does not increase plasma markers of organ injury, nor does it induce histological alterations in the liver or kidney. YD0171 caused a slight elevation in plasma homocysteine levels. In conclusion, the prodrug approach improves the pharmacological profile of AOAA; YD0171 represents a prototype for CBS inhibitory anticancer prodrugs. By targeting colorectal cancer bioenergetics, an emerging important hallmark of cancer, the approach exemplified herein may offer direct translational opportunities