Estudio de la estabilidad oxidativa de aceites funcionalizados con derivados de hidroxitirosol

Las materias grasas sufren procesos de autooxidación que conducen a la formación de productos volátiles que les confieren olor y sabor desagradable, haciéndolas inaceptables para el consumo humano. Para evitarlo, se utilizan aditivos que retrasan este proceso, con la consiguiente prolongación de la vida útil del producto. Sin embargo la gama de productos con carácter de aditivo antioxidante para alimentos es reducida pues, aparte de los extractos vegetales, la mayoría son productos fenólicos sintéticos, excepto los tocoferoles y el palmitato de ascorbilo que son los que presentan una menor capacidad de protección. Por este motivo la industria alimentaria está requiriendo antioxidantes más potentes, a ser posible de origen natural, que no tengan sabor y que además confieran al alimento propiedades funcionales. El hidroxitirosol (HTy) y una serie de derivados son orto-difenoles con fuerte carácter antioxidante que se encuentran en el aceite de oliva y que poseen numerosas propiedades farmacológicas y nutricionales que dan lugar a que el aceite de oliva virgen sea reconocido como cardiosaludable. Los derivados mayoritarios del HTy en el aceite de oliva tienen marcado sabor amargo y el HTy libre es un producto siruposo de difícil disolución en grasas por lo que no se han utilizado en los alimentos grasos. Sin embargo, ciertos derivados del hidroxilo primario, tales como éteres y ésteres de hidroxitirosilo, han demostrado ser insípidos y tener buena solubilidad en grasas manteniendo un fuerte carácter antioxidante. En la presente Tesis se profundiza en la investigación de las propiedades antioxidantes de los alquil éteres (AEHTy), ésteres grasos (EGHTy) y acetato (AcHTy) de hidroxitirosilo y sus interacciones con el α-tocoferol (α-T), antioxidante presente en la mayoría de los aceites vegetales, para que puedan ser utilizados como aditivos liposolubles en alimentos grasos. Así mismo, se estudia un procedimiento de obtención de EGHTy y se optimizan métodos analíticos para la determinación de todos estos derivados en matrices oleosas. Los AEHTy son sustancias obtenidas por reacción de yoduros de alquilo con el HTy con los OH fenólicos protegidos, y que han mostrado tener interesantes propiedades farmacológicas y nutricionales ya que después de la ingesta no se hidrolizan en el tracto intestinal, manteniendo su carácter lipofílico hasta que se forman los glucurónidos o sulfatos. Mediante la oxidación acelerada Rancimat® se ha investigado la actividad antioxidante de los AEHTy en matrices oleosas de diferente grado de insaturación, así como el efecto de la presencia de α-T. Utilizando el sistema de oxidación a baja temperatura open cup, se ha investigado también el efecto de la insaturación de la matriz, siguiéndose la evolución de los parámetros de calidad y de las concentraciones de α-T y AEHTy. Las capacidades antioxidantes fueron ligeramente mayores que las de los ésteres homólogos. El método más conveniente para la obtención de EGHTy es por transesterificación de ésteres alquílicos de ácidos grasos con HTy libre. Debido a que para disponer de los AEHTy y EGHTy es necesario proceder a una síntesis seguida de una purificación del producto de la reacción, en esta Tesis se ha investigado la síntesis de los EGHTy por reacción del HTy libre con los triacilgliceroles que componen los aceites, en un proceso simple y económico que puede ser aplicado fácilmente por la industria refinadora de aceites y que no requiere el aislamiento y la purificación del producto. Como producto de la reacción se obtiene un aceite que contiene una alta concentración de una mezcla de EGHTy, y que puede ser usado directamente como aditivo antioxidante para alimentos grasos. La reacción se ha desarrollado en aceites con muy diversa composición en ácidos grasos y se han estudiado las variables que intervienen en el proceso, tales como relación HTy/aceite, cantidad de enzima, soporte sólido para la dispersión del HTy, temperatura y tiempo de reacción. Los aceites resultantes se han caracterizado por la composición en ácidos grasos, y los perfiles glicerídico y de EGHTy, así como por el contenido total en HTy solubilizado y ésteres. Los EGHTy están presentes en pequeña cantidad en el aceite de oliva virgen y tienen un marcado carácter lipofílico que se pierde en parte tras la ingesta ya que en el tracto intestinal se hidrolizan a HTy libre. Para el estudio de la capacidad antioxidante de los ésteres se han aplicado procesos de oxidación open cup a temperatura ambiente así como la oxidación acelerada a alta temperatura en equipo Rancimat®, utilizándose el acetato de hidroxitirosilo (AcHTy) como representante de esta familia de ésteres. Se ha estudiado su actividad en comparación con la del α-T y la de las mezclas de ambos, para conocer la influencia de este compuesto sobre la capacidad de los ésteres. Como resultado se ha observado que los ésteres tienen una alta capacidad antioxidante y que ejercen un efecto protector sobre el tocoferol al ralentizar la disminución de su concentración con el tiempo. Por otra parte el α-T ejerce un efecto aditivo positivo para bajas concentraciones de AcHTy mientras que el efecto es sustractivo para altas. Finalmente, utilizando aceites con una alta concentración de EGHTy obtenidos in situ se han enriquecido aceites de diverso grado de insaturación a diversas concentraciones, se ha determinado la estabilidad Rancimat y se ha estimado la vida útil de los aceites a temperatura ambiente, mediante la extrapolación de los periodos de inducción Rancimat a temperaturas elevadas. Como conclusión final, se afirma que tanto los éteres como los ésteres de hidroxitirosilo tienen alta capacidad antioxidante, en ventaja con el α-T y los antioxidantes fenólicos sintéticos de uso habitual, por lo que pueden ser usados como aditivos antioxidantes de las materias grasas, aportando carácter funcional al alimento y presentando una actividad que depende de la composición en ácidos grasos de la matriz lipídica y de su contenido de tocoferoles

Éteres alquílicos derivados de polifenoles del olivo. Síntesis y evaluación de su actividad antioxidante

Tesis descargada desde TESEOEn la presente Memoria, se describe la síntesis de nuevos derivados alquílicos de compuestos fenólicos presentes en el olivo así como la evaluación de su actividad antioxidante mediante diversos métodos. Estos compuestos deben presentar, a priori, una actividad antioxidante similar a la de sus precur-sores libres, mayor estabilidad química que los ésteres antes mencionados, así como una buena liposolubilidad de manera que, tomando estas características en conjunto, hagan de este nuevo tipo de compuestos unos buenos candidatos como componentes funcionales de alimentos. Además se presenta la síntesis de otra serie de compuestos en los que la unidad orto-difenólica está protegida por un grupo metilideno. Finalmente, se describe igualmente una nueva vía para la obtención de hidroxitirosol libre, así como la preparación de varias formas ortogonalmente protegidas de este biofenol. Por ello, los objetivos propuestos al comienzo del trabajo de investigación que se recoge en la presente Memoria fueron los siguientes: 1. Síntesis de éteres alquílicos derivados de compuestos fenólicos presentes en el olivo Se han preparado series homólogas de éteres alquílicos derivados de compuestos fenólicos simples presentes en el olivo, en los que el número de átomos de carbono de la cadena alquílica lateral varía desde 1 hasta 18. Para ello se han utilizado como productos de partida tres de estos compuestos como son el hidroxitirosol (1), tirosol (2) y alcohol homovanílico (3). Como fuente de hidroxitirosol se ha empleado un extracto enriquecido procedente del alperujo, el cual ha sido purificado antes de su utilización. La variabilidad de compuestos obtenidos nos ha permitido, por un lado, la modulación de la lipofilia, y por otro, estudiar la relación estructura química-actividad antioxidante para este tipo de compuestos. Resumen Tesis Andrés Madrona Asimismo, nos propusimos la preparación de otros derivados en los que los OH fenólicos se encuentran protegidos por un puente metilideno. De esta manera se logra por un lado el aumento de la lipofilia y, por otro, mantener el grupo catecólico protegido frente a la oxidación. 2. Síntesis de hidroxitirosol y nuevas formas protegidas En la presente Memoria nos propusimos una ruta alternativa para la síntesis de hidroxitirosol (1) a partir de tirosol comercial (2) mediante una oxidación de tipo Baeyer-Villiger como etapa clave en el esquema sintético seguido. Esta etapa de la investigación se ha llevado a cabo en colaboración con el grupo del Profesor Giovanni Zappia del Dipartimento di Scienze Biomolecolari della Università degli Studi ¿Carlo Bo¿ de Urbino, Italia. 3. Evaluación de la actividad antioxidante de los compuestos sintetizados mediante métodos químicos Una vez sintetizados, se ha procedido a estudiar la actividad antioxidante de los éteres alquílicos obtenidos, comparando su comportamiento con sustancias patrones, tales como: los propios compuestos fenólicos de partida hidroxitirosol, tirosol y alcohol homovanílico, además del butilhidroxitolueno (BHT) y el ¿-tocoferol. Estos estudios se han llevado a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Raquel Mateos Briz tanto en el centro Venta del Llano (IFAPA, Jaén) como en el ICTAN (CSIC, Madrid). Para evaluar las diferentes funcionalidades que las sustancias preparadas pudieran aportar a la conservación de alimentos, y dada la conveniencia de utilizar más de un método de estudio, se han escogido diversos métodos. Así: Resumen Tesis Andrés Madrona ¿ La capacidad reductora de las nuevas sustancias ha sido evaluada mediante los ensayos FRAP y ABTS, ¿ La capacidad de captación de radicales libres se ha estudiado mediante el ensayo ORAC y ¿ Para la evaluación de la capacidad protectora frente a la peroxidación lipídica se ha empleado el método de envejecimiento acelerado Rancimat® en aceites vegetales comerciales. 4. Determinación de la actividad biológica de los compuestos sintetizados Finalmente, teniendo en cuenta su potencial uso como ingredientes funcionales para alimentos con valor nutricional añadido, nos propusimos realizar un estudio preliminar de la posible actividad biológica de las nuevas sustancias sintetizadas. Así, por una parte, se ha llevado a cabo, en colaboración con el grupo del Profesor Augusto Accorsi del Dipartimento di Scienze Biomolecolari della Univesità degli Studi ¿Carlo Bo¿ di Urbino (Italia), el estudio de la capacidad de los éteres de hidroxitirosilo de proteger los glóbulos rojos frente a una oxidación forzada, determinando la producción de malondialdehido (MDA), uno de los marcadores de la peroxidación lipídica, así como de su protección frente a la hemólisis oxidativa. Se escogen los glóbulos rojos humanos como modelos metabólicos simples dado que en estas células los mecanismos de defensa mediados por la inducción de síntesis de proteínas no están operativos, de manera que están expuestos al daño oxidativo debido a la función que ejercen como transportadores de oxígeno. Por otra parte, y dado el hecho ya comentado que los fenolípidos poseen cierta actividad anticancerígena, se ha abordado el estudio de la posible actividad citotóxica de los éteres de hidroxitirosilo sintetizados, así como la posible selectividad de los mismos frente a células cancerígenas

Nitrocatecoles derivados de Hidroxitirosol: síntesis, biodisponibilidad y evaluación de su capacidad antioxidante y neuroprotectora

La dieta mediterránea (DM) es objeto de numerosos estudios en cuanto a los efectos beneficiosos que produce en el organismo, principalmente, por su incidencia positiva en la prevención de los accidentes cardiovasculares. El éxito de esta dieta es atribuido, fundamentalmente, a su componente graso mayoritario, el aceite de oliva virgen (AOV). Su importancia radica en su alto contenido en ácido oleico y en compuestos fenólicos. Estos últimos destacan por su elevada actividad antioxidante, sobre todo, los orto-catecoles. El hidroxitirosol (HTy) es uno de estos biofenoles y se encuentra principalmente en el olivo. En los últimos años, el HTy se ha convertido en objeto de numerosos estudios por parte de diferentes grupos de investigación de todo el mundo. Presenta una capacidad protectora frente a la oxidación mucho mayor que los aditivos antioxidantes habitualmente utilizados por la industria alimentaria, fundamentalmente, tocoferoles y BHT. Sin embargo, su carácter prácticamente insoluble en medio lipofílico hace que no pueda ser utilizado en este tipo de alimentos. Además de poseer propiedades antioxidantes, se ha demostrado que el HTy presenta una variada gama de actividades biológicas como son: actividad antimicrobiana, antihipertensiva, hipoglucémica, antiagregante plaquetaria, cardioprotectora y antiinflamatoria. Por otra parte, en los últimos años, se han preparado varios tipos de derivados de HTy con el fin de modular su balance hidrófilo/lipófilo para su posible uso en la protección de los alimentos grasos frente a la oxidación, o para aumentar su biodisponibilidad en el organismo. Objetivos: En base a los antecedentes descritos, se ha propuesto el estudio de nuevos antioxidantes derivados de HTy, obtenido a partir de los residuos de la industria olivarera, en los que se introduce una modificación fundamental en el anillo fenólico como es la incorporación de un grupo nitro (NO2). La combinación de la presencia de este grupo electroatrayente con la longitud y naturaleza de la cadena lateral podría permitir la modulación de la actividad antioxidante de los nuevos compuestos sintetizados. Además, la introducción del grupo nitro en este tipo de compuestos les podría conferir la capacidad de inhibir la catecol orto-metiltransferasa (COMT), enzima implicada en la degradación de la dopamina, neurotransmisor cuyo déficit produce la enfermedad de Parkinson (EP), con el fin de valorar su potencial terapéutico contra enfermedades neurodegenerativas. Por ello, el objetivo global de este trabajo de investigación ha consistido en la preparación de nuevos compuestos lipofílicos nitroderivados de HTy y la evaluación de su capacidad antioxidante in vitro, biodisponibilidad, metabolismo y actividad neuroprotectora en modelos experimentales de daño cerebral y enfermedad de Parkinson. Este objetivo general se concreta en los siguientes objetivos específicos: 1. Preparación de nuevos ésteres y éteres lipofílicos nitroderivados de HTy y determinación estructural de los mismos. 2. Evaluación de la capacidad antioxidante in vitro de los ésteres y éteres nitroderivados de HTy sintetizados. 3. Estudio de la biodisponibilidad y metabolismo de nitrohidroxitirosol (NO2HTy), acetato de nitrohidroxitirosilo (NO2HTy-A) y etil éter de nitrohidroxitirosilo (NO2HTy-E) en líneas celulares Caco-2 y HepG2, como modelos de absorción intestinal y hepática humano, respectivamente. 4. Evaluación de la capacidad antioxidante y neuroprotectora de NO2HTy, NO2HTy-A y NO2HTy-E en modelos experimentales de daño cerebral. 5. Estudio preclínico de la capacidad inhibidora de NO2HTy, NO2HTy-A y NO2HTy- E sobre la actividad de la enzima COMT. Principales resultados 1. Se han puesto a punto los protocolos de síntesis para la obtención de dos series de nitroderivados lipofílicos de hidroxitirosol, con cadenas laterales acílica (ésteres) o alquílica (éteres), ejemplificados en la preparación de un total de 14 compuestos con estructura nitrocatecólica a partir de hidroxitirosol. 2. Todas las sustancias preparadas han sido caracterizadas por sus puntos de fusión (sólidos) y sus datos espectroscópicos y sus estructuras han sido determinadas inequívocamente mediante experimentos mono- y bidimensionales de RMN, así como por sus espectros de masas de baja y alta resolución. 3. La evaluación de la capacidad reductora (método FRAP) y de secuestro de radicales libres (métodos ORAC y ABTS) de los nitrocatecoles de ambas series, acílica y alquílica, ha puesto de manifiesto la influencia positiva que ejerce el grupo nitro sobre la actividad antioxidante in vitro de estos compuestos en comparación con el hidroxitirosol libre. Además, la longitud de la cadena hidrocarbonada lateral determina la actividad antioxidante, más que el tipo de enlace en sí, mostrando una relación parabólica entre la capacidad antioxidante y la naturaleza lipofílica del compuesto, con un máximo de actividad para una longitud de 2-4 átomos de carbono. 4. Los compuestos nitrohidroxitirosol, acetato de nitrohidroxitirosilo y éter etílico de nitrohidroxitirosilo se absorben a través de las células del epitelio intestinal Caco-2, en relación directa a la naturaleza lipofílica del compuesto. Entre un 33-81% de los compuestos absorbidos permanecen sin metabolizar, pudiendo alcanzar el torrente sanguíneo en su estado original. 5. Estos compuestos han demostrado también ser biodisponibles por las células de hepatoma humano, HepG2, y extensivamente metabolizados, observándose una relación directa con el tiempo de incubación y la naturaleza lipofílica del compuesto. 6. En ambos estudios de biodisponibilidad, intestinal y hepático, derivados glucuronidados, metilados y metilglucuronidados son los compuestos identificados del metabolismo de los nitroderivados de hidroxitirosol. 7. Los nitrocatecoles presentan actividad antioxidante en los modelos experimentales de inducción química e hipoxia-reoxigenación empleados como mecanismos de producción de radicales libres en tejido cerebral de rata. Siendo esta actividad menor que la de sus precursores no nitrados. 8. A pesar del efecto antioxidante de los nitrocatecoles, no se observa un efecto neuroprotector en el modelo experimental de hipoxia-reoxigenación. 9. Los nitrocatecoles estudiados han mostrado una actividad inhibidora de la actividad COMT significativamente mayor tras el tratamiento crónico en comparación con el agudo. Los nitrocatecoles estudiados modifican el metabolismo de la dopamina, siendo mayor el efecto conseguido con los derivados lipofílicos, que el proporcionado por su precursor. 10. Los resultados de los estudios in vivo concluyen que los nitrocatecoles derivados de HTy también modifican el metabolismo de la dopamina, con una actividad superior para los derivados lipofílicos que ofrecen una acción más prolongada en el tiempo