Towards higher predictability in enzyme engineering : investigation of protein epistasis in dynamic ß-lactamases and Cal-A lipase

L'ingénierie enzymatique est un outil très avantageux dans l'industrie biotechnologique. Elle permet d'adapter les enzymes à une activité ou à une condition de réaction spécifique. En outre, elle peut permettre de déchiffrer les éléments clés qui ont facilité leur modification. Bien que l'ingénierie enzymatique soit largement pratiquée, elle comporte encore plusieurs goulets d'étranglement. Certains de ces goulets d'étranglement sont techniques, comme le développement de méthodologies pour la création de banques de mutations ciblées ou la réalisation de criblages à haut débit, et d'autres sont conceptuels, comme le déchiffrage des caractéristiques clés pertinentes d'une protéine cible pour la réussite d'un projet d'ingénierie. Parmi ces défis, l'épistasie intra-génique, ou la non-additivité des effets phénotypiques des mutations, est une caractéristique qui entrave grandement la prévisibilité. L'amélioration de l'ingénierie enzymatique nécessite une approche multidisciplinaire qui inclut une meilleure compréhension des relations structure-fonction-évolution. Cette thèse vise à contribuer à l'avancement de l'ingénierie enzymatique en étudiant deux systèmes modèles. Premièrement, des variantes dynamiques de la ß-lactamase TEM-1 ont été choisies pour étudier le lien entre la dynamique des protéines et l'évolution. La ß-lactamase TEM-1 a été largement caractérisée dans la littérature, ce qui s'est traduit par des connaissances approfondies sur son mécanisme de réaction, ses caractéristiques structurelles et son évolution. Les variantes de la ß-lactamase TEM-1 utilisées comme système modèle dans cette thèse ont été largement caractérisées, montrant une dynamique accrue à l'échelle temporelle pertinente pour la catalyse (µs à ms) mais maintenant la reconnaissance du substrat. Dans cette thèse, l'évolution in vitro de ces variantes dynamiques a été réalisée par des cycles itératifs de mutagenèse et de sélection aléatoires pour permettre une exploration impartiale du paysage de ‘fitness’. Nous démontrons que la présence de ces mouvements particuliers au début de l'évolution a permis d'accéder à des voies de mutations connues. De plus, des interactions épistatiques connues ont été introduites dans les variantes dynamiques. Leur caractérisation in silico et cinétique a révélé que les mouvements supplémentaires sur l'échelle de temps de la catalyse ont permis d'accéder à des conformations conduisant à une fonction améliorée, comme dans le TEM-1 natif. Dans l'ensemble, nous démontrons que l'évolution de la b-lactamase TEM-1 vers une nouvelle fonction est compatible avec divers mouvements à l'échelle de temps µs à ms. Il reste à savoir si cela peut se traduire par d'autres enzymes ayant un potentiel biotechnologique. Deuxièmement, la lipase Cal-A, pertinente sur le plan industriel, a été choisie pour identifier les caractéristiques qui pourraient faciliter son ingénierie. La lipase Cal-A présente des caractéristiques telles que la polyvalence du substrat et une grande stabilité thermique et réactivité qui la rendent attrayante pour la modification des triglycérides ou la synthèse de molécules pertinentes dans les industries alimentaire et pharmaceutique. Contrairement à TEM-1, la plupart des études d'évolution in vitro de la lipase Cal-A ont été réalisées dans un but industriel, avec une exploration limitée de l'espace de mutation. Par conséquent, les caractéristiques qui définissent la fonction de la lipase Cal-A restent insaisissables. Dans cette thèse, nous faisons état de la mutagenèse ciblée de la lipase Cal-A, confirmant l'existence d'une région clé pour la reconnaissance du substrat. Cela a été fait en combinant une nouvelle méthodologie de création de bibliothèque basée sur l'assemblage Golden-gate avec une visualisation structurelle basée sur des scripts pour identifier et cartographier les mutations sélectionnées dans la structure 3D. La caractérisation et la déconvolution de deux des plus aptes ont révélé l'existence d'une épistasie dans l'évolution de la lipase Cal-A vers une nouvelle fonction. Dans l'ensemble, nous démontrons que l’identification d'une variété de propriétés suite à la mutagenèse ciblée peut grandement améliorer la connaissance d'une enzyme. Cette information peut être appliquée pour améliorer l'efficacité de l'ingénierie dirigée.Enzyme engineering is a tool with great utility in the biotechnological industry. It allows to tailor enzymes to a specific activity or reaction condition. In addition, it can allow to decipher key elements that facilitated their modification. While enzyme engineering is extensively practised, it still entails several bottlenecks. Some of these bottlenecks are technical such as the development of methodologies for creating targeted mutational libraries or performing high-throughput screening and some are conceptual such as deciphering the key relevant features in a target protein for a successful engineering project. Among these challenges, intragenic epistasis, or the non-additivity of the phenotypic effects of mutations, is a feature that greatly hinders predictability. Improving enzyme engineering needs a multidisciplinary approach that includes gaining a better understanding of structure-function-evolution relations. This thesis seeks to contribute in the advancement of enzyme engineering by investigating two model systems. First, dynamic variants of TEM-1 ß-lactamase were chosen to investigate the link between protein dynamics and evolution. TEM-1 ß-lactamase has been extensively characterized in the literature, which has translated into extensive knowledge on its reaction mechanism, structural features and evolution. The variants of TEM-1 ß-lactamase used as model system in this thesis had been extensively characterized, showing increased dynamics at the timescale relevant to catalysis (µs to ms) but maintaining substrate recognition. In this thesis, in vitro evolution of these dynamic variants was done by iterative rounds of random mutagenesis and selection to allow an unbiased exploration of the fitness landscape. We demonstrate that the presence of these particular motions at the outset of evolution allowed access to known mutational pathways. In addition, known epistatic interactions were introduced in the dynamic variants. Their in silico and kinetic characterization revealed that the additional motions on the timescale of catalysis allowed access to conformations leading to enhanced function, as in native TEM-1. Overall, we demonstrate that the evolution of TEM-1 b-lactamase toward new function is compatible with diverse motions at the µs to ms timescale. Whether this can be translated to other enzymes with biotechnological potential remains to be explored. Secondly, the industrially relevant Cal-A lipase was chosen to identify features that could facilitate its engineering. Cal-A lipase presents characteristics such as substrate versatility and high thermal stability and reactivity that make it attractive for modification of triglycerides or synthesis of relevant molecules in the food and pharmaceutical industries. Contrary to TEM-1, most in vitro evolution studies of Cal-A lipase have been done towards an industrially-specified goal, with limited exploration of mutational space. As a result, features that define function in Cal-A lipase remain elusive. In this thesis, we report on focused mutagenesis of Cal-A lipase, confirming the existence of a key region for substrate recognition. This was done by combining a novel library creation methodology based on Golden-gate assembly with script-based structural visualization to identify and map the selected mutations into the 3D structure. The characterization and deconvolution of two of the fittest revealed the existence of epistasis in the evolution of Cal-A lipase towards new function. Overall, we demonstrate that mapping a variety of properties following mutagenesis targeted to specific regions can greatly improve knowledge of an enzyme that can be applied to improve the efficiency of directed engineering

Status of Indigenous Languages within Gambian Education Policy: English vs Vernacular Languages as the vehicular language in formal education contexts

Taking into consideration the National Education Policy (2004-15) that encourages the respect and preservation of indigenous languages of The Gambia and emphasizes the need to use vernacular languages during the first stages of formal education, this paper presents the results from observing the languages used to teach within the Gambian classrooms. The investigation in the field focuses on finding and understanding the reasons that lead educators to choose either the vernacular language or the colonial language. The fieldwork is mainly conducted in lower basic schools in The Gambia, because it is the critical period when learners develop languages skills and will impact on the future acquirement of other foreign languages. Furthermore, the paper presents and explains briefly the situation within the whole education system from lower basic to tertiary education

Effects of donor age and proliferative aging on the phenotype stability of rat aortic smooth muscle cells

Age-related effects of the vascular wall have been associated with several hemodynamic dysfunctions, including medial vascular calcification. Vascular aging has been traditionally addressed using proliferative senescence of vascu- lar smooth muscle cells (VSMC) in vitro, which induces osteoblastic transition and favors calcification in vitro. In this work, we have analyzed the relation- ship between organismal aging and proliferative senescence by comparing the proliferative aging of VSMC obtained from young, mature, and old rats (2-, 12-, and 24-month cell lines [CL], respectively). VSMC proliferated to more than 100 cumulative population doublings (CPD) without evidence of prolif- erative senescence, most likely as a consequence of telomerase induction. The apoptosis rate increased with CPD in all three CL, but the oxidation status of the cells was not modified. The magnitude of all gene expression changes caused by CPD was higher than the magnitude of the changes caused by donor age: the expressions of VSMC markers a-actin and SM22a decreased, while the expressions of transcription factors Msx2 and Runx2 and of bone morphogenetic protein-2 increased. Treatment of the cells with 2 mmol/L Pi revealed that the intensity of the effect of CPD on calcium deposition was greater than the effect of donor age. In conclusion, the proliferative lifespan of VSMC magnifies the effect of donor age on the osteoblastic transition of VSMC, therefore suggesting that in vivo vascular aging changes can be less dramatic than what is shown by in vitro aging

Importancia ecológica de la composición microbiana en sedimentos de una laguna costera de boca efímera (La Mancha, Veracruz)

The coastal lagoons are characterized by the mixture of fresh and salty water, causing these systems to be extremely dynamic, thus generating a very particular ecological behavior. The bacteria present in the sediments of this ecosystems have a critical role in its functioning, such as the recycling of organic matter, food chains and biogeochemical cycles; however, there are few studies where microbiology is evaluated in this type of ecosystems. In the present work, microbiology was investigated in the La Mancha lagoon, Veracruz, as well as its relationship with physicochemical variables. The sediment samples were collected in the months of July and November in 2013, and in June 2014. Nested PCR was carried out and specific markers of the domino bacteria were used to implement DGGE from 16S rRNA, the bands of the gel were used to build a phylogenetic tree. The granulometric analysis showed that the main component in the lagoon system were fine sands. . When performing the Pearson correlation analysis, it was concluded that there were significant differences between certain variables. Attending to lower taxonomic categories, in the sediment 12 species belonging to nine genera were obteined: Sacharophagus degradans, Thioalkalivibrio sulfidiphilus, Ectohiorhodospira mobilis, Rhodanobacter denitrificans, Geobacter bemidjiensis, Geobacter daltonii, Geobacter uraniireduces, Geobacter metalliredicens, Desulfuromonas acetoxidans, Syntrophobacter fumaroxidans, Syntrophus aciditrophicus and Planococcus halocryophilus. The topology of the phylogenetic tree confirmed that all the samples presented in the present study are located in a monophyletic clade, brother to the clade that includes the sequence of Saccharophagus degradans. According to the obtainedresults there is a syntrophy between the fermentative, sulfate-reduction and methanogenic species found.Las lagunas costeras se caracterizan por ser la mezcla de agua dulce y salada, provocando que estos sistemas sean sumamente dinámicos, esto genera un comportamiento ecológico muy particular. Las bacterias presentes en los sedimentos de dichos ecosistemas tienen un papel crítico en el funcionamiento de los ecosistemas, tal como reciclaje de materia orgánica, cadenas alimentarias y los ciclos biogeoquímicos; sin embargo, existen pocos estudios en donde se evalúa la composición microbiana en este tipo de sistemas. En el presente trabajo se investigó la composición microbiana en la laguna de La Mancha, Veracruz, así como su relación con las variables fisicoquímicas. Las muestras de sedimento se colectaron en los meses de julio y noviembre del 2013, y en junio del 2014. Se realizó una PCR anidada con primers específicos del domino bacteria para posteriormente realizar un DGGE a partir de fragmentos del 16S ARNr con lo que se secuenciaron las bandas del gel para construir un árbol filogenético de las especies obtenidas. El análisis granulométrico mostró que el componente principal en el sistema lagunar son las arenas finas. Al realizar el análisis de correlación de Pearson se concluyó que existen diferencias significativas entre ciertas variables. Atendiendo a categorías taxonómicas inferiores, en el sedimento se obtuvieron 12 especies pertenecientes a nueve géneros: Sacharophagus degradans, Thioalkalivibrio sulfidiphilus, Ectohiorhodospira mobilis, Rhodanobacter denitrificans, Geobacter bemidjiensis, Geobacter daltonii, Geobacter uraniireduces, Geobacter metalliredicens, Desulfuromonasacetoxidans, Syntrophobacter fumaroxidans, Syntrophus aciditrophicus y Planococcus halocryophilus. La topología del árbol filogenético confirmó que todas las muestras obtenidas en el presente estudio se ubican en un clado monofilético, hermano al clado que incluye la secuencia de Saccharophagus degradans. De acuerdo a lo obtenido se infiere que existe sintrofía entre las especies encontradas del tipo fermentativo, sulfatoreductoras y metanogénicas

Diseño curricular para la enseñanza de ELE en África Subsahariana : el caso de Gambia

Programa de Doctorado en Lenguas Modernas, Traducción y Español como Lengua ExtranjeraLa expansión del español en el mundo es una realidad, así lo evidencian cada año las cifras del anuario del Instituto Cervantes. Este crecimiento tiene un impacto directo en el ámbito de la enseñanza del español como lengua extranjera (ELE). La presente investigación doctoral documenta desde un enfoque etnográfico la situación actual de la enseñanza del español en Gambia teniendo en cuenta la influencia que, indiscutiblemente, ejerce el contexto que acoge este territorio, nos referimos a todos los países que integran África Subsahariana. El objetivo principal de este trabajo doctoral es proponer un modelo de diseño curricular que encaje con las características contextuales de los países situados al sur del Sáhara. Para ello, en primer lugar realizamos una revisión bibliográfica sobre los programas de ELE en esta región. Seguidamente, con el objetivo de encontrar los fundamentos teóricos que construyan el marco teórico de nuestra investigación, presentamos una revisión bibliográfica del término currículo, de las teorías de diseño curricular más relevantes y de los diferentes métodos implementados en la enseñanza de lenguas extranjeras. Para poder ofrecer una propuesta curricular que se adapte al contexto subsahariano, tomamos como referencia el caso de Gambia y el trabajo de difusión y promoción lingüística que comenzó en 2011 en la Universidad de Gambia con la ayuda de los electorados MAEC-AECID. El estudio etnográfico y demolingüístico de la realidad gambiana arroja información fundamental para poder discernir las características del aprendiente de ELE de este país, la disponibilidad de recursos (humanos, de infraestructura y tecnológicos) y el enfoque metodológico imperante en su sistema educativo. Los datos obtenidos de las diferentes herramientas investigadoras permiten la creación de un proyecto curricular sostenible para la enseñanza de ELE en este territorio. Ante todo, esta investigación trata de dar visibilidad a la situación de la enseñanza de ELE en África Subsahariana y del impacto que ejerce el contexto en la creación de programas curriculares.Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Filología y Traducció

Reflexión sobre la situación de la enseñanza del español en África subsahariana y los factores que impulsan su expansión

The growth of the teaching and learning of Spanish as a foreign language (SFL) is a fact, as the Cervantes ́ Institute documents it yearly. However, there is a part of the planet located in the South of the Saharan Dessert that has not received the deserved attention, even though it is the third region in the world with more learners of Spanish language. In order to find the reasons for the current situation, we present some reflections regarding the motives that promote or discourage the inclusion of Spanish in the curriculum of Sub-Saharan education systems. From a historical perspective, we present the first contacts of the Spanish language in this vast territory and we analyse how post colonialism and international relationships with Spanish-speaking countries impact on the development of SFL courses.En los últimos años los informes anuales del Instituto Cervantes documentan un continuo crecimiento de la enseñanza del español como lengua extranjera (ELE) en todo el planeta, sin embargo, existe una región al sur del Sáhara que a pesar de ser la tercera en cuanto al número de aprendientes de ELE no recibe la atención que se merece. En una búsqueda por comprender los factores que influyen en la presencia o ausencia del español en los planes curriculares subsaharianos presentamos una reflexión sobre el panorama actual desde una perspectiva histórica y teniendo en cuenta los datos obtenidos de la revisión bibliográfica. Los resultados de esta investigación confirman que la presencia lingüística del español en esta región se debe fundamentalmente a tres causas: el impacto de la herencia colonial, la existencia de acuerdos de cooperación con países hispanohablantes y el apoyo de entidades privadas

Holistic engineering of Cal-A lipase chain-length selectivity identifies triglyceride binding hot-spot

Through the application of a region-focused saturation mutagenesis and randomization approach, protein engineering of the Cal-A enzyme was undertaken with the goal of conferring new triglyceride selectivity. Little is known about the mode of triglyceride binding to Cal-A. Engineering Cal-A thus requires a systemic approach. Targeted and randomized Cal-A libraries were created, recombined using the Golden Gate approach and screened to detect variants able to discriminate between long-chain (olive oil) and short-chain (tributyrin) triglyceride substrates using a high-throughput in vivo method to visualize hydrolytic activity. Discriminative variants were analyzed using an in-house script to identify predominant substitutions. This approach allowed identification of variants that exhibit strong discrimination for the hydrolysis of short-chain triglycerides and others that discriminate towards hydrolysis of long-chain triglycerides. A clear pattern emerged from the discriminative variants, identifying the 217–245 helix-loop-helix motif as being a hot-spot for triglyceride recognition. This was the consequence of introducing the entire mutational load in selected regions, without putting a strain on distal parts of the protein. Our results improve our understanding of the Cal-A lipase mode of action and selectivity. This holistic perspective to protein engineering, where parts of the gene are individually mutated and the impact evaluated in the context of the whole protein, can be applied to any protein scaffold

Estudios sobre la calcificación vascular medial: Efecto del envejecimiento, arsénico y fluor

La calcificación vascular se refiere al depósito de fosfatos de calcio en la pared de los vasos, generalmente en forma cristalizada, principalmente como hidroxiapatita (Trion y cols, 2004). Puede darse en la túnica íntima, como en ateromatosis y/o en la túnica media (calcificación medial o esclerosis de Mönckeberg) (Deltrano y cols, 1997). Los mecanismos que modulan la calcificación vascular aún no están totalmente claros. Proteínas asociadas al hueso han sido detectadas en tejidos vasculares calcificados, y por ello se ha propuesto que se trata de un proceso organizado y regulado, similar a la mineralización ósea (Bostrom y cols, 1993; Mohler y cols, 2001; Kockx y cols, 1998). Las células del músculo liso vascular (VSMCs) son comúnmente consideradas como las responsables de la calcificación vascular. La apoptosis de estas células parece ser también un factor importante en el proceso, mientras otros factores incluyen interacciones entre células (macrófagos y VSMCs), lípidos y concentraciones plasmáticas de fosfato inorgánico (Deltrano y cols, 1997). La calcificación arterial medial no se acompaña de acumulación de lípidos o depósitos de colesterol, y ocurre preferentemente en la población de edad avanzada, en diabetes e insuficiencia renal crónica (Nakano-Kurimoto, 2009). Esta tesis estudia la calcificación vascular como consecuencia del envejecimiento desde dos perspectivas diferentes, estudiándose en primer lugar como consecuencia del envejecimiento cronológico y en segundo lugar como consecuencia de la senescencia inducida por estrés (SIPS) por arsénico. A partir de estos estudios se ha llegado a concluir de forma general que el envejecimiento de las VSMCs tiene lugar gradualmente a medida que las células acumulan divisiones, a la vez que se desdiferencian y transdiferencian hacia un fenotipo osteogénico, favoreciendo el desarrollo de la calcificación vascular. El arsénico es capaz de desencadenar el proceso de senescencia y calcificación vascular en las VSMCs, aunque los mecanismos por los que se desarrollan estos procesos en este caso son independientes uno del otro. Finalmente, aunque sin relación con el envejecimiento, se estudió el efecto del flúor en la calcificación vascular, principalmente en relación con la ingesta de aguas fluoradas (en beneficio de la salud dental y ósea). Se observó como este elemento reduce la calcificación vascular in vitro, posiblemente como consecuencia de la modificación del proceso de cristalización e inhibición de la nucleación. Sin embargo, in vivo usando el modelo animal aceptado para calcificación vascular (ratas nefrectomizadas; Shobeiri y cols., 2010) se observó como la ingesta de agua fluorada (a dosis considerada segura por la Organización Mundial de la Salud) agrava la insuficiencia renal, lo que da lugar al incremento de la calcificación vascular

Methods for enzyme library creation: which one will you choose? A guide for novices and experts to introduce genetic diversity

Enzyme engineering allows to explore sequence diversity in search for new properties. The scientific literature is populated with methods to create enzyme libraries for engineering purposes, however, choosing a suitable method for the creation of mutant libraries can be daunting, in particular for the novices. Here, we address both novices and experts: how can one enter the arena of enzyme library design and what guidelines can advanced users apply to select strategies best suited to their purpose? Section I is dedicated to the novices and presents an overview of established and standard methods for library creation, as well as available commercial solutions. The expert will discover an up-to-date tool to freshen up their repertoire (Section I) and learn of the newest methods that are likely to become a mainstay (Section II). We focus primarily on in vitro methods, presenting the advantages of each method. Our ultimate aim is to offer a selection of methods/strategies that we believe to be most useful to the enzyme engineer, whether a first-timer or a seasoned user