Étude des gènes de chaînes légères Lambda et Kappa d'immunoglobulines chez les espèces à faible expression Kappa et forte expression Lambda

Toutes les espèces qui possèdent une immunité humorale expriment les immunoglobulines de la classe G. Cependant, la combinaison des chaînes lourdes et légères diffère entre les diverses espèces. Par exemple, la souris et l'homme expriment principalement la chaîne légère lambda (A), tandis que le cheval et le bœuf, expriment principalement la chaîne légère kappa (k). Les mécanismes responsables de l'expression différentielle des chaînes légères des immunoglobulines demeurent encore mal connus. Ainsi dans la présente étude, nous nous sommes adressés aux mécanismes de réarrangements génétiques et à la génération de la diversité des chaînes légères d'immunoglobulines chez le bœuf et chez le cheval. Nous avons initialement criblé une bibliothèque d'ADN complémentaire de bœuf au moyen des sondes Ck et Jk sans résultat positif, ce qui suggérerait que les gènes de la chaîne légère k étaient rarement transcrits. Des bavardages de type Southern utilisant les ADN génomiques de bœuf, de cheval et de souris hybridés avec les sondes Ck et Jk de souris nous ont permis cependant de détecter faiblement la présence des signaux de ces régions. En revanche, l'utilisation d'une sonde CAJA, de bœuf pour cribler une bibliothèque d'ADN complémentaire de bovin "cDNA 5' stretch" a permis le clonâge, le sous-clonâge et le séquençage d'un fragment contenant les régions codantes pour "le leader, le VA, le JA. et le CA," ayant un triplet GTG comme codon d'initiation alternatif à ATG. L'isolement de la région variable VA de ce clone et son utilisation comme sonde avec l'ADN génomique de bœuf et l'ADN génomique d'hybridomes bœuf-souris, ont montré l'existence de plusieurs fragments qui pourraient correspondre à des régions codantes pour des JA, et VA chez le bœuf. L'utilisation des séquences à partir de régions "leader" et du clone d'ADN complémentaire comme amorces d'amplification a permis le clonage de deux régions variables VA, par la méthode de "polymerase chain reaction (PCR) à partir d'un ADN d'hybridomes bœuf - souris. Le sous-clonage, le séquençage et la comparaison des séquences des trois clones obtenus (Bov cDNA Lambda, PCRVl et PCRV2) ont montré que le clone Bov cDNA VA, est identique au clone PCRV2; par contre, le clone PCRV1 présente des différences minimes. A partir des résultats décrits dans ce mémoire et de ceux d'Ivanov et al., (Gene. 67.41-48,1988) on peut émettre une hypothèse sur les mécanismes de réarrangement des gènes d'immunoglobulines et celui de la génération de la diversité des anticorps chez le bœuf. En effet, l'expression des chaînes légères k chez le bovin est très faible, donc la diversité des chaînes légères serait assurée par les chaînes A. Cependant, nos résultats révèlent que les régions VA, de bœuf ne sont peut-être pas toutes fonctionnelles. Si cette hypothèse est vraie, un système différent de génération de la diversité serait présent chez le bœuf. En ce sens, il a déjà été rapporté qu'il existe un seul gène codant pour la région V des chaînes d'immunoglobulines de poulet. Chez cet animal, la diversité des anticorps serait assurée par un phénomène d'hyperconversion entre des régions V fonctionnelles et des régions des pseudogènes V qui les flanquent (Reynaud et al., Cell 59, 171-183,1989). En accord avec cette interprétation, une hypothèse semblable d'hyperconversion vient d'être publiée pour expliquer la diversité des chaînes d'immunoglobulines chez le lapin (Becker et al., Cell 63, 987-997, 1990) L'hypothèse d'hyperconversion est intéressante par le fait qu'elle suggère un mécanisme où les pseudogènes jouent un rôle dans la génération de la diversité des immunoglobulines. Ce concept pourrait changer l'interprétation actuelle du rôle des pseudogènes dans les systèmes de gènes multiples

Étude d'une nouvelle protéine de transition de la spermatide

La structure de la chromatine est déterminée par des protéines nucléaires de type histones et non-histones et joue un rôle primordial dans la régulation de l'activité génétique. En effet, le niveau de condensation de la chromatine module l'accessibilité des gènes aux facteurs nucléaires régissant le métabolisme de l'ADN et affecte ainsi la différenciation et la prolifération cellulaire. Nous nous intéressons à l'identification et à la caractérisation de facteurs nucléaires impliqués dans la régulation de l'activité génétique, via des remaniements topologiques de la chromatine. Dans le cadre de cette thématique, la spermatogenèse offre un modèle de choix pour cette étude et ceci grâce aux changements nucléaires qui la caractérisent. En effet, lors de la spermiogenèse chez les mammifères, la chromatine de la spermatide en élongation subit une chute de l'activité transcriptionnelle, suivie d'un haut degré de condensation. Ce processus s'accompagne d’un remplacement des histones de type somatique par des protéines dites "de transition", puis par des protamines. Les facteurs nucléaires ainsi que les mécanismes topologiques impliqués dans la transition, conduisant à l'inactivation génétique de la chromatine spermatique, sont encore mal connus. Récemment l'ADN complémentaire d'une protéine de la spermatide du groupe de haute mobilité a été isolé. L'expression de ce nouveau facteur nucléaire nommé "testis-specific" HMG (tsHMG) coïncide avec la chute transcriptionnelle et la condensation de l'ADN au niveau de la spermatide. TsHMG appartient à une famille de protéines dont les membres sont des facteurs nucléaires qui lient l'ADN et qui sont impliqués dans le changement de l'expression génétique. L'objectif de cette démarche expérimentale est de fournir des éléments de caractérisation permettant de mieux comprendre le rôle biologique de ce facteur. Nous avons initialement surexprimé la protéine tsHMG recombinante dans un système procaryotique. Nous avons ensuite purifié la protéine de fusion. Nos analyses à l'aide de la protéine recombinante indiquée ont montré que cette dernière est un facteur topologique qui condense l’ADN circulaire et protège l'ADN superenroulé négativement contre l'activité de la topoisomérase I (topo I). Nous avons aussi montré que la tsHMG est un substrat de la protéine kinase C (PKC), et que sa phosphorylation est nécessaire à sa liaison avec l'ADN superenroulé ainsi qu'à son activité topologique. Nos expériences de transcription in vitro montrent que tsHMG inhibe la transcription eucaryotique via une inhibition de l’activité de la topo 1. Les immunoprécipitations, les liaisons sur filtre et la microscopie électronique ont donné des résultats qui suggèrent une interaction entre tsHMG et la topo I. Cette interaction nécessite également la phosphorylation de tsHMG par la PKC. Des analyses comparatives de séquences nous ont permis d'identifier deux domaines putatifs de liaison de tsHMG au sillon mineur de la double hélice d'ADN. Ces domaines peptidiques sont présents dans les deux boîtes HMG. Ils adoptent une structure homologue aux agents antitopoisomérase comme la nétropsine, Hoechst 33258 et la distamycine A. Nous avons également montré que la tsHMG augmente l'activité de brisure simple brin de l'ADN par la topo I. Cette activité est beaucoup plus importante que celle observée lors de nos expériences avec l'agent antitopoisomérase et antitumoral camptothécine. Ces résultats suggèrent que la protéine tsHMG est une phosphoprotéine topologique, qui pourrait être impliquée dans la transition de la structure de la chromatine lors de la spermiogenèse et qui pourrait également constituer un nouvel inhibiteur naturel de la topoisomérase I

Étude des gènes de chaînes légères Lambda et Kappa d'immunoglobulines chez les espèces à faible expression Kappa et forte expression Lambda

Toutes les espèces qui possèdent une immunité humorale expriment les immunoglobulines de la classe G. Cependant, la combinaison des chaînes lourdes et légères diffère entre les diverses espèces. Par exemple, la souris et l'homme expriment principalement la chaîne légère lambda (A), tandis que le cheval et le bœuf, expriment principalement la chaîne légère kappa (k). Les mécanismes responsables de l'expression différentielle des chaînes légères des immunoglobulines demeurent encore mal connus. Ainsi dans la présente étude, nous nous sommes adressés aux mécanismes de réarrangements génétiques et à la génération de la diversité des chaînes légères d'immunoglobulines chez le bœuf et chez le cheval. Nous avons initialement criblé une bibliothèque d'ADN complémentaire de bœuf au moyen des sondes Ck et Jk sans résultat positif, ce qui suggérerait que les gènes de la chaîne légère k étaient rarement transcrits. Des bavardages de type Southern utilisant les ADN génomiques de bœuf, de cheval et de souris hybridés avec les sondes Ck et Jk de souris nous ont permis cependant de détecter faiblement la présence des signaux de ces régions. En revanche, l'utilisation d'une sonde CAJA, de bœuf pour cribler une bibliothèque d'ADN complémentaire de bovin "cDNA 5' stretch" a permis le clonâge, le sous-clonâge et le séquençage d'un fragment contenant les régions codantes pour "le leader, le VA, le JA. et le CA," ayant un triplet GTG comme codon d'initiation alternatif à ATG. L'isolement de la région variable VA de ce clone et son utilisation comme sonde avec l'ADN génomique de bœuf et l'ADN génomique d'hybridomes bœuf-souris, ont montré l'existence de plusieurs fragments qui pourraient correspondre à des régions codantes pour des JA, et VA chez le bœuf. L'utilisation des séquences à partir de régions "leader" et du clone d'ADN complémentaire comme amorces d'amplification a permis le clonage de deux régions variables VA, par la méthode de "polymerase chain reaction (PCR) à partir d'un ADN d'hybridomes bœuf - souris. Le sous-clonage, le séquençage et la comparaison des séquences des trois clones obtenus (Bov cDNA Lambda, PCRVl et PCRV2) ont montré que le clone Bov cDNA VA, est identique au clone PCRV2; par contre, le clone PCRV1 présente des différences minimes. A partir des résultats décrits dans ce mémoire et de ceux d'Ivanov et al., (Gene. 67.41-48,1988) on peut émettre une hypothèse sur les mécanismes de réarrangement des gènes d'immunoglobulines et celui de la génération de la diversité des anticorps chez le bœuf. En effet, l'expression des chaînes légères k chez le bovin est très faible, donc la diversité des chaînes légères serait assurée par les chaînes A. Cependant, nos résultats révèlent que les régions VA, de bœuf ne sont peut-être pas toutes fonctionnelles. Si cette hypothèse est vraie, un système différent de génération de la diversité serait présent chez le bœuf. En ce sens, il a déjà été rapporté qu'il existe un seul gène codant pour la région V des chaînes d'immunoglobulines de poulet. Chez cet animal, la diversité des anticorps serait assurée par un phénomène d'hyperconversion entre des régions V fonctionnelles et des régions des pseudogènes V qui les flanquent (Reynaud et al., Cell 59, 171-183,1989). En accord avec cette interprétation, une hypothèse semblable d'hyperconversion vient d'être publiée pour expliquer la diversité des chaînes d'immunoglobulines chez le lapin (Becker et al., Cell 63, 987-997, 1990) L'hypothèse d'hyperconversion est intéressante par le fait qu'elle suggère un mécanisme où les pseudogènes jouent un rôle dans la génération de la diversité des immunoglobulines. Ce concept pourrait changer l'interprétation actuelle du rôle des pseudogènes dans les systèmes de gènes multiples

Étude d'une nouvelle protéine de transition de la spermatide

La structure de la chromatine est déterminée par des protéines nucléaires de type histones et non-histones et joue un rôle primordial dans la régulation de l'activité génétique. En effet, le niveau de condensation de la chromatine module l'accessibilité des gènes aux facteurs nucléaires régissant le métabolisme de l'ADN et affecte ainsi la différenciation et la prolifération cellulaire. Nous nous intéressons à l'identification et à la caractérisation de facteurs nucléaires impliqués dans la régulation de l'activité génétique, via des remaniements topologiques de la chromatine. Dans le cadre de cette thématique, la spermatogenèse offre un modèle de choix pour cette étude et ceci grâce aux changements nucléaires qui la caractérisent. En effet, lors de la spermiogenèse chez les mammifères, la chromatine de la spermatide en élongation subit une chute de l'activité transcriptionnelle, suivie d'un haut degré de condensation. Ce processus s'accompagne d’un remplacement des histones de type somatique par des protéines dites "de transition", puis par des protamines. Les facteurs nucléaires ainsi que les mécanismes topologiques impliqués dans la transition, conduisant à l'inactivation génétique de la chromatine spermatique, sont encore mal connus. Récemment l'ADN complémentaire d'une protéine de la spermatide du groupe de haute mobilité a été isolé. L'expression de ce nouveau facteur nucléaire nommé "testis-specific" HMG (tsHMG) coïncide avec la chute transcriptionnelle et la condensation de l'ADN au niveau de la spermatide. TsHMG appartient à une famille de protéines dont les membres sont des facteurs nucléaires qui lient l'ADN et qui sont impliqués dans le changement de l'expression génétique. L'objectif de cette démarche expérimentale est de fournir des éléments de caractérisation permettant de mieux comprendre le rôle biologique de ce facteur. Nous avons initialement surexprimé la protéine tsHMG recombinante dans un système procaryotique. Nous avons ensuite purifié la protéine de fusion. Nos analyses à l'aide de la protéine recombinante indiquée ont montré que cette dernière est un facteur topologique qui condense l’ADN circulaire et protège l'ADN superenroulé négativement contre l'activité de la topoisomérase I (topo I). Nous avons aussi montré que la tsHMG est un substrat de la protéine kinase C (PKC), et que sa phosphorylation est nécessaire à sa liaison avec l'ADN superenroulé ainsi qu'à son activité topologique. Nos expériences de transcription in vitro montrent que tsHMG inhibe la transcription eucaryotique via une inhibition de l’activité de la topo 1. Les immunoprécipitations, les liaisons sur filtre et la microscopie électronique ont donné des résultats qui suggèrent une interaction entre tsHMG et la topo I. Cette interaction nécessite également la phosphorylation de tsHMG par la PKC. Des analyses comparatives de séquences nous ont permis d'identifier deux domaines putatifs de liaison de tsHMG au sillon mineur de la double hélice d'ADN. Ces domaines peptidiques sont présents dans les deux boîtes HMG. Ils adoptent une structure homologue aux agents antitopoisomérase comme la nétropsine, Hoechst 33258 et la distamycine A. Nous avons également montré que la tsHMG augmente l'activité de brisure simple brin de l'ADN par la topo I. Cette activité est beaucoup plus importante que celle observée lors de nos expériences avec l'agent antitopoisomérase et antitumoral camptothécine. Ces résultats suggèrent que la protéine tsHMG est une phosphoprotéine topologique, qui pourrait être impliquée dans la transition de la structure de la chromatine lors de la spermiogenèse et qui pourrait également constituer un nouvel inhibiteur naturel de la topoisomérase I