Étude d'une nouvelle protéine de transition de la spermatide

Abstract

La structure de la chromatine est déterminée par des protéines nucléaires de type histones et non-histones et joue un rôle primordial dans la régulation de l'activité génétique. En effet, le niveau de condensation de la chromatine module l'accessibilité des gènes aux facteurs nucléaires régissant le métabolisme de l'ADN et affecte ainsi la différenciation et la prolifération cellulaire. Nous nous intéressons à l'identification et à la caractérisation de facteurs nucléaires impliqués dans la régulation de l'activité génétique, via des remaniements topologiques de la chromatine. Dans le cadre de cette thématique, la spermatogenèse offre un modèle de choix pour cette étude et ceci grâce aux changements nucléaires qui la caractérisent. En effet, lors de la spermiogenèse chez les mammifères, la chromatine de la spermatide en élongation subit une chute de l'activité transcriptionnelle, suivie d'un haut degré de condensation. Ce processus s'accompagne d’un remplacement des histones de type somatique par des protéines dites "de transition", puis par des protamines. Les facteurs nucléaires ainsi que les mécanismes topologiques impliqués dans la transition, conduisant à l'inactivation génétique de la chromatine spermatique, sont encore mal connus. Récemment l'ADN complémentaire d'une protéine de la spermatide du groupe de haute mobilité a été isolé. L'expression de ce nouveau facteur nucléaire nommé "testis-specific" HMG (tsHMG) coïncide avec la chute transcriptionnelle et la condensation de l'ADN au niveau de la spermatide. TsHMG appartient à une famille de protéines dont les membres sont des facteurs nucléaires qui lient l'ADN et qui sont impliqués dans le changement de l'expression génétique. L'objectif de cette démarche expérimentale est de fournir des éléments de caractérisation permettant de mieux comprendre le rôle biologique de ce facteur. Nous avons initialement surexprimé la protéine tsHMG recombinante dans un système procaryotique. Nous avons ensuite purifié la protéine de fusion. Nos analyses à l'aide de la protéine recombinante indiquée ont montré que cette dernière est un facteur topologique qui condense l’ADN circulaire et protège l'ADN superenroulé négativement contre l'activité de la topoisomérase I (topo I). Nous avons aussi montré que la tsHMG est un substrat de la protéine kinase C (PKC), et que sa phosphorylation est nécessaire à sa liaison avec l'ADN superenroulé ainsi qu'à son activité topologique. Nos expériences de transcription in vitro montrent que tsHMG inhibe la transcription eucaryotique via une inhibition de l’activité de la topo 1. Les immunoprécipitations, les liaisons sur filtre et la microscopie électronique ont donné des résultats qui suggèrent une interaction entre tsHMG et la topo I. Cette interaction nécessite également la phosphorylation de tsHMG par la PKC. Des analyses comparatives de séquences nous ont permis d'identifier deux domaines putatifs de liaison de tsHMG au sillon mineur de la double hélice d'ADN. Ces domaines peptidiques sont présents dans les deux boîtes HMG. Ils adoptent une structure homologue aux agents antitopoisomérase comme la nétropsine, Hoechst 33258 et la distamycine A. Nous avons également montré que la tsHMG augmente l'activité de brisure simple brin de l'ADN par la topo I. Cette activité est beaucoup plus importante que celle observée lors de nos expériences avec l'agent antitopoisomérase et antitumoral camptothécine. Ces résultats suggèrent que la protéine tsHMG est une phosphoprotéine topologique, qui pourrait être impliquée dans la transition de la structure de la chromatine lors de la spermiogenèse et qui pourrait également constituer un nouvel inhibiteur naturel de la topoisomérase I