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    P2 purinoceptors signaling in fibroblasts of rat subcutaneous tissue

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    Mestrado em Biologia Molecular e CelularO tecido conjuntivo parece estar envolvido na génese de diversas condições patológicas. O aumento da rigidez do tecido conjuntivo, resultante da fibrose, pode constituir um factor importante no mecanismo patogénico da dor crónica resistente a fármacos (Langevin & Sherman, 2007). Por outro lado, os nucleótidos extracelulares parecem estar envolvidos na fisiopatologia da dor crónica (Burnstock, 2001). Assim, este estudo teve como objectivo averiguar o efeito dos nucleótidos de adenina e uridina na proliferação e síntese de colagénio tipo I de fibroblastos do tecido subcutâneo de rato em cultura. Os resultados obtidos mostram que a incubação com UTP (0.3-100 M, n=5) induz um aumento da proliferação e da produção de colagénio tipo I, o qual é dependente da concentração. Contrariamente, o agonista selectivo dos receptores P2Y2, o MRS 2768 (10 μM, n=3), não teve qualquer efeito no que se refere à proliferação, mas diminuiu significativamente (P<0.05) a síntese de colagénio tipo I. Uma vez que o aumento da produção de colagénio induzida pelo UTP (100 μM) foi proporcional ao aumento do número de células (proliferação celular),podemos especular que este aumento se deve ao aumento do número de células per si do que a uma maior actividade sintética de cada célula. Assim, ao normalizar os valores do colagénio tipo I em relação aos valores obtidos do MTT para os mesmos momentos/dias, deixamos de observar diferenças estatisticamente significativas entre o controlo e as células expostas ao UTP. Uma vez que os receptores P2Y2 não parecem estar envolvidos nesta resposta do UTP (100 μM), esta poderá estar a ser mediada pela activação dos receptores P2Y4 e/ou P2Y6. Considerando que o RB-2 (10 μM, n=5), um antagonista não selectivo que actua preferencialmente no subtipo de receptores P2Y4, não foi capaz de modificar a resposta induzida pelo UTP (100 μM), os receptores P2Y4 parecem também não estar envolvidos. Por outro lado, o MRS 2578 (100 nM), um antagonista selectivo dos receptores P2Y6, atenuou de forma significativa o aumento induzido pelo UTP (100 μM). A corroborar os nossos resultados, uma análise imunocitoquímica mostrou uma imunorreactividade positiva contra os receptores P2Y2 e P2Y6, mostrando um padrão de marcação citoplasmático/membranar, o qual é típico para este tipo de receptores, ao contrário do padrão nuclear exibido pelo anticorpo contra os receptores P2Y4. Relativamente ao envolvimento dos receptores sensíveis ao ADP, os resultados obtidos mostraram que o ADPβS (10-100 μM, n=3-6), um análogo estável do ADP, não parece induzir efeitos significativamente diferentes (P>0.05) na proliferação celular. Contudo, a sua incubação continuada aumentou a produção de colagénio tipo I de forma dependente da concentração (P<0.05). De modo a identificar os receptores purinérgicos envolvidos neste efeito, testamos o ADPβS (100 μM) na presença do MRS 2179 (0.3 μM), do AR-C 66096 (0.1 μM), e do MRS 2211 (10 μM), os quais antagonizam selectivamente os receptores P2Y1, P2Y12 e P2Y13, respectivamente. O efeito facilitatório induzido pelo ADPβS (100 μM) foi atenuado de forma significativa na presença do antagonista dos receptores P2Y1, o MRS 2179 (0.3 μM, n=3), sem ser afectado pelo antagonista dos receptores P2Y12, o AR- C 66096 (0.1 μM, n=3). Pelo contrário, o MRS 2211 (10 μM, n=2) potenciou o aumento da produção de colagénio induzida pelo ADPβS (100 μM), indicando assim que a síntese de colagénio tipo I induzida pelo receptor P2Y1 pode estar a ser parcialmente influenciada por uma activação síncrona do receptor inibitório P2Y13. Por último, uma análise por imunocitoquímica mostrou que estas células apresentam imunorreactividade positiva para os receptores P2Y1 e P2Y13, exibindo um padrão citoplasmático/membranar, contrariamente ao padrão nuclear dos receptores ostentado pelo anticorpo contra os receptores P2Y12. Concluindo, a remodelação da fáscia superficial induzida pelos fibroblastos parece ser regulada por um balanço entre a activação dos receptores P2Y2 e P2Y6, assim como dos receptores P2Y13 e P2Y1. Clarificar as vias que conduzem ao processo de fibrose pode representar uma oportunidade para esclarecer o seu envolvimento na patogénese da dor crónica musculo-esquelética, bem como ser útil no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.Connective tissue may be involved in the pathogenesis of a wide variety of disease conditions. Increased connective tissue stiffness due to fibrosis may be an important link to the pathogenic mechanism leading to drug-resistant chronic pain (Langevin & Sherman, 2007). In addition, extracellular nucleotides seem to be involved in the pathophysiology of chronic pain (Burnstock, 2001). Therefore, we aimed at investigating the effect of adenine and uridine nucleotides on the proliferation and synthesis of type I collagen by rat fibroblasts from subcutaneous connective tissue. The results showed that continuous incubation of UTP (0.3-100 M, n=5) concentration-dependently increased fibroblasts proliferation, as also increased the synthesis of type I collagen above the control levels. Conversely, the selective P2Y2 agonist, MRS 2768 (10 μM, n=3), was devoid of effect in what concerns proliferation, but significantly (P<0.05) decreased type I collagen synthesis. Since the increase in type I collagen synthesis induced by UTP (100 μM) was proportional to the increase in the amount of cells in the culture (fibroblasts proliferation), we speculated that such an increase could be related to the increase in the cell number rather than a higher synthetic activity. Thus, we performed a more detailed data analysis, in which we normalized type I collagen production taking into consideration the MTT values obtained at the same time points, and we observed no longer significant differences between control and UTP-exposed cells. Discounting the contribution of MRS 2768-sensitive P2Y2 receptors, UTP (100 μM)-induced increase in cells proliferation could be due to P2Y4 and/or P2Y6 receptor activation. Since RB-2 (10 μM, n=5), a non-selective antagonist that acts preferentially on the P2Y4 subtype, did not modify the effect of UTP (100 μM), P2Y4 does not seem to be involved. In turn, MRS 2578 (100 nM), which is a selective P2Y6 antagonist, significantly attenuated UTP (100 μM)-induced increase. To corroborate our results, an immunocytochemistry analysis showed a positive immunoreactivity against the P2Y2 and P2Y6 receptors exhibiting a cytoplasmic/membrane labeling pattern, which is typical for those receptors in many different cells, conversely to the nuclear labeling pattern exhibited by the antibody against the P2Y4. To investigate the involvement of ADP-sensitive P2 receptors on cell proliferation and extracellular matrix production, fibroblast cultures were continuously incubated with the stable ADP analogue, ADPβS (10-100 μM). Results obtained with ADPβS (10-100 μM, n=3-6) showed no significant (P>0.05) differences in fibroblast cells proliferation. However, a continuous incubation with ADPβS (10-100 μM, n=2-5) concentration-dependently increased type I collagen production by fibroblasts (P<0.05). In order to identify which purinoceptor(s) that could be mediating this effect, we tested ADPβS (100 μM) in the presence of MRS 2179 (0.3 μM), AR-C 66096 (0.1 μM), and MRS 2211 (10 μM), which antagonize selectively ADP-sensitive P2Y1, P2Y12 and P2Y13 receptors, respectively. The facilitatory effect of ADPβS (100 μM) was significantly attenuated in the presence of the P2Y1 antagonist, MRS 2179 (0.3 μM, n=3), without being affected by the P2Y12 antagonist, AR- C 66096 (0.1 μM, n=3). In contrast, MRS 2211 (10 μM, n=2) potentiated the effect of ADPβS (100 μM) on type I collagen synthesis, thus indicating that the P2Y1-receptor-induction of type I collagen synthesis may be partially counteracted by synchronous activation of the inhibitory P2Y13 receptor. Finally, an immunocytochemistry analysis showed that these cells exhibit immunoreactivity to P2Y1 and P2Y13 receptors with a cytoplasmic/membrane staining pattern, conversely to the nuclear pattern of P2Y12. Concluding, a delicate balance between the activation of P2Y2 and P2Y6, as well as P2Y13 and P2Y1 purinoceptors, might regulate fibroblast’s induced superficial fascia remodeling. Targeting the pathways leading to fibrosis may represent an opportunity to clarify its involvement in the pathogenesis of musculoskeletal chronic pain and it may be useful for designing novel therapeutic strategies to overcome this disease

    Derivados de cromenopirazoles como ligandos de receptores de cannabinoides

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    Derivados de cromenopirazoles como ligandos de receptores de cannabinoides. Compuestos derivados de cromenopirazoles que son ligandos de receptores de cannabinoides, su uso para la fabricación de un medicamento, uso de este medicamento para el tratamiento y/o la prevención de trastornos asociados a los receptores de cannabinoides, uso de dicho compuesto como reactivo en ensayos biológicos relacionados con receptores de cannabinoides y procedimiento de obtención de los mismos.Peer reviewedConsejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad Complutense de MadridA1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

    Citral inibe a inflamação aguda e nocicepção em camundongos: o papel dos receptores TLR4 e TLR2/DECTINA-1

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    TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Araranguá. Fisioterapia.Citral (3,7-dimethyl-2,6-octadienal), um monoterpeno de cadeia aberta e principal componente bioativo do capim limão, apresenta diferentes propriedades farmacológicas, tais como: i) inibidor da atividade oxidante de células apresentadoras de antígenos (APCs), tais como os macrófagos; ii) inibidor da ativação do fator de transcrição pró-inflamatório NF-κB; iii) inibidor da expressão da enzima ciclooxigenase do tipo 2 (COX-2); e iv) ativador do fator de transcrição pró-resolução receptor proliferador de peroxissomo (PPAR)-α e γ. Além disso, o citral atua como agonista inverso dos canais iônicos e receptores de potencial transitório (TRPs) expressos em neurônios sensoriais (TRPV1, TRPV3, TRPM8 e TRPA1), produzindo uma inibição de longa duração de TRPV1–3 e TRPM8, demonstrando potencial analgésico em diferentes tipos de dor. No entanto, até o presente momento, não existem relatos dos efeitos antiinflamatórios e analgésicos de citral em modelos inflamação aguda, assim como a sua interação com a produção de eicosanóides e modulação dos receptores do tipo Toll-like (TLR). Neste trabalho demonstramos que o tratamento oral com citral (nas doses de 50 – 300 mg/kg) significativamente inibiu o edema de pata e a alodinia térmica induzidos pela carragenina. Além disso, o pré- tratamento com o citral inibiu a resposta inflamatória induzida por LPS e zimosan, ligantes dos receptores TLR4- e TLR2/dectina-1, respectivamente. Por fim, nossos resultados demonstram os efeitos antiinflamatórios e analgésicos do citral, os quais parecem estar relacionados à modulação dos receptores da imunidade inata, tais como o TLR4 e o TLR2/dectina-1.Citral (3,7-dimethyl-2,6-octadienal), a bioactive component of lemongrass, can inhibit macrophage oxidant activity, and NF-κB activation, as well as COX- 2 expression and activation peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α and γ. In addition, citral activates TRP channels in sensory neurons (TRPV1 and TRPV3, TRPM8, and TRPA1), and produces long-lasting inhibition of TRPV1–3 and TRPM8, while transiently blocking TRPV4 and TRPA1, demonstrating analgesic potential for allodynia and other types of pain. However, there are no reports about the anti-inflammatory and analgesic effects of citral in induced inflammation by carrageenan- and TLR-depend pathways and algesic response. In this study, we investigated the effect of citral in experimental models of acute inflammation and nociception in mice. Oral treatment with citral (50 – 300 mg/kg) significantly inhibited carrageenaninduced paw edema and thermal allodynia. Furthermore, citral also modulated the inflammation induced by LPS and zymosan, a TLR4- and TLR2/dectin-1 ligand, respectively. Our results demonstrate that oral citral treatment displayed anti-inflammatory and analgesic effects, and these effects seem to be related to its TLR4 and TLR2/dectin-1 modulation

    Setting GABA levels : GABA transporters modulation by adenosine receptors

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    Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012Gamma-aminobutyric acid is the main inhibitory neurotransmitter in central nervous system. To assure a controlled GABAergic transmission GABA must be quickly removed from synapse, which occurs through specific transporters expressed both in pre-synaptic terminal (GAT-1) and surrounding astrocytes (GAT-1 and GAT-3). Adenosine, which is a well-known neuromodulator, promotes GABA release in the hippocampus (Cunha and Ribeiro, 2000). The main goal of this thesis was to identify a possible role of adenosine upon GABA uptake into pre-synaptic terminals and into astrocytes. In pre-synaptic terminals, the removal of endogenous adenosine by ADA inhibited GABA uptake, an effect that was mimicked by the blockade of A2A receptors. Thus, endogenous adenosine, through the activation of A2A receptors, promotes GABA uptake into pre-synaptic terminals. Experiments with activators and inhibitors of transduction pathways revealed that AC/cAMP/PKA is the transduction pathway associated with this effect. In fact, the activation of PKA restrains an inhibitory tonic influence mediated by PKC, resulting in an increase of GABA uptake. The increase of transport rate occurs through the enhancement of the expression of GAT-1 at the surface membrane. In astrocytes, adenosine has a biphasic effect upon GABA uptake. This biphasic effect is mediated by the adenosine A1-A2A receptors heteromers, whose presence in astrocytes was identified in this work. The adenosine A1-A2A receptor heteromer is coupled to both Gi/0 and Gs protein, being AC/cAMP/PKA the intracellular pathway associated. At low concentration, adenosine activates the A1 protomer, which through Gi/0 protein inhibit AC, decreasing PKA activity and consequently, GABA uptake mediated by both GAT-1 and GAT-3. When adenosine levels rise, adenosine activates preferentially the A2A protomer, which through Gs activity enhances PKA activity, promoting GABA uptake into astrocytes. The adenosine A1-A2A receptors heteromer can be viewed as a unique entity since it reaches and leaves the membrane as an entire complex and all the components have to be available for the heteromer be functional. Moreover, this work clearly showed that the heteromer is associated with both Gs and Gi/0, being a tetramer of A1-A1-A2A-A2A, rather than an A1-A2A complex coupled to Gq as previously thought. Globally, at tripartite synapse level, adenosine controls the final destination of GABA after its release into the synapse. At low levels, adenosine will inhibit uptake into astrocytes but promote the uptake of GABA into presynaptic terminals, therefore facilitating the inhibitory phasic and tonic transmission. At higher levels of adenosine, GABA uptake into astrocytes will be favoured, which may decrease GABAergic tonic transmission, therefore facilitating excitability. In conclusion, this work highlighted a yet unknown mechanism through which adenosine may contribute to the switch between inhibition and excitation, through a concerted cross-talk between astrocytes and inhibitory neurons.O ácido gama-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório do Sistema Nervoso Central (SNC). Uma vez na sinapse o GABA é rapidamente recaptado através de transportadores específicos expressos pelos neurónios mas também pelas células da glia, que envolvem a sinapse. A rápida recaptação de GABA pelos transportadores permite um controlo adequado dos níveis de GABA na sinapse, o que é fundamental para a limitação temporal e espacial da transmissão inibitória. Este controlo é assegurado por transportadores específicos expressos no terminal pré-sináptico e nos astrócitos que envolvem a sinapse. Actualmente são conhecidos quatro transportadores de GABA: três de alta afinidade (GAT-1, GAT-2, GAT- 3) e um de baixa afinidade (BGT-1). O GAT-1 é o principal transportador de GABA, sendo expresso pelos neurónios e também pelas células da glia. Por sua vez, O GAT-3 é o principal transportador das células gliais. Em conjunto, estes dois transportadores são os responsáveis pela recaptação de GABA nas sinapses do sistema nervoso central. A adenosina é um conhecido neuromodulador, que desempenha, ao nível do sistema nervoso central, um vasto leque de acções, que resulta numa inibição tónica do SNC. De entre as funções desempenhadas, a adenosina modula a concentração de neurotransmissores da sinapse, regulando quer a sua libertação vesicular quer a sua recaptação por transportadores. A adenosina exerce as suas acções através de receptores acoplados a proteínas G. Até ao momento foram identificados quatro subtipos diferentes de receptores: dois de alta afinidade (A1 e A2A) e dois de baixa afinidade (A2B e A3). Os receptores A1 e A3 são receptores inibitórios, estando classicamente acoplados a proteínas Gi/0. Por seu lado, os receptores do subtipo A2 são receptores excitatórios, estando geralmente acoplados a proteínas Gs. Tendo como ponto de partida o efeito modulador da adenosina através da activação dos receptores A2A, sobre libertação de GABA no hipocampo (Cunha e Ribeiro, 2000), este trabalho teve como principal objectivo a identificação de um possível efeito modulador da adenosina sobre a recaptação de GABA para os terminais présinápticos e também para os astrócitos, através dos transportadores GAT-1 e GAT-3. Os resultados obtidos neste trabalham indicam claramente que a adenosina através da activação dos receptores A2A promove a recaptação de [3H]GABA para os terminais pré-sinápticos mediada pelo transportador GAT-1. Com o objectivo de determinar o efeito da adenosina endógena, os terminais pré-sinápticos (sinaptossomas) foram incubados com adenosina desaminase (ADA, 1U/ml), tendo sido observada uma diminuição da recaptação de [3H]GABA. A ADA degrada a adenosina em inosina, um metabolito inactivo para os receptores de adenosina, permitindo assim inferir o efeito da adenosina endógena. O efeito inibitório causado pela remoção da adenosina endógena foi mimetizado pelo bloqueio dos receptores A2A com o antagonista selectivo SCH 58261 (50 nM). O envolvimento dos receptores A2A foi ainda confirmado através do uso do agonista selectivo destes receptores (CGS 21680, 30 nM): a activação dos receptores A2A pelo CGS 21680 promoveu a recaptação de [3H]GABA, mediada pelo transportador GAT-1. O envolvimento de outros subtipos de receptores de adenosina, especificamente os subtipos A1 e A2B, foi avaliado através do uso de agonistas e antagonistas selectivos. Tanto a activação como o bloqueio dos receptores A1 ou A2B não causaram qualquer efeito sobre a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1 em sinaptossomas. Ensaios de biotinilação, realizados após incubação dos sinaptossomas com o agonista selectivo dos receptores A2A, mostraram que o efeito excitatório da adenosina sobre a recaptação de [3H]GABA ocorre através do aumento do número de transportadores GAT-1 na membrana celular. Este efeito foi confirmado por curvas de saturação do transportador GAT-1, que mostraram um aumento da velocidade máxima do transportador após incubação com o agonista selectivo dos receptores A2A, o que é indicativo de um aumento do número de transportadores GAT-1 na membrana celular. A via de transdução de sinal associada ao efeito dos receptores A2A foi identificada através de ensaios de recaptação realizados na presença de bloqueadores e activadores de cinases intracelulares. O bloqueio da proteína cinase do tipo A (PKA) pelo H-89 (1mM) preveniu totalmente o efeito do CGS 21680, enquanto a activação da adenilato ciclase (AC) pela forskolin (10mM) imitou a acção do agonista selectivo dos receptores A2A. Assim, os resultados indicam que a adenosina, por activação dos receptores A2A promove a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1, através da activação da via da PKA. Foi ainda testado o envolvimento da via de sinalização mediada pela proteína cinase do tipo C (PKC). O bloqueio da PKC pelo GF109203X (1mM) promoveu a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1. Em concordância, a activação da PKC por ésteres de forbol (12,13- didecanoato de forbol – PDD 250nM) inibiu a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1, indicando que a PKC está endogenamente a inibir o transporte de [3H]GABA para os terminais pré-sinápticos. Estes resultados sugerem assim, o envolvimento das duas vias de sinalização na recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1. Estudos de recaptação realizados com diferentes combinações de activadores e bloqueadores de ambas as proteínas cinases indicam que a activação dos receptores A2A da adenosina, com consequente activação da PKA, restringe o efeito tónico inibitório da PKC sobre o transporte de [3H]GABA, o que resulta numa potenciação da recaptação de GABA através do transportador GAT- 1 para o terminal pré-sináptico, por aumento do número de transportadores presentes na membrana celular. O estudo de recaptação de [3H]GABA em astrócitos sugere a existência de um efeito bifásico mediado pela adenosina sobre os transportadores GAT-1 e GAT-3. A incubação de culturas primárias de astrócitos com cloroadenosina (CADO), um análogo nãoxxxiii metabolizável da adenosina teve um efeito bifásico sobre o transporte: a baixas concentrações (0,3μM), a CADO inibiu o transporte enquanto que concentrações mais elevadas (3 e 10 μM) de CADO promoveram a recaptação de [3H]GABA. Por outro lado, a remoção de adenosina endógena pela acção da adenosina desaminase (ADA, 1U/ml) diminuiu a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1 e por GAT-3, sugerindo que as concentrações de adenosina endógena presentes na cultura de astrócitos promovem o transporte de [3H]GABA. A realização de ensaios de recaptação com fármacos selectivos para os receptores de adenosina permitiu a identificação dos receptores envolvidos. Assim, o agonista selectivo dos receptores A2A (CGS 21680, 30nM) promoveu a recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1 e GAT-3. Surpreendentemente, este efeito para além de ter sido bloqueado pelo antagonista selectivo dos receptores A2A (SCH 58261, 50nM) foi também prevenido pelo bloqueio dos receptores A1 com o antagonista selectivo DPCPX (50nM). Por seu lado, a activação dos receptores A1 com o agonista selectivo CPA (30nM) levou à diminuição da recaptação de [3H]GABA mediada por GAT-1 e por GAT-3. Este efeito foi bloqueado quer pelo antagonista dos receptores A1 quer pelo antagonista dos receptores A2A. Estes resultados sugerem a existência de uma interacção entre os receptores A1 e A2A da adenosina nos astrócitos. De facto, a existência de uma interacção entre os receptores A1 e A2A da adenosina é conhecida desde há bastante tempo, tendo sido descrita inicialmente no hipocampo (Cunha et al., 1994; Lopes et al., 1999) e na junção neuromuscular (Correia-de-Sá e Ribeiro, 1994). A natureza desta interacção era desconhecida até 2006, quando se identificou a ocorrência de heterómeros de receptores da adenosina A1-A2A em células imortalizadas transfectadas (Ciruela et al., 2006), através de ensaios de bioluminesce ressonance energy transfer (BRET). Recorrendo a esta tecnologia, bem como a ensaios de ligação, identificou-se neste estudo, pela primeira vez, a presença de heterómeros de receptores de adenosina A1-A2A nos astrócitos. O estudo reportado nesta dissertação foi pois o primeiro a identificar inequivocamente a presença de heterómeros A1-A2A em células não imortalizadas. A identificação do subtipo de proteínas G acopladas ao heterómero de receptores de adenosina A1-A2A foi realizada através de ensaios de ligação de [35S]GTPgS acoplados a imunoprecipitação e de ensaios de recaptação realizados na presença de toxinas que bloqueiam selectivamente a actividade das proteínas Gs e Gi/0. Os ensaios realizados indicam claramente que os heterómeros de receptores da adenosina A1-A2A estão acoplados a ambas as proteínas Gs e Gi/0, e não a uma única proteína Gq, como inicialmente se supunha, com base no que ocorre na heteromerização dos receptors da dopamina. O trabalho descrito nesta dissertação demonstrou ainda que o heterómero de receptores de adenosina A1-A2A é na verdade um tetrâmero formado por dois receptores A1 e dois receptores A2A (A1- A1-A2A-A2A), o que permite o acoplamento de duas proteínas G diferentes. Ensaios de recaptação de [3H]GABA realizados na presença do activador da AC, forskolin, e do inibidor competitivo da PKA, RpcAMPs, sugerem que o heterómero de receptores de adenosina A1- A2A sinaliza através da via AC/cAMP/PKA. O presente estudo permitiu ainda concluir que os heterómeros de receptores da adenosina A1-A2A funcionam como uma única entidade, que para ser funcional, necessita que todos os componentes estejam disponíveis para activação. Assim se entende que o bloqueio do receptor A1 ou da proteína Gi/0 previna o efeito mediado pela activação dos receptores A2A, bem como o bloqueio dos receptores A2A ou da proteína Gs previna o efeito inibitório mediado pelos receptores A1. Assim, nos astrócitos, o efeito bifásico da adenosina sobre a recaptação de [3H]GABA é mediado pela activação dos heterómeros de receptores da adenosina A1-A2A. A baixa concentração, a adenosina activa preferencialmente os receptores A1, levando à activação de proteínas Gi/0, que, por inibição da actividade da AC, provocam a redução dos níveis de cAMP, inibindo a PKA e reduzindo, consequentemente, a recaptação de GABA mediada por GAT-1 e GAT-3. Por outro lado, em concentrações superiores, a adenosina através da activação dos receptores A2A, e consequente activação de proteínas Gs, por activação da AC, eleva os níveis de cAMP, o que promove a actividade da PKA, e aumenta o transporte de GABA mediada por GAT-1 e GAT-3 em astrócitos. Considerando a sinapse tripartida, os resultados sugerem que em baixas concentrações a adenosina conduz preferencialmente o GABA para o terminal pré-sináptico, favorecendo portanto a transmissão fásica inibitória e impedindo o esgotamento das reservas pré-sinápticas. Em concentrações mais elevadas, a adenosina aumenta a recaptação de GABA pelos astrócitos, o que deverá diminuir a inibição tónica e permitir o aumento da excitabilidade. Assim, através da modulação dos transportadores de GABA, a adenosina pode ser considerada como um agente amplificador do tónus GABAérgico. Quando o tónus inibitório é prevalente, a adenosina direcciona a recaptação de GABA para os terminais pré-sinápticos, facilitando a transmissão fásica inibitória. Pelo contrário, a facilitação da recaptação de GABA pelos astrócitos reduz a inibição tónica, favorecendo a transmissão excitatória. Em suma, este trabalho revela um mecanismo até agora desconhecido, através do qual a adenosina pode contribuir para a transição entre uma situação inibitória e outra excitatória, fenómeno que envolve a interacção entre astrócitos e neurónios inibitórios

    Evaluation of mechanisms involved in a sexual dimorphism of analgesia mediated by kappa opioid receptor in temporomandibular joint

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    Orientador: Claudia Herrera TambeliTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Recentemente foi demonstrado que a ativação de receptores capa opióides localizados na ATM de ratos reduz o comportamento nociceptivo induzido pela injeção se formalina na ATM de ratos, especialmente nas fêmeas na fase diestro do ciclo estral. Sendo a fase diestro aquela que representa baixos níveis hormonais, estes resultados indicam que os hormônios gonadais diminuem a antinocicepção mediada pelos receptores capa na ATM. O objetivo deste trabalho foi investigar o possível mecanismo pelo qual os hormônios gonadais poderiam diminuir a antinocicepção mediada pelos receptores capa opióides através das seguintes hipóteses: (a) Os hormônios gonadais diminuem a antinocicepção mediada pelos receptores capa na ATM por diminuírem a expressão de receptores capa opióides no gânglio trigeminal; (b) O efeito periférico antinociceptivo dos agonistas dos receptores capa opióides é mediado pela ativação da via L-Arginina/NO/GMPc em machos e fêmeas; (c) Os hormônios gonadais diminuem a antinocicepção mediada pelos receptores capa na ATM por diminuírem a ativação da via L-Arginina/NO/GMPc. A análise pela técnica Western blot demonstrou que a expressão protéica dos receptores capa opióides é maior em fêmeas do que em machos, sugerindo que a testosterona induz acentuada diminuição na expressão dos receptores capa opióides. Nas fêmeas, a expressão dos receptores capa opióides foi significativamente maior nas fêmeas em diestro em relação às fêmeas em proestro, sugerindo que os hormônios gonadais femininos também diminuem a expressão dos receptores capa opióides. A co-administração do inibidor da NO-sintase, L-NMMA, ou do inibidor da guanilil ciclase sensível ao NO, ODQ, com o agonista do receptor capa opióide U50,488 bloqueou a antinocicepção mediada pelos receptores capa na ATM de machos e fêmeas, sugerindo que a antinocicepção induzida pelos receptores capa opióides é mediada pela ativação da via L-Arginina/NO/GMPc em ambos os sexos. No entanto, a co-administração de baixas doses de L-NMMA e ODQ com U50,488 significativamente diminuiu a antinocicepção mediada por receptores capa apenas nas fêmeas em diestro. Estes resultados indicam que a antinocicepção mediada pelos receptores capa opióides depende da ativação da via L-Arginina/NO/GMPc em machos e fêmeas. No entanto, o dimorfismo sexual na antinocicepção mediada pelos receptores capa opióides na ATM se deve, pelo menos em parte, pela diminuição da expressão dos receptores capa opióides no gânglio trigeminal pelos hormônios gonadais, especialmente a testosterona. Apesar do envolvimento da via L-Arginin/NO/GMPc na antinocicepção mediada pelo receptor capa na ATM em ambos os sexos, os hormônios gonadais não diminuem a atividade desta via diminuindo o efeito antinociceptivo mediado por receptores capa opióides na ATMAbstract: We have previously demonstrated that activation of kappa opioid receptors located in the TMJ of rats suppresses formalin-induced TMJ nociception behavior especially in females of the diestrus phase of the estrous cycle. Since diestrus is a phase of low gonadal hormonal serum level, these findings indicate that gonadal hormones decrease kappa-mediated TMJ antinociception. The aim of this study was to investigate some of the mechanisms by which gonadal hormones might decrease kappa-mediated antinociception by testing the following hypothesis: (a) Gonadal hormones decrease kappa-mediated TMJ antinociception through a down regulation in the expression of kappa oipoid receptors in the trigeminal ganglia; (b) The peripheral antinociceptive effect of kappa opioid receptor agonists is mediate by the activation of the L-Arginine/NO/cGMP pathway in both males and females; (c) Gonadal hormones decrease kappa-mediated TMJ antinociception by diminishing the activity of the L-Arginine/NO/cGMP. Western blot analysis demonstrated that protein expression of KORs was significantly higher in females than in males, suggesting that testosterone induces a strong down-regulation in KOR expression. In females, KOR expression was significantly higher in those in diestrus than in proestrus suggesting that female gonadal hormones also down-regulate KOR expression in the trigeminal ganglia. Co-application of the NOS inhibitor L-NMMA or of the NO-sensitive guanylyl cyclase inhibitor ODQ with the kappa opioid receptor agonist U50,488 blocked kappa-mediated TMJ antinociception in males and females suggesting that antinociception induced by activation of peripheral kappa opioid receptors is mediated by the L-arginine/NO/cGMP pathway in both sexes. However, co-application of lower doses of L-NMMA and ODQ with U50,488 significantly diminished kappa -mediated TMJ antinociception only in diestrus females. These results indicate that kappa-mediated TMJ antinociception depends on activation of the L-Arginine/NO/cGMP pathway in both males and females. However, the sexual dimorphism in kappa-mediated TMJ antinociception is mediated, at least in part, by the down regulation in the expression of kappa-oipoid receptors in the trigeminal ganglia induced by gonadal hormones, especially testosterone. Despite the involvement of the L-Arginine/NO/cGMP pathway in kappa-mediated TMJ antinociception in both sexes, gonadal hormones do not diminish the activity of this pathway to decrease kappa-mediated TMJ antinociceptionDoutoradoFisiologia OralDoutor em Odontologi

    Receptores hormonales en cáncer de mama: receptores de estrógenos y algo más

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    Seventy per cent of breast cancers are luminal carcinomas that express alpha estrogen receptors (ER). For several decades, its expression has been used as a therapeutic target in patients with breast cancer. These therapies are aimed at blocking ER or inhibiting ligand synthesis. The expression of progesterone receptors (PR) is evaluated as a prognostic factor together with ER. It has been shown that there are two predominant PR isoforms with different molecular weight, isoform A and isoform B, which are not distinguished by immunohistochemical techniques. The available evidence indicates that the PR isoform ratio may have both a prognostic and predictive value of the response to antiprogestin treatment. In luminal mammary tumors, androgen receptors (AR) are expressed in a high percentage and the AR/ER or AR/PR ratio could be a prognostic factor. In ER- tumors, AR expression is an indicator of poor prognosis and it is proposed that they may be susceptible to antiandrogen treatment. Finally, the expression of glucocorticoid receptors (GR) would be an indicator of good or bad prognosis in luminal or ERtumors, respectively. In ER- tumors, metastases express higher levels of nuclear GR than primary tumors and therapies that block GR could improve the efficacy of chemotherapy. Given the crosstalk of pathways triggered by different hormone receptors, it is possible that in the future, a therapeutic scheme can be administered that contemplates the expression of ER, PR isoforms, AR and GR.El 70 por ciento de los carcinomas mamarios son luminales y expresan receptores de estrógenos alfa (RE). Desde hace varias décadas, su expresión se utiliza como blanco terapéutico en pacientes con cáncer de mama. Estas terapias están dirigidas a bloquear el RE o a inhibir la síntesis del ligando. La expresión de receptores de progesterona (RP) se evalúa como factor pronóstico junto con los RE. Se ha comprobado que existen dos isoformas predominantes de RP de distinto peso molecular, isoforma A e isoforma B, que no se distinguen por técnicas de inmunohistoquímica. Las evidencias indican que la proporción de isoformas de RP podría tener tanto un valor pronóstico como predictivo de la respuesta a un tratamiento con antiprogestágenos. En tumores mamarios luminales, los receptores de andrógenos (RA) se expresan en un alto porcentaje y la proporción de RA/RE o RA/RP podría ser un factor pronóstico. En tumores RE-, la expresión de RA es indicador de mal pronóstico y se propone que serían susceptibles a un tratamiento con antiandrógenos. Por último, la expresión de receptores de glucocorticoides (RG) sería un indicador de buen o mal pronóstico en tumores luminales o RE-, respectivamente. En tumores RE-, las metástasis expresan mayores niveles de RG nuclear que los tumores primarios y las terapias que bloquean los RG podrían mejorar la eficacia de la quimioterapia. Dado los entrecruzamientos de vías gatilladas por distintos receptores hormonales es posible que en un futuro se pueda administrar un esquema terapéutico que contemple la expresión de RE, isoformas de RP, RA y RG.Fil: Lamb, Caroline Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Vanzulli, Silvia. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires; ArgentinaFil: Lanari, Claudia Lee Malvina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

    Heteroreceptor complexes and their allosteric receptor-receptor interactions in the central nervous system. Focus on examples from Dopamine D2 and Serotonin 5-HT1a receptors

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    GPCR interacting proteins (specially β- arrestin) and their receptor-protein interactions are also covered but their interactions with the allosteric receptor-receptor interactions in heteroreceptor complexes remain to be elucidated. The physiological and pathological relevance of the allosteric receptor-receptor interactions in heteroreceptor complexes is emphasized and novel strategies for treatment of mental and neurological disease are introduced based on this new biological principle of integration. This work gives further experimental evidences which strongly support the current view that allosteric receptor–receptor interactions in heteroreceptor complexes appear to represent a new principle in biology making possible integration of signals already at the level of the plasma membrane. These heteroreceptor complexes and their dynamics may be part of the molecular basis of learning and memory. The receptor protomers and their allosteric receptor-receptor interactions can be disturbed in neurological and mental disorders, and in diseases of peripheral tissues like the endocrine, cardiovascular and immune systems. The dopamine (DA) neuron system most relevant for schizophrenia and Parkinson s diseases is the meso-limbic-cortical DA system inter alia densely innervating subcortical limbic regions as well as the dorsal striatum. The field of dopamine D2Rs changed significantly with the discovery of many types of D2R heteroreceptor complexes in the ventral and dorsal striatum. The results indicate that the D2R is a hub receptor (www.gpcr-hetnet.com) which interacts not only with many other GPCRs including DA isoreceptors but also with ion-channel receptors, receptor tyrosine kinases, scaffolding proteins and DA transporters. Disturbances in several of these D2R heteroreceptor complexes may contribute to the development of schizophrenia and Parkinson s diseases through changes in the balance of diverse D2R homo- and heteroreceptor complexes mediating the DA signal, especially to the ventral striato-pallidal GABA pathway. In schizophrenia, this will have consequences for the control of this pathway of the glutamate drive to the prefrontal cortex via the mediodorsal thalamic nucleus which can contribute to psychotic processes. Allosteric receptor-receptor interactions in GPCR heteromers appeared to introduce an intermolecular allosteric mechanism contributing to the diversity and bias in the GPCR protomers. In A2A-D2R heteroreceptor complexes allosteric A2A-D2R receptor-receptor interaction brings about a biased modulation of the D2R protomer signalling (Chapter 1). A conformational state of the D2R is induced which moves away from Gi/o signaling and instead favours b-arrestin2 mediated signalling which may be the main mechanism for its atypical antipsychotic properties especially linked to the limbic A2AR-D2R heteroreceptor complexes. Furthermore, D2R-NTS1R heterocomplexes also exist in the ventral and dorsal striatum (Chapter 2) and likely also in midbrain DA nerve cells as D2R-NTS1R autoreceptor complexes where neurotensin produces antipsychotic and propsychotic actions, respectively. D2R protomer appeared to bias the specificity of the NT orthosteric binding site towards neuromedin N vs neurotensin in the heteroreceptor complex. There is a new awareness that Receptor tyrosine kinases (RTK) and transmitter activated GPCR possess the capacity for transactivation not only via GPCR induced release of neurotrophic factors, but also during signal initiation and propagation, using shared signaling pathways or using themselves as signaling platforms via direct allosteric receptor–receptor interactions. RTK are a family of transmembrane- spanning receptors that mediate the signaling from ligands such as growth factors, like the platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), the brain derived neurotrophic factor (BDNF), and the fibroblast growth factor (FGF). This hypothesis on direct GPCR-RTK receptor-receptor interactions in heteroreceptor complexes was introduced by Fuxe et al 1983. They also proposed the existence of 5- HT1A-FGFR1 heteroreceptor complexes having a role in depression. The hypothesis was introduced that the neurotrophic system FGF-2/FGFR1 may be a good candidate to mediate antidepressant induced improvement in 5-HT neuronal communication and neurotrophism with regeneration of connections lost during depression. RTK transactivation in response to antidepressant drug treatment was postulated to take place via a new allosteric receptor–receptor between distinct serotonin receptor subtypes and FGFR1 in heteroreceptor complexes. The discovery of brain FGFR1-5-HT1A heteroreceptor complexes and their enhancement of neuroplasticity offers an integration of the serotonin and the neurotrophic factor hypotheses of depression at the molecular level. These heteroreceptor complexes were found in the hippocampus and midbrain raphe 5-HT nerve cells, enriched in 5-HT1A autoreceptors. Based on the triplet puzzle theory several sets of triplet homologies were identified that may be part of the receptor interface. Combined FGF-2 and 5-HT1A agonist treatment increased the formation of these heterocomplexes and the facilitatory allosteric receptor-receptor interactions within them leading to an enhancement of FGFR1 signaling (Chapter 3). This integrative phenomenon is reciprocal and RTK signaling can be placed downstream of GPCRs. Formation of such heterocomplexes involving two major classes of membrane receptors can be involved in regulating all aspects of receptor protomer function including recognition, signaling, trafficking, desensitization, and downregulation (Chapter 3). These events were associated with development of rapid antidepressant effects. These heteroreceptor complexes are a novel target for antidepressant drugs. These examples, based on solid experimental evidences, serve to illustrate that allosteric receptor-receptor interactions in GPCR heteroreceptor complexes play a significant role in receptor diversity and bias of the participating GPCR protomers.G-protein coupled receptors (GPCR)-mediated signalling is a more complicated process than described previously since every GPCR and GPCR heteromer requires a set of G protein interacting proteins (GIP) which interacts with the receptor in an orchestrated spatio-temporal fashion. Therefore, there is a high interest in understanding the dynamics of the receptor-receptor and receptor-protein interactions in space and time, and specially, their integration in GPCR heterocomplexes of the Central Nervous System (CNS). Also, pathological protein-protein interactions in homocomplexes and heterocomplexes of Aβ, Tau, and α-Syn are at the heart of the development of conformational protein disorders. Along this work, experimental evidences are given to illustrate that GPCR interactions have relevance for neurological and mental diseases and are targets for drug development. GPCR containing heteromers and higher order heteromers through allosteric receptor- receptor interactions have become major integrative centers at the molecular level and their receptor protomers act as moonlighting proteins. They have become exciting new targets for neurotherapeutics in e.g. Parkinson’s disease, schizophrenia, drug addiction, anxiety and depression opening up a new field in neuropsychopharmacology. Along this work, the allosteric receptor-receptor interactions over the interfaces in A2AR-D2R, D2R-NTS1R, D2R-Sigma1R and 5-HT1A-FGFR1 heteroreceptor complexes will be explored and their biochemical, pharmacological and functional integrative implications in the CNS described. Methodologies for studies on receptor- receptor interactions are discussed including the use of FRET and BRET-based techniques in the analysis of G protein coupled receptor (GPCR) dimerization in living cells. In situ proximity ligation assay is performed to establish the existence of native heteroreceptor complexes in the CNS

    Estado serológico frente a Toxoplasma gondii en receptores de trasplante cardiaco: ¿un factor pronóstico independiente?

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    [Resumen] Introducción y objetivos. Analizar la influencia pronóstica del estado serológico frente a Toxoplasma gondii en receptores de trasplante cardiaco (TC). Métodos. Se realizó un estudio retrospectivo unicéntrico con 657 receptores de TC entre 1991 y 2015. Mediante dos modelos multivariantes de Cox se comparó la supervivencia y la incidencia de episodios clínicos adversos de los receptores seropositivos (n = 481) y los receptores seronegativos (n = 176) frente a T. gondii. El modelo 1 incluyó edad y sexo, y el modelo 2 incluyó otros factores de confusión potenciales. Resultados. Con una mediana de seguimiento de 2.903 días (rango intercuartílico: 898-4.757), fallecieron 250 pacientes seropositivos (52%) y 72 receptores seronegativos (41%) frente a T. gondii. Los pacientes seropositivos presentaron mayor mortalidad no ajustada tras el TC (hazard ratio [HR] = 1,31; intervalo de confianza del 95% [IC95%], 1,00-1,70). Tras el ajuste multivariante, este efecto perdió su significación estadística (modelo 1: HR = 1,09; IC95%, 0,83-1,43; modelo 2: HR = 1,12; IC95%, 0,85-1,47). La seropositividad frente a T. gondii del receptor se asoció de modo independiente con mayor riesgo de rechazo agudo (modelo 1: HR = 1,36; IC95%, 1,06-1,74; modelo 2: HR = 1,29; IC95%, 1,01-1,66). Los modelos multivariantes no pusieron de manifiesto una influencia significativa del estado serológico frente a T. gondii del receptor sobre la incidencia de infección, neoplasias, enfermedad vascular del injerto o el desenlace combinado muerte cardiaca o retrasplante. Tampoco se observó una influencia pronóstica significativa de la concordancia donante-receptor respecto al estado serológico frente a T. gondii. Conclusiones. El presente estudio no ha puesto de manifiesto un efecto pronóstico independiente del estado serológico frente a T. gondii en los receptores de TC

    Receptores tirosina quinasa en cáncer

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    Máster Universitario en Biología y Clínica del Cáncer: Programa, Objetivos y Metodología.Peer Reviewe

    Expression and function of G-protein-coupled receptorsin the male reproductive tract

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    This review focuses on the expression and function of muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), α1-adrenoceptors and relaxin receptors in the male reproductive tract. The localization and differential expression of mAChR and α1-adrenoceptor subtypes in specific compartments of the efferent ductules, epididymis, vas deferens, seminal vesicle and prostate of various species indicate a role for these receptors in the modulation of luminal fluid composition and smooth muscle contraction, including effects on male fertility. Furthermore, the activation of mAChRs induces transactivation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the Sertoli cell proliferation. The relaxin receptors are present in the testis, RXFP1 in elongated spermatids and Sertoli cells from rat, and RXFP2 in Leydig and germ cells from rat and human, suggesting a role for these receptors in the spermatogenic process. The localization of both receptors in the apical portion of epithelial cells and smooth muscle layers of the vas deferens suggests an involvement of these receptors in the contraction and regulation of secretion.Esta revisão enfatiza a expressão e a função dos receptores muscarínicos, adrenoceptores α1 e receptores para relaxina no sistema reprodutor masculino. A expressão dos receptores muscarínicos e adrenoceptores α1 em compartimentos específicos de dúctulos eferentes, epidídimo, ductos deferentes, vesícula seminal e próstata de várias espécies indica o envolvimento destes receptores na modulação da composição do fluido luminal e na contração do músculo liso, incluindo efeitos na fertilidade masculina. Além disso, a ativação dos receptores muscarínicos leva à transativação do receptor para o fator crescimento epidermal e proliferação das células de Sertoli. Os receptores para relaxina estão presentes no testículo, RXFP1 nas espermátides alongadas e células de Sertoli de rato e RXFP2 nas células de Leydig e germinativas de ratos e humano, sugerindo o envolvimento destes receptores no processo espermatogênico. A localização de ambos os receptores na porção apical das células epiteliais e no músculo liso dos ductos deferentes de rato sugere um papel na contração e na regulação da secreção.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina Departamento de FarmacologiaUNIFESP, EPM, Depto. de FarmacologiaSciEL
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