Étude de l’expression et de la fonction du gène Ankyrin-repeat and SOCS-Box protein 9 (ASB9) dans le follicule ovulatoire bovin

La baisse de fertilité chez les vaches laitières est une préoccupation majeure pour l'industrie laitière au Canada car elle entraîne chaque année d'importantes pertes économiques. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à une baisse de la fertilité ne sont pas encore complètement élucidés. Dans ce contexte, la régulation du gène Ankyrin-repeat and SOCS Box protein 9 (ASB9) dans le follicule ovarien a été rapportée pour la première fois par notre laboratoire. Nous avons identifié ASB9 comme un gène différentiellement exprimé dans les cellules de granulosa (CG) de follicules ovulatoires bovins. Toutefois, le rôle biologique d’ASB9 dans les CG était inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’expression d’ASB9 serait induite par l’hormone lutéinisante (LH) dans les CG et que, par sa fonction biologique, ASB9 contribuerait au contrôle de la fonction des CG. Des CG ont été obtenues à partir de petits follicules (SF : 2-4 mm), de follicules dominants au jour 5 du cycle œstral (DF) et de follicules ovulatoires (OF) 24 heures (h) suivant une injection d’hCG. Des analyses par RT-qPCR et western blot ont démontré une induction de l’expression de l’ARNm et de la protéine ASB9 dans les CG des OF par l’hCG. L’expression d'ASB9 dans les parois folliculaires était significativement induite à partir de 12 h post-hCG, avec une induction maximale 24 h post-hCG ou 24 h suivant la libération endogène de la LH comparée à 0 h. Le criblage d’une banque d'ADNc provenant de follicules ovulatoires à l’aide du système double hybride chez la levure a permis d'identifier 10 protéines partenaires d'ASB9 dont tumor necrosis factor alpha-induced protein 6 (TNFAIP6), hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (HIF1A) et cytochrome B (CYTB). L'inhibition d’ASB9 par l'approche CRISPR-Cas9 a entraîné une prolifération des CG et une modulation de l'expression de certains gènes dont celui de l’enzyme stéroïdogénique CYP11A1. Ces résultats confirment un rôle d'ASB9 dans le follicule ovulatoire en contrôlant la prolifération et la fonction des CG, en ciblant des protéines spécifiques susceptibles d’être dégradées et, possiblement, en contribuant à la différenciation finale des CG en cellules lutéales. Les résultats de cette étude pourraient mener à une meilleure compréhension et contrôle de la fonction ovarienne par l’identification de gènes associés à la fertilité chez les vaches laitières.Dairy cows fertility has been declining steadily worldwide for the last fifty years. This decline in fertility is a major concern for the dairy industry in Canada since it results in significant economic losses each year. Yet, the molecular mechanisms associated with fertility decline are still not fully investigated. In this regard, the regulation of Ankyrin-repeat and SOCS Box protein 9 (ASB9) in the ovarian follicle has been recently reported, for the first time, by our laboratory. We have identified ASB9 as a differentially expressed gene in granulosa cells (GC) of bovine ovulatory follicles. However, the biological role of ASB9 in GC was still unknown. We hypothesized that ASB9 expression would be induced by the luteinizing hormone (LH) in GC and that ASB9 would contribute to the control of GC function. GC were obtained from small follicles (SF: 2-4 mm), dominant follicles at day 5 of the estrous cycle (DF) and ovulatory follicles 24 h post-hCG injection (OF). RT-qPCR and western blot analyzes demonstrated an induction of ASB9 expression in the OF by hCG both at the mRNA and protein levels. Moreover, the expression of ASB9 in follicular walls was significantly induced from 12 h post-hCG and reached a maximum induction 24 h post-hCG or 24 h following the endogenous LH surge as compared to 0 h. Yeast two-hybrid screening of a cDNA library from ovulatory follicles resulted in the identification of 10 ASB9 binding partners, which included tumor necrosis factor alpha-induced protein 6 (TNFAIP6), hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (HIF1A) and cytochrome B (CYTB). Inhibition of ASB9 through the CRISPR-Cas9 approach resulted in increased GC proliferation and modulation of target genes expression such as steroidogenic enzyme CYP11A1. These results confirm a physiologically relevant role of ASB9 in the ovulatory follicle by regulating GC proliferation and function, targeting specific proteins that may be degraded and, possibly by contributing to the final differentiation of GC into luteal cells. The results of this study could lead to a better understanding and control of the ovarian function by identifying target genes associated with fertility in dairy cows

Crystal Structure of the Cul2-Rbx1-EloBC-VHL Ubiquitin Ligase Complex

Cullin RING E3 ubiquitin ligases (CRLs) function in the ubiquitin proteasome system to catalyze the transfer of ubiquitin from E2 conjugating enzymes to specific substrate proteins. CRLs are large dynamic complexes and attractive drug targets for the development of small-molecule inhibitors and chemical inducers of protein degradation. The atomic details of whole CRL assembly and interactions that dictate subunit specificity remain elusive. Here we present the crystal structure of a pentameric CRL2VHL complex, composed of Cul2, Rbx1, Elongin B, Elongin C, and pVHL. The structure traps a closed state of full-length Cul2 and a new pose of Rbx1 in a trajectory from closed to open conformation. We characterize hotspots and binding thermodynamics at the interface between Cul2 and pVHL-EloBC and identify mutations that contribute toward a selectivity switch for Cul2 versus Cul5 recognition. Our findings provide structural and biophysical insights into the whole Cul2 complex that could aid future drug targeting

Investigating the role of ankyrin repeat and SOCS box protein 4 (ASB4) during vascular development

The molecular mechanisms of endothelial differentiation into a functional vascular network are incompletely understood. To identify novel factors in endothelial development we employed a microarray screen using differentiating embryonic stem (ES) cells that identified Ankyrin Repeat and SOCS Box Protein 4 (ASB4) as the most highly differentially expressed gene in the vascular lineage during early differentiation. Like other SOCS box-containing proteins, ASB4 acts as the substrate recognition molecule of an Elongin-B/Elongin-C/Cullin/Roc ubiquitin ligase complex that mediates the ubiquitination and degradation of substrate protein(s). High levels of ASB4 expression in the embryonic vasculature coincide with drastic increases in oxygen tension as placental blood flow is initiated. However, as vessels mature and oxygen levels stabilize, ASB4 expression is quickly downregulated, suggesting that ASB4 may function to modulate an endothelial-specific response to increasing oxygen tension. Consistent with the hypothesis that ASB4 function is regulated by oxygen concentration, ASB4 directly interacts with Factor Inhibiting HIF1α (FIH), and is a substrate for FIH-mediated hydroxylation via an oxygen-dependent mechanism. Additionally, overexpression of ASB4 in ES cells promotes differentiation into the vascular lineage in an oxygen-dependent manner. We propose that hydroxylation of ASB4 in normoxia promotes binding to and degradation of substrate protein(s) to modulate vascular differentiation

Mécanismes de régulation post-traductionnelle de la sénescence cellulaire et leurs impacts sur la suppression tumorale

La sénescence est un processus caractérisé par un arrêt stable du cycle cellulaire. Ce mécanisme peut être induit en réponse à de nombreux stress, comme l’activation d’un oncogène, le raccourcissement des télomères ou bien le traitement avec des composés génotoxiques. Cette réponse cellulaire est considérée comme une barrière antitumorale limitant la prolifération des cellules exposées au risque de transformation. La mise en place de la sénescence dépend de profonds changements au niveau moléculaire, dont l’activation d’un programme de dégradation sélective des protéines. Cette dégradation de protéines associée à la sénescence (SAPD) peut expliquer plusieurs caractéristiques des cellules sénescentes, notamment la présence de défauts dans la voie de synthèse des ribosomes (SARD). Ces derniers sont liés à un stress nucléolaire qui mène à l’accumulation de certaines protéines ribosomiques dans le noyau, où elles peuvent effectuer des fonctions indépendantes de leur rôle structurale dans les ribosomes. Parmi ces protéines ribosomiques, RPS14/uS11 peut s’accumuler dans le nucléoplasme et réguler le cycle cellulaire en inhibant CDK4. Ces mécanismes de régulation post-traductionnelle -le SAPD ainsi que les conséquences des SARD- contribuent de manière importante au phénotype sénescent. Nous avons émis l’hypothèse que la caractérisation des effecteurs dans ces voies pourrait mener à l’identification de nouvelles protéines importantes pour la sénescence et la suppression tumorale. Dans un premier temps, nous avons évalué le rôle de la protéine ribosomique RPL22/eL22 dans le cycle cellulaire et la sénescence. Tout comme RPS14, RPL22 a été identifié dans l’analyse de l’interactome de CDK4 lors de la sénescence induite par la perte du facteur de la ribogenèse RSL1D1. Nous avons pensé que RPL22 pourrait agir de manière similaire à RPS14 et ainsi effectuer des fonctions extra-ribosomiques impliquées dans la régulation du cycle cellulaire. Dans le premier article présenté dans cette thèse, nous montrons que la surexpression de RPL22 dans des fibroblastes humains induit un phénotype sénescent et que RPL22 peut lier et inhiber CDK4 afin d’activer la voie de RB. Ensemble, ces données indiquent un rôle suppressif de RPL22 dans le cycle cellulaire. En second lieu, nous nous sommes penchés sur la caractérisation des effecteurs du programme de dégradation sélective de protéines associé à la sénescence. Ce programme est mené à terme par le système ubiquitine-protéasome, un mécanisme finement régulé par différents types de protéines. Parmi celles-ci, les E3 ubiquitine ligases définissent la spécificité de ce système en interagissant avec les substrats à dégrader. Nous avons donc pensé que certaines E3 ubiquitine ligases spécifiques pourraient être importantes pour le mécanisme de dégradation protéique associé à la sénescence. Afin d’identifier celles-ci, nous avons effectué un criblage de shARN ciblant des gènes d’E3 ubiquitine ligases dans le contexte de la sénescence induite par les oncogènes. Ceci a mené à l’identification d’ASB14 comme un acteur important de la sénescence. Dans le deuxième article de cette thèse, nous montrons que la perte d’ASB14 produit un contournement de la sénescence induite par l’oncogène RAS dans plusieurs modèles cellulaires. ASB14 est une protéine peu caractérisée et nous avons généré des anticorps afin d’analyser son expression. Nous montrons ensuite qu’ASB14 s’exprime fortement dans le pancréas sain, tandis que ses niveaux diminuent dans les tumeurs pancréatiques. Enfin, nous avons identifié les partenaires d’interaction d’ASB14 dans le contexte de la sénescence induite par l’oncogène RAS. Globalement, les travaux présentés dans cette thèse nous ont permis d’identifier deux nouvelles protéines impliquées dans la sénescence cellulaire : la protéine ribosomique RPL22 et l’E3 ubiquitine ligase ASB14. Ces deux protéines contribuent à la régulation post-traductionnelle du phénotype sénescent. D’un côté, RPL22 peut inhiber l’activité de CDK4 afin d’activer la voie de RB et ainsi réguler le cycle cellulaire. D’une autre part, ASB14 est importante pour le maintien du phénotype sénescent et semble avoir un rôle dans la suppression tumorale du pancréas. Nos résultats suggèrent que RPL22 et ASB14 sont importants pour la sénescence et la suppression tumorale.Cellular senescence is characterized by a stable cell cycle arrest. This process can be induced by a variety of cellular stresses, including oncogene activation, telomere shortening and genotoxic treatments. In fact, senescence is considered an antitumor barrier that prevents cellular transformation. Senescence is associated with widespread molecular changes, including the activation of a selective protein degradation program. This senescence-associated protein degradation (SAPD) could regulate some senescence-associated phenotypes, including the senescence-associated ribosome biogenesis defects (SARD). Senescence-associated ribosome biogenesis defects are linked to a nuclear accumulation of some ribosomal proteins such as RPS14/uS11 capable of carrying out extra-ribosomal functions. In particular, RPS14 can inhibit CDK4 and mediate senescence. Thus, we hypothesize that the proteins implicated in these pathways -SAPD and SARD- could be important for senescence and tumor suppression. First, we evaluated the ability of the ribosomal protein L22 (RPL22/eL22) to regulate cellular senescence and cell cycle progression. RPL22, as RPS14, was identified as a binding partner for CDK4 in senescent cells induced by depleting the ribosome biogenesis factor RSL1D1. Hence, we though that RPL22 could act in a manner similar to RPS14. In chapter two, we show that RPL22 overexpression induces a senescent phenotype in human fibroblasts. In addition, we show that RPL22 can interact with CDK4 inhibiting its activity and stimulating the RB tumor suppressor pathway. Taken together, these results indicate a suppressive role of RPL22 in cell cycle progression. Next, we focused on the characterization of SAPD effectors. This mechanism is mediated by the ubiquitin-proteasome system which is tightly regulated by E3 ubiquitin ligases. Thus, we thought that specific E3 ubiquitin ligases could be important for SAPD and for senescence. In order to discover E3 ubiquitin ligases that contribute to senescence, we performed an unbiased screening using shRNA libraries in Ras-induced senescent cells. This led to the identification of ASB14 as an important mediator of senescence. In chapter three, we show that ASB14 depletion leads to a bypass of Ras-induced senescence. ASB14 is a poorly characterized E3 ligase, and we generated antibodies in order to analyze its expression levels. We show that ASB14 is highly expressed in the normal pancreas whereas its expression is reduced in pancreatic cancer tissues. Finally, we uncovered the interactome of ASB14 in Ras-induced senescent cells. Overall, we have discovered two new senescence mediators: ribosomal protein L22 and E3 ubiquitin ligase ASB14. These proteins are implicated in the post-translational regulation of the senescent phenotype. RPL22 acts as a CDK4 inhibitor to activate RB pathway and regulate cell cycle arrest and ASB14 is an important mediator of senescence maintenance. Taken together, our results suggest that RPL22 and ASB14 are important for cellular senescence and tumor suppression

The Mechanism of Action of SOCS2 and its Role in Metabolism and Growth

A well-known function of Growth Hormone (GH) is the regulation of postnatal longitudinal growth but it also affects other biological processes, for instance metabolism and inflammation. Actions of GH are tightly regulated at several levels and by several different factors and are initiated by GH binding to membrane bound GH receptors (GHR). The intracellular signaling of GH and other related hormones and cytokines is predominately mediated by the JAK-STAT pathway. This pathway is regulated in a negative feedback manner by the Suppressors of Cytokine Signaling (SOCS) family of proteins. One of the family members, SOCS2, is intimately tied to GH by virtue of the phenotype that results from its absence. SOCS2-/- mice are 40% larger than wildtype littermates due to increased GH sensitivity. Here, the molecular mechanism behind SOCS2s negative regulation of GH signaling, and its effects on metabolism and inflammation are described. We demonstrate that SOCS2 assembles a canonical E3 ubiquitin ligase complex with Elongin B, Elongin C, Cullin 5 and Rbx2 and that this complex has intrinsic E3 ligase activity in vitro. Overexpression of SOCS2 and its complex members leads to ubiquitination and proteasomal degradation of the GHR. We also outline the importance of the different domains of SOCS2, and demonstrate the necessity of the SOCS-box for proper SOCS2 activity. In a follow up study the claim that the naturally occurring Ser52Asn polymorphism of SOCS2 affects its activity and may contribute to acromegaly in humans was investigated. The Ser52Asn mutant was however found to be as efficient at regulating GH signaling as the wildtype and we conclude that it is unlikely to contribute to increased GH sensitivity. In Paper III the phenotype of SOCS2-/- mice under conditions of dietary stress is described. We report that SOCS2 deletion protects against high fat diet (HFD) induced hepatic steatosis but simultaneously leads to decreased insulin sensitivity. SOCS2-/- mice were found to have increased triglyceride output from the liver but also increased plasma levels of proinflammatory cytokines without apparent macrophage infiltration. In vitro examination of macrophages revealed increased phagocytic activity and cytokine production in the absence of SOCS2 and suggests a direct role for SOCS2 in the regulation of TLR4 signaling. Finally, the results of a screening effort to identify SOCS2-modulating, drug-like molecules are included. We have identified a prospective hit that binds to and inhibits SOCS2 activity in vitro. In summary, SOCS forms an E3 ligase complex which targets the GHR for degradation. This forms the molecular basis of its physiological actions. SOCS2-/- mice are protected from HFD induced hepatic steatosis but suffer from deteriorated insulin sensitivity related to increased inflammation