La baisse de fertilité chez les vaches laitières est une préoccupation majeure pour l'industrie laitière au Canada car elle entraîne chaque année d'importantes pertes économiques. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à une baisse de la fertilité ne sont pas encore complètement élucidés. Dans ce contexte, la régulation du gène Ankyrin-repeat and SOCS Box protein 9 (ASB9) dans le follicule ovarien a été rapportée pour la première fois par notre laboratoire. Nous avons identifié ASB9 comme un gène différentiellement exprimé dans les cellules de granulosa (CG) de follicules ovulatoires bovins. Toutefois, le rôle biologique d’ASB9 dans les CG était inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’expression d’ASB9 serait induite par l’hormone lutéinisante (LH) dans les CG et que, par sa fonction biologique, ASB9 contribuerait au contrôle de la fonction des CG. Des CG ont été obtenues à partir de petits follicules (SF : 2-4 mm), de follicules dominants au jour 5 du cycle œstral (DF) et de follicules ovulatoires (OF) 24 heures (h) suivant une injection d’hCG. Des analyses par RT-qPCR et western blot ont démontré une induction de l’expression de l’ARNm et de la protéine ASB9 dans les CG des OF par l’hCG. L’expression d'ASB9 dans les parois folliculaires était significativement induite à partir de 12 h post-hCG, avec une induction maximale 24 h post-hCG ou 24 h suivant la libération endogène de la LH comparée à 0 h. Le criblage d’une banque d'ADNc provenant de follicules ovulatoires à l’aide du système double hybride chez la levure a permis d'identifier 10 protéines partenaires d'ASB9 dont tumor necrosis factor alpha-induced protein 6 (TNFAIP6), hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (HIF1A) et cytochrome B (CYTB). L'inhibition d’ASB9 par l'approche CRISPR-Cas9 a entraîné une prolifération des CG et une modulation de l'expression de certains gènes dont celui de l’enzyme stéroïdogénique CYP11A1. Ces résultats confirment un rôle d'ASB9 dans le follicule ovulatoire en contrôlant la prolifération et la fonction des CG, en ciblant des protéines spécifiques susceptibles d’être dégradées et, possiblement, en contribuant à la différenciation finale des CG en cellules lutéales. Les résultats de cette étude pourraient mener à une meilleure compréhension et contrôle de la fonction ovarienne par l’identification de gènes associés à la fertilité chez les vaches laitières.Dairy cows fertility has been declining steadily worldwide for the last fifty years. This decline in fertility is a major concern for the dairy industry in Canada since it results in significant economic losses each year. Yet, the molecular mechanisms associated with fertility decline are still not fully investigated. In this regard, the regulation of Ankyrin-repeat and SOCS Box protein 9 (ASB9) in the ovarian follicle has been recently reported, for the first time, by our laboratory. We have identified ASB9 as a differentially expressed gene in granulosa cells (GC) of bovine ovulatory follicles. However, the biological role of ASB9 in GC was still unknown. We hypothesized that ASB9 expression would be induced by the luteinizing hormone (LH) in GC and that ASB9 would contribute to the control of GC function. GC were obtained from small follicles (SF: 2-4 mm), dominant follicles at day 5 of the estrous cycle (DF) and ovulatory follicles 24 h post-hCG injection (OF). RT-qPCR and western blot analyzes demonstrated an induction of ASB9 expression in the OF by hCG both at the mRNA and protein levels. Moreover, the expression of ASB9 in follicular walls was significantly induced from 12 h post-hCG and reached a maximum induction 24 h post-hCG or 24 h following the endogenous LH surge as compared to 0 h. Yeast two-hybrid screening of a cDNA library from ovulatory follicles resulted in the identification of 10 ASB9 binding partners, which included tumor necrosis factor alpha-induced protein 6 (TNFAIP6), hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (HIF1A) and cytochrome B (CYTB). Inhibition of ASB9 through the CRISPR-Cas9 approach resulted in increased GC proliferation and modulation of target genes expression such as steroidogenic enzyme CYP11A1. These results confirm a physiologically relevant role of ASB9 in the ovulatory follicle by regulating GC proliferation and function, targeting specific proteins that may be degraded and, possibly by contributing to the final differentiation of GC into luteal cells. The results of this study could lead to a better understanding and control of the ovarian function by identifying target genes associated with fertility in dairy cows
