Estudo da función da conexina 43 en condrócitos articulares humano. Identificación das proteínas que interaccionan co dominio C-terminal da Cx43

A conexina 43 é unha proteína amplamente distribuída en tódolos tecidos estudados, desenrolando un papel moi importante na comunicación celular. Neste traballo móstranse resultados que verifican a presenza de conexina 43 en cartilaxes articulares humanos, ademáis da existencia de proxeccións citoplasmáticas que comunican fisicamente ós condrócitos en tecido. Os resultados aquí mostrados suxiren que a Cx43 pode viaxar a través do citoplasma utilizando os microtúbulos e os filamentos de actina, alcanzando calquer punto da membrana plasmática incluidas as proxeccións citoplasmáticas. Ademáis, estudando a cartilaxe de pacientes con artrose (OA), puidemos demostrar que os condrócitos OA localizados nas capas superficiais e intermedia do tecido, teñen altos niveles de Cx43. Altos niveis de Cx43 relaciónanse con procesos inflamatorios e dano tisular noutros tecidos. No caso dos condrócitos, a IL1-ß ou altos niveis de glicosa no medio de cultivo desencadearon nun incremento da Cx43. Incrementos da proteína, non sólo afectan á actividade das canles de conexina na membrana citoplasmatica, tamén a outras actividades relacionadas ca Cx43 e que poden ocurrir de forma independente a función das canles. Moitas destas actividades modifican diferentes cascadas de sinalización celular e están relacionadas ca interacción de proteínas co dominio C-terminal da Cx43. Neste traballo utilizando co-inmunoprecipitación e espectometría de masas, identificáronse varias das proteínas que interaccionan ca Cx43 en condrócitos articulares provenientes de doadorees sanos. Traballos previos no noso grupo de investigacion demostraron que moitas das proteínas que interacionan ca Cx43 como por exemplo a alpha-enolasa ou a anexina V, están alteradas en condrócitos de pacientes con OA. Ademáis detectáronse proteínas que suxieren que a Cx43 podría estar exercendo unha función a nivel nuclear encaixando ca localización nuclear da Cx43 detectada en condrócitos en cartilaxe OA.Traballo fin de mestrado (UDC.FCS). Asistencia e investigación sanitaria. Especialidade en fundamentos de investigación biomédica. Curso 2011/201

New molecular approaches in adipogenesis regulation: The connexin 43 role

Indexación: Scopus; Redalyc.La prevalencia de la obesidad a nivel mundial se ha incrementado rápidamente durante los últimos años debido principalmente a los cambios en el estilo de vida de la población con un aumento significativo en el consumo de energía y disminución de los niveles de actividad física. Es por esto que la comunidad científica está interesada en comprender de forma más profunda los mecanismos que regulan la fisiopatología de la obesidad. Dentro de los diferentes blancos de estudio se encuentra la adipogénesis, cuyo entendimiento es fundamental para comprender el desarrollo de la obesidad y las patologías asociadas a esta. Recientemente ha surgido importantes evidencias que involucran a la proteína de canales de “Gap Junction” conexina 43 (Cx43) en la regulación de los procesos relacionados con adipogénesis, cuyo papel es básicamente anti-adipogénico, sin embargo, nuevas funciones de Cx43 en la regulación de la formación del tejido adiposo siguen descubriéndose.The global prevalence of obesity has been increased rapidly over the past few years mainly due to changes in the lifestyle of the population with a significant increase in energy consumption and decreased levels of physical activity. As a result, the scientific community is interested in a deeper understanding of the mechanisms that regulate the pathophysiology of obesity. In this context, adipogenesis process is an important target of study to understand the obesity and associated pathologies. Recently has been emerged important evidence that involve gap junction channel protein connexin 43 (Cx43) in the regulation of processes related to adipogenesis, whose role is fundamentally anti-adipogenic. However, new functions of Cx43 in the regulation of adipose tissue function also continued to emerge.http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=5594990800

The role of eletrical synapses in epileptic seizures

INTRODUÇÃO: No sistema nervoso central a comunicação entre neurônios se realiza através de estruturas denominadas sinapses: elétricas ou químicas. As sinapses elétricas são formadas pela aproximação das membranas plasmáticas de dois neurônios formando estruturas chamadas junções comunicantes (gap junctions, do inglês). As junções comunicantes são compostas por seis subunidades da proteína conexina de cada membrana, formando poros que comunicam o citoplasma de células adjacentes e permitem a passagem de íons e pequenas moléculas. OBJETIVOS: A presente revisão pretende descrever e discutir os principais resultados que apontam para uma importante relação entre junções comunicantes e sincronia neuronal durante crises epilépticas. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Quando um neurônio é despolarizado, este tipo de comunicação permite a rápida transferência iônica entre as células, promovendo alta sincronia neuronal. Recentemente, o papel das junções comunicantes na geração e propagação de descargas epilépticas tem sido estudado através do uso de diferentes modelos experimentais in vivo, in vitro e in silico (modelos computacionais).INTRODUCTION: In the central nervous system, neuronal communication is accomplished by structures called synapses: electrical or chemical. Electrical synapses are formed by the apposition of plasmatic membranes at gap junctions and the interaction of connexin subunits from two neurons. At this site, connexin complexes create intercellular pores that communicate the cytoplasm of adjacent neurons and allow free flow of ions and small molecules. OBJECTIVE: In this review, we will present and discuss recent results showing the possible involvement of electrical synapses in the neuronal hypersynchronization during epileptic seizures. RESULTS AND CONCLUSION: When a neuron is depolarized, ions flow very rapidly from one cell to the other promoting high neuronal synchrony. More recently, the role of gap junctions in the generation and propagation of epileptic discharges has been investigated using combined approaches of in vivo, in vitro and in silico (computational) models

Contribución del retículo endoplasmático a la onda de calcio en epitelio pigmentario de la retina.

Las células del epitelio pigmentario tienen una función clave como reguladoras de la homeostasis retiniana y constitución de la barrera hemato-retiniana. Se ha descrito previamente en la literatura que estas células presentan ondas de calcio intracelulares implicadas en los procesos fisiológicos retinianos. Aunque se supone que en la génesis y extensión de la onda de calcio están implicados tanto factores intracelulares como paracrinos, los datos existentes en la literatura no son concluyentes. Por otro lado, la supuesta participación de los depósitos de calcio intracelulares (retículo endoplasmático) en la extensión de la onda se ha estudiado sólo de modo indirecto, por lo que, para esclarecer los mecanismos implicados en el origen y propagación de la onda de calcio, se elaboró este trabajo en el que se realizaron mediciones de calcio directas y simultáneas en citosol y en retículo endoplasmático mediante los sensores fluorescentes de calcio Fura-2 y erGAP3. Se transfectó la línea ARPE-19 para conseguir un clon estable cuya característica fuera la expresión en retículo endoplasmático de la sonda de calcio fluorescente erGAP3. Se llevaron a cabo los experimentos en un microscopio de epifluorescencia con el cultivo de las células en monocapa, con estimulación mecánica. Para demostrar la implicación de los distintos receptores y canales celulares se utilizaron diversos fármacos y condiciones. Los resultados obtenidos parecen indicar que el inicio de la onda de calcio se produce a través de la liberación de ATP desencadenada por la estimulación mecánica, por lo que, con la inhibición de los receptores purinérgicos con suramina y la degradación de ATP por la apirasa, se obtiene una disminución de intensidad de la onda y de su propagación. La implicación de las conexinas se estudió mediante células no confluentes y con el bloqueo mediante carbenoxolona; se obtuvo como resultado la onda de calcio sin aportación de calcio desde el retículo. Podemos concluir que en las células ARPE-19/erGAP3 la propagación de la onda en las capas más proximales depende de las conexinas y en las capas más distales de la activación de los receptores purinérgicos mediante el ATP extracelular.Grado en Medicin

Estudio de la función de los canales de conexina en condrocitos de cartílago adulto

El cartílago articular se caracteriza por ser un tejido avascular, aneuronal y alinfático que recubre las superficies óseas de las articulaciones. Está formado células denominadas condrocitos y por una densa matriz extracelular. Los condrocitos sólo ocupan de un 2-5% del volumen total del tejido y se encuentran embebidos en la matriz, localizados en lagunas y separados uno de otros de 5 a 60μm. Las uniones gap (UG) están formadas por proteínas de la familia de las conexinas (Cxs) y son canales que conectan directamente el citoplasma de dos células adyacentes lo que permite el intercambio de pequeñas moléculas. En diferentes estudios, utilizando modelos animales, se ha descrito que los condrocitos articulares expresan conexina 43 (Cx43); esto combinado con resultados previos de nuestro grupo donde se demuestra que los condrocitos son capaces de formar proyecciones citoplasmáticas de hasta 200μm de longitud, llevó al desarrollo de este trabajo donde se pretende estudiar y caracterizar la funcionalidad de los canales de Cxs en condrocitos humanos combinado con el estudio de la implicación de los canales en otros procesos como la proliferación y regulación del ciclo celular. Para llevar a cabo el estudio, los condrocitos se cultivaron durante 3-5 semanas a 37ºC y 5%CO2 en un incubador. Posteriormente se realizaron ensayos de PCR a tiempo real e inmunohistoquímcia que permitieron determinar la expresión de Cxs en cartílago y su localización en las diferentes capas. La funcionalidad de los canales fue testada mediante la técnica del dual voltage-clamp y la capacidad de intercambio de moléculas mediante un co-cultivo en transwel y espectometría de masas. Para testar si los canales de Cxs estaban implicados en otros procesos como proliferación, se trató a los condrocitos primarios en cultivo con drogas inespecíficas que bloquean los canales de Cxs y el efecto sobre el ciclo celular fue analizado mediante citometría de flujo y ensayos de expresión génica. Los resultados demuestran que los condrocitos en cultivo provenientes de donantes sanos expresan altos niveles de Cx43 que se localiza en múltiples puntos de la membrana plasmática. Los resultados aquí mostrados demuestran que los canales formados por Cx43 son canales funcionales dependientes de voltaje y formados exclusivamente por Cx43. Hemos demostrado que los condrocitos a través de los canales de Cxs intercambian moléculas como Lucifer Yellow u oligos de 12 nucleótidos. Además el co-cultivo en transwell reveló que los condrocitos se transfieren aminoácidos libres como L-lisina y posiblemente, péptidos y proteínas. El efecto sobre el ciclo celular determinó que el bloqueo de los canales de Cxs arresta a las células en G0/G1, afectado a la expresión de proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular.Traballo fin de mestrado (UDC.FCS). Asistencia e investigación sanitaria. Especialidade en fundamentos de investigación biomédica. Curso 2011/201

Modelamiento molecular de la conexina CX46 para identificar sitios de unión a CA²+ y a lípidos.

103 p.Las conexinas corresponden a una familia de proteínas transmembranales. Seis subunidades de conexinas forman un canal iónico llamado “hemicanal” el cual es capaz de comunicar el citoplasma con el medio extracelular. Facilitando el intercambio de iones y moléculas pequeñas (< 1-2 kDa) entre el interior de las células y el espacio extracelular. La regulación de la apertura de los hemicanales, está determinada por la presencia de cationes divalentes (Ca²+) en el medio extracelular, como es el caso del hemicanal de Cx46 que se expresa en las células del cristalino. La Cx46 participa en el mantenimiento de la homeostasis del calcio intracelular y su falta provoca la aparición de cataratas. Por otra parte, estudios han demostrado que el ácido linoleico en bajas concentraciones (0,1 μM) aumenta las corrientes de los hemicanales formados por la Cx46, mientras que a concentraciones altas (100 μM) inhibe la función del canal. Dado que se desconoce cómo funciona la regulación de la Cx46 mediada por Ca²+ extracelular y por lípidos, se pretende estudiar su estructura y así determinar los sitios de unión a estos ligandos. Para ello se realizó un modelo comparativo de Cx46. Se utilizó un servidor web que buscan los aminoácidos de la proteína, con los cuales el Ca²+ pueda interactuar favorablemente. Además se analizaron en una simulación de dinámica molecular (DM) cómo el Ca²+ se une y/o permea el hemicanal de Cx46. Para estudiar la unión a ácido linoléico se realizó un acoplamiento molecular y a continuación una simulación molecular de DM, para ver cómo interactúa el complejo proteína-ligando. Se logró obtener los posibles sitios de unión a Ca²+ y ácido linoleico en la estructura de la Cx46, mediante los métodos anteriormente mencionados, donde el Ca²+ interactúa con bucles extracelulares de la Cx46 y el AL con segmentos transmembrana de este. Palabras claves: Conexina 46, ácido linoleico, Ca²+, cataratas./ABSTRACT:Connexins are a family of transmembrane proteins. Six subunits of connexins make a ionic channel called “hemichannel” which enable the communication of the cytoplasm with the extracellular medium. Facilitates the exchange of ions and small molecules (<1.2 kDa) between the inside of cells and the extracellular space. The regulation of the opening of hemichannels is determined by extracellular divalent cations (Ca²+), like the connexin 46 (Cx46) that is expressed in cells of the lens. Cx46 is involved in maintaining calcium homeostasis and its absence make activation of cataracts. Moreover, studies have shown that linoleic acid in low concentrations (0,1 μM) increases the hemichannel voltage formed by Cx46, whereas at high concentration (100 μM) inhibits the channel function. Because it is known how it provokes the regulation of Cx46 mediated by extracellular Ca2+ and by lipids, we need to study its structure to determine the putative binding sites for these ligands. To this was performed a comparative Cx46 model. We used web servers that search possible amino acids of the protein which could interact with Ca²+ favorably. Also was analyzed in a molecular dynamics simulation (DM) how the Ca²+ binds and/or permeates the hemichannel of Cx46. The study for linoleic acid binding, we perform a docking molecular and then a DM simulation for see how interact the protein-ligand complex.We obtain the putative Ca²+ and linoleic acid binding sites in the structure of Cx46, using the above methods, where Ca²+ interacts with the extracellular loops of Cx46 and AL with transmembrane segments of this.Keywords: Connexin 46, linoleic acid, Ca²+, cataracts

Connexins, Innexins, and Pannexins: From Biology to Clinical Targets

Conexinas; Innexinas; PanexinasConnexins; Innexins; PannexinsConnexines; Innexines; PannexinesT.A. acknowledges funding from Instituto de Salud Carlos III, grants PI16/00772 and CPII16/00042 co-financed by the European Regional Development Fund (ERDF), and Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer (IDEAS SEMILLA AECC 2020/IDEAS20039AASE

Bases moleculares de la desmielinización causada por mutaciones en el gen GJA1 que codifica la conexina 43 astrocitaria.

Existe un grupo patologías de la mielina de etiología autoinmune y genética que se originan por alteraciones en moléculas claves implicadas en los mecanismos gliales que mantienen la integridad de la mielina en el sistema nervioso central. Entre ellas se encuentra la displasia oculodentodigital (ODDD), una enfermedad de herencia autosómica dominante causada por mutaciones en el gen GJA1 que codifica la conexina 43 (Cx43), y que se caracteriza por anomalías esqueléticas, malformaciones craneofaciales y que en ocasiones también cursa con paraparesia espástica, una patología causada por desmielinización. Sin embargo, se desconocen los mecanismos a través de los cuales las mutaciones dominantes de ODDD en la Cx43 astrocitaria pueden causar la destrucción de la mielina formada por los oligodendrocitos. Con este objetivo, en una primera etapa se realizaron los estudios genéticos en el gen GJA1 de pacientes con paraparesia espástica asociada a un fenotipo de ODDD y se identificaron en heterocigosis las mutaciones pR148Q y pV85M y en una segunda etapa, se realizó el su ensayo funcional. Los resultados de este ensayo muestran que la función de hemicanal y la función de adhesión de los canales intercelulares están preservadas en las dos mutaciones, sin embargo ambas mutaciones abolen la función de comunicación intercelular ya que los canales que forman no son funcionales. En la condición de heteocigosis de los pacientes, las dos mutaciones ejercen un potente efecto de inhibición dominante sobre el acoplamiento intercelular inducido por la Cx43 silvestre formando canales consigo misma y con la Cx47 oligodendrocitaria. Estos resultados sugieren que la desmielinización causante de la paraparesia espástica en los pacientes con displasia oculodentodigital podría originarse como consecuencia de la significativa reducción de la comunicación intercelular astrocito-astrocito y astrocito-oligodendrocito; esta vía de comunicación glial es esencial en el mecanismo de aclaramiento de los iones K+, que se acumulan en la región periaxonal internodal de las fibras mielínicas durante la conducción saltatoria, hasta el lecho vascular o al líquido cefalorraquídeo

Efecto del sulfonato de perfluorooctano PFOS en las uniones comunicantes de los COCs porcinos durante la maduración in vitro (MIV)

El PFOS es un compuesto perfluorado ampliamente utilizado como surfactante ya que sus propiedades fisicoquímicas lo hacen resistente al calor y repelente al agua, al aceite y a la tinción. Sin embargo, debido a su presencia en sangre y órganos internos de organismos que no han sido expuestos directamente y a su ubicuidad en el ambiente, se le ha asociado con ciertas patologías como el cáncer y la disminución de la fertilidad. Existen estudios en células somáticas que indican que el PFOS, entre otros efectos, inhibe la comunicación intercelular de tipo hendidura, y ya que se han reportado niveles de diferentes PFCs en el líquido folicular humano, el objetivo de este estudio fue determinar si el PFOS tiene un efecto en la comunicación tipo hendidura durante el proceso de maduración del ovocito, utilizando como modelo COCs porcinos. Con el fin de obtener información acerca de los mecanismos moleculares del posible daño de PFOS en las uniones de hendidura, se analizó su efecto en la expresión de las Cx43, CX45 y CX60 durante la maduración de ovocitos de cerdo in vitro. En este estudio, la concentración letal 50 (CL₅₀) para ovocitos fue de 29 µm, y la concentración de efecto en la maduración50 in vitro (CEM₅₀) fue de 23µM, lo que indica que la población ocupacionalmente expuesta a PFOS está en riesgo ya que estas concentraciones son muy similares a las encontradas en el plasma sanguíneo de esta población. Cuando los COCs fueron madurados usando un medio de la concentración de efecto en la maduración₅₀ (CEM₅₀), se observó que el PFOS inhibe las uniones comunicantes y la maduración meiótica del ovocito. En este estudio se observó que el PFOS no altera la expresión de RNAm de las Cx45, Cx43, y CX60 lo que aparentemente indica que el PFOS no afecta a nivel genómico. Estos hallazgos indican la necesidad de comprobar los mecanismos mediante los que PFOS inhibe la maduración meiótica, sin olvidar el estudio de las modificaciones post-traduccionales de las conexinas ya que estas son cruciales en la señalización para iniciar el proceso de maduración nuclear.Perfluorooctane sulfonate (PFOS) is a persistent and bio-accumulative pollutant ubiquitous in wildlife and humans, which receives many concerns on its fate, transport, distribution, and toxicity. There is a concern about its presence in human blood and internal organs which points toward associations with multiple human health endpoints including fertility. Researches have shown that PFOS inhibits Gap Junction Communications (GJC), and as levels of PFCs are found in human follicular fluid it might have a deleterious effect on fertilization rates. The aim of this study was to determine whether PFOS has an effect on GJC during oocyte maturation using as a model in vitro matured porcine oocytes. In order to get information about the molecular mechanisms of injury by PFOS, its effect on the RNA expression of Cx45, Cx43 and Cx60 was analysed at 4.5h, 8.5h and 44h in oocytes matured in vitro. The Lethal Dose50 (LD50) for oocytes was 29 μM, and the Inhibition of In vitro Maturation50 (IVM50) was 23 μM, thus indicating that the population occupationally exposed to PFOS is at risk since this concentration is very similar to that found in the plasma of plant workers. When COCs were matured at the IVM50, it was observed that PFOS inhibits Oocyte calcein uptake through gap junctions; In addition, the Meiotic Maturation of oocytes was inhibited. However, PFOS did not alter Cx45, Cx43, and Cx60 RNA expression, which apparently indicate that it does not affect at the genomic level. These findings indicate the need to check the interference of PFOS in the meiotic maturation pathways, and also revise the connexin post-translational modifications, since these are crucial in the signalling to start the nuclear maturation process