Automated processing of zebrafish imaging data: a survey

Due to the relative transparency of its embryos and larvae, the zebrafish is an ideal model organism for bioimaging approaches in vertebrates. Novel microscope technologies allow the imaging of developmental processes in unprecedented detail, and they enable the use of complex image-based read-outs for high-throughput/high-content screening. Such applications can easily generate Terabytes of image data, the handling and analysis of which becomes a major bottleneck in extracting the targeted information. Here, we describe the current state of the art in computational image analysis in the zebrafish system. We discuss the challenges encountered when handling high-content image data, especially with regard to data quality, annotation, and storage. We survey methods for preprocessing image data for further analysis, and describe selected examples of automated image analysis, including the tracking of cells during embryogenesis, heartbeat detection, identification of dead embryos, recognition of tissues and anatomical landmarks, and quantification of behavioral patterns of adult fish. We review recent examples for applications using such methods, such as the comprehensive analysis of cell lineages during early development, the generation of a three-dimensional brain atlas of zebrafish larvae, and high-throughput drug screens based on movement patterns. Finally, we identify future challenges for the zebrafish image analysis community, notably those concerning the compatibility of algorithms and data formats for the assembly of modular analysis pipelines

Adult and Developing Zebrafish as Suitable Models for Cardiac Electrophysiology and Pathology in Research and Industry

The electrophysiological behavior of the zebrafish heart is very similar to that of the human heart. In fact, most of the genes that codify the channels and regulatory proteins required for human cardiac function have their orthologs in the zebrafish. The high fecundity, small size, and easy handling make the zebrafish embryos/larvae an interesting candidate to perform whole animal experiments within a plate, offering a reliable and low-cost alternative to replace rodents and larger mammals for the study of cardiac physiology and pathology. The employment of zebrafish embryos/larvae has widened from basic science to industry, being of particular interest for pharmacology studies, since the zebrafish embryo/larva is able to recapitulate a complete and integrated view of cardiac physiology, missed in cell culture. As in the human heart, I-Kr is the dominant repolarizing current and it is functional as early as 48 h post fertilization. Finally, genome editing techniques such as CRISPR/Cas9 facilitate the humanization of zebrafish embryos/larvae. These techniques allow one to replace zebrafish genes by their human orthologs, making humanized zebrafish embryos/larvae the most promising in vitro model, since it allows the recreation of human-organ-like environment, which is especially necessary in cardiac studies due to the implication of dynamic factors, electrical communication, and the paracrine signals in cardiac functionThis work was supported by grants from the Gobierno Vasco PIBA2018-58 and GIC18/150. MH-V was supported by the Government of Extremadura (Grant No. TA18052

Using Zebrafish for Investigating the Molecular Mechanisms of Drug-Induced Cardiotoxicity

Over the last decade, the zebrafish (Danio rerio) has emerged as amodel organismfor cardiovascular research.Zebrafish have several advantages over mammalian models. For instance, the experimental cost of using zebrafish is comparatively low; the embryos are transparent, develop externally, and have high fecundity making them suitable for large-scale genetic screening. More recently, zebrafish embryos have been used for the screening of a variety of toxic agents, particularly for cardiotoxicity testing. Zebrafish has been shown to exhibit physiological responses that are similar to mammals after exposure to medicinal drugs including xenobiotics, hormones, cancer drugs, and also environmental pollutants, including pesticides and heavy metals. In this review, we provided a summary for recent studies that have used zebrafish to investigate themolecularmechanisms of drug-induced cardiotoxicity. More specifically, we focused on the techniques that were exploited by us and others for cardiovascular toxicity assessment and described several microscopic imaging and analysis protocols that are being used for the estimation of a variety of cardiac hemodynamic parameters.Huseyin C. Yalcin is supported by Qatar National Research Fund (QNRF), National Priority Research Program NPRP 10-0123-170222,and Qatar University internal funds,QUUGBRC-2017-3 and QUST-BRC-SPR\2017-1. The publication of this article was partially funded by the Qatar National Library

Zebrafish Models for Development and Disease 2.0

The special issue (Zebrafish Models for Development and Disease 2.0) is a collection of articles highlighting research using the zebrafish (Danio rerio) experimental organism. Research described in this special issue addresses various developmental biology, genetic, biomedical and neuroscience topics that should be of general interest to the biomedical research community

Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish

Der Zebrabärbling hat sich in den letzten Jahrzehnten als ein beliebter und vielversprechender Modellorganismus herausgestellt. Mit seiner Hilfe werden zunehmend die grundlegenden biologischen Funktionsweisen von Wirbeltieren untersucht und anhand der Erkenntnisse neue Therapien und Medikamente für Krankheiten entwickelt. Zusätzlich hat sich die Verhaltensforschung als Gebiet mit hohem Potential für neue Entdeckungen entpuppt, da es hier möglich ist, deutlich feinere Unterscheidungen und Effekte nachzuvollziehen als es bei stark abgegrenzten Endpunkten wie Verformungen oder Toxizität der Fall ist. Im frühen Stadium bis fünf Tage nach Befruchtung zeigen die Embryonen und Larven des Zebrabärblings einige charakteristische Verhaltensweisen, die durch künstliche Stimulation hervorgerufen werden können. Noch in der Eischale bei einem Alter von nur 30 bis 42 Stunden nach der Befruchtung reagieren die Embryonen auf einen Lichtblitz mit erhöhter Bewegung, der sogenannten Photomotor Response. Bei wiederholtem Belichten bleibt diese Reaktion aus, was als ein typisches Verhaltensmuster interpretiert werden kann. Werden die Embryonen jedoch Chemikalien oder Mutationen ausgesetzt, kann sich dieses Muster verändern und es können Rückschlüsse über die Funktionsweise der verursachenden Methoden gewonnen werden. Als zusätzliche Verhaltensweisen lassen sich die beiden Schreckreaktionen auf Vibration und Berührung nutzen. Bereits in der Eischale lassen sich die Embryonen durch Berührung zum Bewegen bringen. Sobald sie in einem Alter von ca. drei Tagen nach Befruchtung geschlüpft sind, wird die Reaktion als C-Krümmung bezeichnet, da die Larve eine charakteristische Biegung entlang ihrer Körperachse einnimmt bevor sie davonschwimmt. Dasselbe gilt für die Vibrationsreaktion ab einem Alter von ca. fünf Tagen nach Befruchtung. Um diese Verhalten sinnvoll nutzen zu können sind automatisierte Lösungen notwendig, die die Vorbereitung, die Abläufe und die Analyse soweit vereinfachen, dass kaum noch menschliches Eingreifen notwendig ist. Nur so kann der notwendige Durchsatz und die Reproduzierbarkeit gewährleistet werden um statistisch aussagekräftige Effekte nachzuweisen. Aus diesem Grund wurden drei unabhängige mechatronische Systeme entwickelt, die je eines der drei genannten Verhaltensmuster automatisiert auslösen, aufzeichnen und analysieren können. Dazu waren neben der Hard- und Softwareentwicklung auch biologische Vorgehensweisen notwendig um die Systeme zu validieren und sie bereits in ersten biologischen Untersuchungen einzusetzen. Für das PMR System wurde ein hochautomatisierter Versuchsablauf entwickelt, der anhand eines Roboters die Embryonen zur Vorbereitung sortiert und anschließend in einem automatisierten Mikroskop mit vollständig eigenentwickelter Steuerungssoftware die Aufzeichnung der Reaktion gewährleistet. Anschließend können die Rohdaten in Form von Videos automatisiert analysiert werden um numerische Daten aus den Bildreihen zu extrahieren. Das Vibrationssystem umfasst einen neuentwickelten Vibrationserreger in Form eines modifizierten Lautsprechers, der es erlaubt, mehrere Proben parallel zu untersuchen. Dazu wurde der Erreger ausgiebig charakterisiert um zu gewährleisten, dass die erzielten Beschleunigungswerte sowie die Impulsdauer und Frequenz den angestrebten Werten von 14 g, 1 ms und 500 Hz entsprechen. Durch den Einsatz von Beschleunigungssensoren wurden die Erreger kalibriert und die Steuerungssoftware an die Ergebnisse so angepasst, dass ein einheitlicher Effekt zwischen den Erregern gewährleistet ist. Die Implementierung einer Hochgeschwindigkeitskamera erlaubt die Aufzeichnung der Reaktion bei bis zu 1000 Bildern pro Sekunde, was aufgrund der äußerst schnellen Reaktionszeit der Larven im Millisekundenbereich notwendig ist um den vollen Umfang der Reaktion abzubilden. Um Hochdurchsatzversuche zur Berührung der Larven zu ermöglichen, wurde das erste automatisierte System entwickelt, welches durch den Einsatz einer motorisiert positionierbaren Nadel einen computergesteuerten Berührungsvorgang ermöglicht. Ein berührungsempfindliches Mehrachsensystem wurde so konstruiert, dass der Nutzer über eine grafische Oberfläche das System fernsteuern kann und so die subjektiven und unnötig langwierigen Aspekte von manuellen Versuchsaufbauten umgangen werden können. Das System wurde mit einer digitalen Objekterkennung so erweitert, dass auch autonome Versuche möglich wurden. Die Systeme wurden im Rahmen von mehreren biologischen Untersuchungen am ITG ausgiebig getestet. Mit Hilfe des PMR Systems wurde eine mehrere hundert Proben umfassende Sammlung von Cannabinoid-ähnlichen Substanzen auf ihre neuroaktive Wirkung untersucht. So konnten charakteristische Reaktionsmuster identifiziert werden, die nun dabei helfen können, das Verständnis über die Struktur- und Wirkungszusammenhänge zu erhöhen. An den beiden Schreckreaktionen konnte die unterschiedliche Wirkung von Anästhetika auf Phänokopien von genetisch veränderten Zebrabärblingen nachgewiesen werden, was die Einsatzfähigkeit für chemische sowie genetische Versuche substantiiert

Impact of Digital Video Analytics on Accuracy of Chemobehavioural Phenotyping in Aquatic Toxicology

[Abstract] Chemobehavioural phenotypic analysis using small aquatic model organisms is becoming an important toolbox in aquatic ecotoxicology and neuroactive drug discovery. The analysis of the organisms’ behavior is usually performed by combining digital video recording with animal tracking software. This software detects the organisms in the video frames, and reconstructs their movement trajectory using image processing algorithms. In this work we investigated the impact of video file characteristics, video optimization techniques and differences in animal tracking algorithms on the accuracy of quantitative neurobehavioural endpoints. We employed larval stages of a free-swimming euryhaline crustacean Artemia franciscana,commonly used for marine ecotoxicity testing, as a proxy modelto assess the effects of video analytics on quantitative behavioural parameters. We evaluated parameters such as data processing speed, tracking precision, capability to perform high-throughput batch processing of video files. Using a model toxicant the software algorithms were also finally benchmarked against one another. Our data indicates that variability in video file parameters; such as resolution, frame rate, file containers types, codecs and compression levels, can be a source of experimental biases in behavioural analysis. Similarly, the variability in data outputs between different tracking algorithms should be taken into account when designing standardized behavioral experiments and conducting chemobehavioural phenotyping

High-speed optical mapping of heart and brain voltage activities in zebrafish larvae exposed to environmental contaminants

Data availability: Data will be made available on request.Supplementary data are available online at https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235218642300192X?via%3Dihub#appSB .Copyright © 2023 The Author(s). Environmental contaminants represent a poorly understood ecotoxicological and health risk. Here, we advanced a high-speed optical mapping (OM) technique to non-invasively track voltage dynamics in living zebrafish larvae’s heart and brain and investigate the effects of selected pesticides. OM allowed high resolution ( 17x) and fast acquisition (100 to 200 frames/s) of the voltage signal generated in the heart and brain after immersion of the zebrafish larvae in a voltage-sensitive dye. First, we used varying temperatures (20 °C to 25 °C) to test the adequacy of OM in capturing cardiac and brain voltage changes. Then, we tested the effects of glyphosate or a selected pesticide cocktail (2 to 120 h post-fertilization), accounting for their environmental thresholds and mimicking high-level exposure. Glyphosate (0.1 and 1000 g/L) and the pesticide cocktail (0.1 and 10 g/L) did not alter cardiac activity, except for a trend increase in heart rate variability at high glyphosate dose. Fourier transform (FT) analyses indicated that glyphosate reduced the abundance of low-amplitude voltage activities in the brain at the target low-frequency range of 0.2–15 Hz. The anatomical fragmentation of the brain into four regions, right and left diencephalon (RD and LD) and right and left optic tectum (ROT and LOT), confirmed the impact of glyphosate on the larvae brain and revealed a specific adaptation to the pesticide cocktail in the RD and ROT regions. In summary, OM captured heart and brain voltage changes in zebrafish larvae, with discrete patterns of brain depolarization in the presence of specific water contaminants. Here we discuss the relevance of these findings to ecotoxicology and exposome research.This work was supported by ANR-Hepatobrain and Epidimicmac ANSES to NM, and “Soutien à la Recherche 2021” of the University of Montpellier and Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, France: Espoir en tête 2022/23 to AGT. Partially funded by OptoFish ANSES, ANR-EpiCatcher, ANR/Era-Net Neu-Vasc to NM and the Fondation pour la Recherche Médicale, France (FRM, grant DPC2017 to M.E.M)